Oraingoa†Uneko helbidea: OX11 0DE, Erresuma Batua, Diamond Building, Harwell Science and Innovation Park, Dietcote, Oxfordshire, Erresuma Batua, Diamond Light Source Co., Ltd., Electronic Biological Imaging Center.
Erreakzio-zentroko argi-bilketa konplexua 1 (RC-LH1) bakterio fototrofo moreen osagai fotosintetiko nagusia da. Rhodopseudomonas palustris-eko RC-LH1 konplexuaren bi krio-mikroskopia elektronikoko egitura aurkeztu genituen. RC-LH114-W konplexuaren 2,65 Å-ko bereizmeneko egiturak RC inguratzen duten 14 azpiunitateko LH1 begizta ditu, eta hau W proteinak eteten du, W proteinarik gabeko konplexua, berriz, RC konposizioan guztiz inguratuta dago. 16 azpiunitateko LH1 begizta itxia. Egitura hauen konparaketak RC-LH1 konplexuan kinonaren dinamikari buruzko informazioa ematen du, kinona RC QB gunean lotzean lehenago zehaztu gabeko konformazio-aldaketak barne, baita kinona lotura-gune laguntzaileen kokapena ere, RCra pasatzen laguntzen dutenak. W proteinen egitura bereziak LH1 begiztaren itxiera eragozten du, eta horrela kinona/kinolona trukea bizkortzeko kanal bat sortzen du.
Fotosintesiak ematen duen energiak Lurreko ia bizitza guztia mantendu dezake, eta potentzial handia du eguzki-bioteknologiarako. Fotosintesi globala sustatzen duten bitartean, bakterio fototrofo moreek energia-modu eta gaitasun metaboliko desberdinak ere erakusten dituzte. Fotosintesia saihestu eta bakterio heterotrofo gisa haz daitezke iluntasunean, nitrogenoa eta karbono dioxidoa finkatu, hidrogenoa sortu eta konposatu aromatikoak degradatu ditzakete (1-3). Prozesu horietarako energia emateko, argia azkar eta eraginkortasunez energia kimiko bihurtu behar da. Prozesu hau hasten da argia harrapatzen duen antena konplexuak argia xurgatzen duenean eta harrapatutako energia erreakzio-zentrora (RC) transferitzen duenean, horrela karga-bereizketa hasiz (4-7). Bakterio fototrofo moreen fotosintesiaren oinarrizko unitatea 2. motako RC-z osatuta dago, argia biltzeko 1. konplexuak (LH1) inguratuta, RC-LH1 nukleo-konplexua osatuz. LH1 αβ heterodimero kurbatuen multzo batek osatzen du, eta bakoitzak bi klorofila bakteriano (BChl) a molekula eta karotenoide bat edo bi lotzen ditu (8-12). LH1 antena sinpleenak 16 edo 17 αβ heterodimero ditu, RC (9-13) inguratzen dutenak begizta itxi batean, baina beste nukleo-konplexu batzuetan, mintz-transmembranoko peptidoek inguruko LH1aren jarraitutasuna eteten dute, eta horrela, kinol/kinona difusioa sustatuz RC eta zitokromo bc1 konplexuaren artean (11, 13-15). Rhodopseudomonas (Rps.) landare fototrofo morea fotosintesia laguntzen duen energia eta elektroi transferentzia uler dezakeen organismo eredugarria da. Rps-ren lehen kristal-egitura. palustris RC-LH1 konplexuaren eredua RC da, 15 LH1 begizta heterodimerikoz inguratua, "W Proteina" izeneko proteina ezezagun batek eteten dituena (14). W proteina ondoren RPA4402 gisa identifikatu zen, hau da, 10,5 kDa-ko proteina ezezaguna, hiru helize transmembrano (TMH) aurreikusita dituena (16). rpa4402 geneari W proteina kodetzen dion genea pufW izendatzea proposatzen dugu, RC-L, M (pufL, pufM) eta LH1α, β (pufA, pufB) azpiunitateak kodetzen dituzten geneentzat erabiltzen den nomenklaturarekin koherentea izateko. Interesgarria da, W proteina RC-LH1-ren % 10ean baino ez dagoela, eta horrek agerian uzten du Rps. palustris-ek bi RC-LH1 konplexu desberdin sortzen dituela. Hemen, bi konplexu nagusiren krio-EM (krio-EM) egitura bereizmen handikoak aurkezten ditugu, bata W proteina eta 14 αβ heterodimero dituena, bestea W proteinarik gabe eta 16 Heterodimeroko LH1 begizta itxi batekin. Gure egiturak aldaketa handia dakar Rps. palustris-en RC-LH1 konplexuaren ulermenean, aldaera bakoitzaren populazio homogeneoa aztertu dugulako eta bereizmen nahikoa dugulako peptido bakoitza eta lotutako pigmentuak eta erlazionatutako lipidoak eta kinonak argi eta garbi esleitzeko. Egitura hauen konparaketak erakusten du orain arte beste RC-LH1 konplexutan aurkitu ez diren hiru TMH proteina-W-ek kinona kanal bat sortzen dutela kinona/kinonona trukea bizkortzeko. Lipido eta kinona lotura-gune kontserbatuak identifikatu dira, eta kinona eta RC konbinazioaren ondoren aldaketa konformazional berri bat agerian utzi dugu, organismo fototrofo oxigenatuen fotosistema II (PSII) RCrako egokia izan daitekeena. Gure aurkikuntzek ikuspegi berriak eskaintzen dituzte bakterio fototrofo moreen RC-LH1 nukleo konplexuan kinona/kinonona lotura eta trukearen zinetikari buruz.
Rps. palustris-en aurkitutako bi konplexuen azterketa zehatza errazteko, RC-LH1 bakoitza metodo biokimikoen bidez isolatzen dugu. W proteina gabezia duen konplexua (aurrerantzean ΔpufW) pufW genea ez zuen anduitik purifikatu zen (16), eta RC-LH1 konplexu bakarra ekoiztu daiteke. W proteina duen konplexua andui batek ekoizten du. Andui honetako W proteina 10x His etiketa batekin aldatzen da bere C-muturrean, W proteina duen konplexua W proteina gehienekin eraginkortasunez konbinatu ahal izateko metala immobilizatuz. Konplexua eraginkortasunez bereizten da (16) Afinitate Kromatografia (IMAC).
1. irudian erakusten den bezala, bi konplexuek hiru azpiunitateko RC bat dute (RC-L, RC-M eta RC-H), LH1 antena batez inguratuta. W proteinarik gabeko konplexuaren 2,80-A egiturak 16 αβ heterodimero erakusten ditu, RC guztiz inguratzen duen LH1 begizta itxi bat osatuz, hemendik aurrera RC-LH116 konplexua izendatuko dena. W proteina duen konplexuaren 2,65 Å egiturak W proteinak eten duen 14 heterodimeroko LH1 bat du, hemendik aurrera RC-LH114-W izendatuko dena.
(A eta B) Konposatuaren gainazaleko irudikapena. (C eta D) Lotura-pigmentuak hagatxoetan adierazita. (E eta F) Zitoplasmaren gainazaletik behatutako konplexuek peptidoak eta LH1 azpiunitateak marrazki bizidunetan irudikatuta dituzte, eta proteina-W hutsunetik erlojuaren orratzen noranzkoan zenbakituta daude [Rba zenbakikuntzarekin bat etorriz. sphaeroides konplexua (13)]. LH1-α-rentzat, proteina azpiunitatearen kolorea horia da; LH1-β-rentzat, proteina azpiunitatearen kolorea urdina da; proteina-W-rentzat, proteina gorria da; RC-H-rentzat, ziana da; RC-L-rentzat, laranja da; RC-M-rentzat, magenta. Kofaktoreak hagatxoekin irudikatzen dira, berdeak BChl eta BPh a molekulak adierazten ditu, moreak karotenoideak eta horiak UQ10 molekulak. (G eta H) Proteina-W hutsunearen ikuspegi handitua RC-LH114-W konplexuaren (G) eta RC-LH116 konplexuaren (H) eskualde baliokidean. Kofaktoreak espazio-betegarri moduan agertzen dira, kinona kelatua urdinez. Proteina-W hutsunea (G) lerro urdin eten batez nabarmenduta dago, eta kinona/kinolola LH116 eraztunean barreiatzen den zulo txikiak lerro beltz eten batez nabarmenduta daude (H)n.
1. irudiak (A eta B) RC erakusten du LH1αβ heterodimeroen sare ireki edo itxiz inguratuta, eta bakoitzak bi BChl eta karotenoide bat lotzen ditu (1. irudia, C eta D). Aurreko ikerketek erakutsi dute Rps LH1 konplexua dela. Espirulina xantinaren biosintesi bidean, espezie hauek karotenoideen populazio mistoak dituzte (17). Hala ere, espiropirroxantina da karotenoide nagusia eta bere dentsitatea egokia da. Hori dela eta, espiroxantina LH1 lotura gune guztietan modelatzea erabaki genuen. Alfa eta beta polipeptidoak TMH bakarrak dira, mintz kanpoko eskualde laburrekin (1. irudia, A, B, E eta F). C-muturreko 17 hondarren dentsitatea ez zen ikusi arren, alfa polipeptidoa Met1etik Ala46ra moztu zen bi konplexuetan. β polipeptidoa Gly4tik Tyr52ra murriztu zen RC-LH116-n, eta Ser5etik Tyr52ra RC-LH114-W-n. Ez zen 3 edo 4 N-terminal edo 13 C-terminal hondarren dentsitaterik ikusi (S1 irudia). Basati-motako anduitik prestatutako RC-LH1 konplexu mistoaren masa-espektrometria bidezko analisiak erakutsi zuen falta zen eskualdea peptido hauen heterologo ebakiduraren emaitza zela (S1 eta S2 irudiak). α-Met1-en N-terminal formilazioa ere ikusi zen (f). Analisiak erakutsi zuen α-peptidoa fMet1etik Asp42/Ala46/Ala47/Ala50 hondarrez osatuta dagoela, eta β-peptidoa Ser2tik Ala53ra bitarteko hondarrez osatuta dagoela, eta hori bat dator tenperatura baxuko EM dentsitate-maparekin.
α-His29 eta β-His36-ren koordinazioak BChl-ak aurrez aurre jartzen ditu; αβ heterodimero bakoitza bere bizilagunekin elkartzen da begizta ireki bat (RC-LH114-W) edo begizta itxi bat (RC-LH116) osatzeko RC-ren inguruan. Pigmentu-multzo exiton akoplatuaren inguruan (1. irudia, C eta D). RC-LH114-W-ren 877 nm-ko bandarekin alderatuta, RC-LH116-ren 880 nm-ko xurgapen-desplazamendu gorria 3 nm-koa da (2A irudia). Hala ere, dikroismo zirkularraren espektroa ia berdina da (2B irudia), eta horrek adierazten du begizta irekien eta itxien artean aldea argia bada ere, BChl-en ingurune lokala oso antzekoa dela. Xurgapen-desplazamendu gorria mugimendu termiko murriztuaren eta begizta itxian egonkortasun handiagoaren ondorioa izan daiteke (18, 19), begizta itxiak eragindako pigmentu-akoplamenduan izandako aldaketaren ondorioa (20, 21), edo bi efektu hauen konbinazio baten ondorioa (11).
(A) Ultramore/ikusgai/infragorri hurbileko xurgapen-espektroa, zeinen gailurrak dagokien pigmentuekin markatuta dauden eta 775 nm-tan BPh gailurrera normalizatuta dauden. (B) Dikroismo zirkular-espektroa, 805 nm-tan BChl xurgapenera normalizatua. (C eta D) RC-LH114-W konplexuaren (C) eta RC-LH116 konplexuaren (D) denboran ebatzitako xurgapen-espektroetatik hautatutako ΔA espektroak. Konparagarritasun hobea lortzeko, espektro guztiak 0,2 ps-tan −A-ren ∆A-ra normalizatu dira. (E) Zitokromo c2 oxidazioaren tasa, UQ2-ren kontzentrazio desberdinen aurrean irradiazioaren ondoren (ikus S8 irudia datu gordinak ikusteko). (F) Intentsitate baxuko, ertaineko edo handiko argipean hazitako zeluletan (10, 30 edo 300μMm-2 s-1, hurrenez hurren), W proteina eta RC-L azpiunitateak konplexu purifikatuan eta mintz-erlazio bereizia. Zehaztu proteina maila SDS-poliakrilamida gel elektroforesi eta immunoanalisi bidez (ikus S9 irudia datu gordinak ikusteko). Zehaztu RC-LH114-W konplexu purifikatuarekiko erlazioa. Konplexuaren RC-L eta proteina-W arteko erlazio estekiometrikoa 1:1 da.
RC-LH114-W-ren αβ14 begizta deformatuan 1. posizioan dauden BChl-ak (1. irudia, A, C eta E) RC emaile nagusitik (P) 6,8 Å-ra hurbilago daude RC-LH116-ko BChl baliokideak baino (1. irudia, B, D eta F, eta S3 irudia); hala ere, bi konplexuen xurgapen-zinetika iragankorrak erakusten du RC-LH114-W eta RC-LH116-rentzat, LH1-etik RC-rako kitzikapen-energiaren transferentzia-denbora-konstanteak 40 ±4 eta 44 ±3 ps direla (2. irudia). , C eta D, S4 irudia eta S2 taula). Ez dago RC barruko transferentzia elektronikoan ere desberdintasun esanguratsurik (S5 irudia eta erlazionatutako testu osagarria). Susmoa dugu LH1 eta RC-P arteko energia-transferentzia-denboraren korrespondentzia estua bi LH1 begiztetako BChl gehienen distantzia, angelu eta energia potentzial antzekoengatik dela. Badirudi LH1 energia-eredua aztertzea distantzia minimora iristeko ez dela gune ez-optimoetatik RCrako energia-transferentzia zuzena baino azkarragoa. RC-LH114-W-ko LH1 begizta irekiak mugimendu termiko hutsala izan dezake tenperatura baxuko baldintzetan analisi estrukturalerako, eta αβ14 eraztun-konformazio luzeagoa dago giro-tenperaturan RC 1 posizioan βBChls-en pigmentazio-distantziatik abiatuta.
RC-LH116 konplexuak 32 BChl eta 16 karotenoide ditu, eta bere antolamendu orokorra Thermochromatium (Tch.) pidpidum-etik lortutakoaren berdina da [Protein Data Bank (PDB) ID 5Y5S] (9), Thiorhodovibrio (Trv.) 970 anduia (PDB ID 7C9R) (12) eta alga berdeetatik (Blc.viridis) (PDB ID 6ET5) (10). Lerrokatu ondoren, αβ heterodimeroen posizioetan desbideratze txikiak baino ez ziren ikusi, batez ere 1-5, 15 eta 16 (S6 irudia). W proteinaren presentziak eragin nabarmena du LH1-en egituran. Bere hiru TMHak begizta laburrez lotuta daude, N-muturra konplexuaren lumen aldean eta C-muturra zitoplasmatiko aldean (1A eta 3 irudiak, A-tik D-ra). Proteina-W neurri handi batean hidrofoboa da (3B irudia), eta TMH2 eta TMH3 LH1αβ-14rekin elkarreragiten dute gainazal transmembranario bat osatzeko (3. irudia, B eta E-tik G-ra). Interfazea batez ere Phe, Leu eta Val hondarrez osatuta dago eskualde transmembranarioan. Hondar hauek aminoazido hidrofoboekin eta αβ-14 pigmentuekin pilatuta daude. Hondar polar batzuek ere laguntzen dute elkarrekintzan, besteak beste, W-Thr68 eta β-Trp42 arteko hidrogeno lotura barrunbe konplexuaren gainazalean (3. irudia, F eta G). Zitoplasmaren gainazalean, Gln34 αβ-14 karotenoideen keto taldearen ondoan dago. Horrez gain, n-dodezil β-d-maltosido (β-DDM) molekula bereizi egin zen, eta bere isats hidrofoboa proteina-W eta αβ-14 arteko interfazeraino luzatu zen, eta lipido isatsa gorputzean egon daiteke. Ohartu ginen, halaber, W proteina eta RCH proteinaren C-muturreko bereizmen eskualdeak oso gertu daudela, baina ez direla elkarreragin espezifikoak eratzeko esparruan (1. irudia, A eta E). Hala ere, bi proteina hauen C-muturreko aminoazido konpondu gabeetan elkarreraginak egon daitezke, eta horrek W proteina erakartzeko mekanismo bat eman dezake RC-LH114-W konplexuaren muntaian.
(A) Proteina-W, marrazki bizidunen moduan LH1αβ14-rekin interfazeari begira dagoena, alboko kate hagaxka itxurakoa du (gorria), potentzial elektrostatikoaren diagramaren zati batean erakusten dena (0,13ko kurba-maila duen gainazal gris gardena). (B) Proteina-W gainazal hidrofobo koloretsu batez irudikatuta. Eremu polarrak eta kargatuak zian kolorez erakusten dira, eremu hidrofoboak zuriz eta eremu oso hidrofoboak laranjaz. (C eta D) Proteina-W marrazki bizidunetan irudikatuta, bere orientazioa (A) (C)-n bezalakoa da, eta 180° biratuta (D). Sekuentzian duen posizioaren arabera, hondakin bereizgarriek ortzadarraren kolore-eskema hartzen dute, non N-muturra urdina den eta C-muturra gorria. (E) Proteina-W (A)-n bezalako ikuspegian, eta proteina-W:LH1 interfazeko hondakinak marka erantsiak dituzten hagaxkekin irudikatzen dira. (F) W proteina 90° biratuta dago marrazki bizidunen irudikapenean (E) eta LH1αβ14-rekiko, eta barra-irudikapenean interfazearen hondarrekiko. Beta polipeptidoaren gainjarritako hondarrak etiketatuta daude. Kofaktorea 1. irudiko kolorearekin bat datorren barra gisa erakusten da, deskonposatutako β-DDM grisez erakusten da eta oxigenoa gorriz. (G) (F) ikuspegia 180° biratuta dago, etiketatutako alfa polipeptidoaren hondar nabarmenekin.
W proteinak αβ heterodimero bat ordezkatzen du (1F irudiko 15.a), horrela begizta ixtea eta lehenengo hiru αβ heterodimeroak okertzea eragotziz. Ikusi zen lehenengo αβ-1 heterodimeroaren inklinazio angelu maximoa filmaren normalarekiko 25° eta 29° artekoa zela (1. irudia, A eta E), eta hau αβ-1-aren 2° eta 8° arteko inklinazioak sortu zuen RC A kontraste zorrotzeko LH116-n (1. irudia, B eta F). Bigarren eta hirugarren heterodimeroak 12° eta 22° eta 5° eta 10° artean inklinatuta daude, hurrenez hurren. RC-ren oztopo esterikoaren ondorioz, αβ-1-aren inklinazioak ez du αβ-ren bigarren bikotea barne hartzen (1F irudiko 16. αβ-ri dagokiona), eta horrela hutsune garbi bat sortuz LH1 eraztunean (1. irudia, A eta E). Bi αβ heterodimero falta direla eta, lau BChl eta bi karotenoide galtzearekin batera, karotenoideetako bat ere ez da αβ-1 azpiunitate bihurrituari lotzen, eta horren ondorioz, 13 karotenoide begetariano eta 28 BChl dituen LH114-W eraztun bat sortzen da. αβ1etik 7ra bitarteko eskualdeetako bi konplexuen bereizmen lokalaren estimazioak LH1 begiztaren gainerakoenak baino txikiagoak dira, eta horrek RC QB gunearen ondoan dagoen LH1 azpiunitatearen berezko plastizitatea islatu dezake (4. irudia).
RC-LH114-W (A eta B) eta RC-LH116 (C eta D) irudiak 1. irudiko goiko/alboko ikuspegi beretik (A eta B) (A eta C) eta barrunbearen gainazaletik (B eta D) erakusten dira. Koloretako teklak eskuinean ageri dira.
1:14ko estekiometria-erlazioa duen beste nukleo-konplexu bereizgarri bakarra Rhodococcus sphaeroides (Rba.) RC-LH1-PufX dimeroa da (13). Hala ere, W proteinak eta PufX-ek ez dute homologia nabarmenik, eta eragin nabarmena dute dagokien LH1 egituretan. PufX TMH bakarra da, N-terminal zitoplasma-domeinu bat duena, RC-H azpiunitatearen (13) alde zitoplasmatikoarekin elkarreragiten duena, Rps. palustris LH116αβ-16-ri dagokion posizioan. PufX-ek kinona/kinolona trukerako kanal bat sortzen du RC-LH1 eta zitokromo bcl konplexuaren artean, eta Rba. sphaeroides nukleo-konplexu guztietan dago (13). Monomero-monomero interfazea Rba-n dagoen arren. RC-LH1-PufX sphaeroides dimeroa RC-LH114-W-ko W proteinaren lotura-posizioan dago, eta PufX-ek eta W proteinak eragindako hutsunea posizio baliokidean dago (S7A irudia). RC-LH114-W-ko hutsunea Pseudomonas rosea LH1-en kinona kanal hipotetikoarekin (8) ere lerrokatuta dago, W proteinarekin edo PufX-ekin erlazionatuta ez dauden peptidoek osatzen dutena (S7B irudia). Horrez gain, Blc-ko kinona kanala. γ azpiunitate bat (7) baztertuz sortutako esmeralda berdeko LH1 antzeko posizio batean dago (S7C irudia). Proteina desberdinek bitartekatu arren, kinona/kinolol kanal hauek RC-LH1 konplexuan posizio komun batean agertzea eboluzio konbergentearen adibide bat dirudi, eta horrek adierazten du W proteinak sortutako hutsunea kinona kanal gisa joka dezakeela.
LH114-W begiztako hutsuneak mintz-eskualde jarraitu bat eratzea ahalbidetzen du RC-LH114-W konplexuaren barne-espazioaren eta mintz osoaren artean (1G irudia), bi domeinuak proteina-poro baten bidez lotu beharrean, proteinetan bezala. RC-LH116 konplexua Tch. orratz itxurako konplexu itxi baten antzekoa da (22) (1H irudia). Kinonaren difusioa mintzean zehar proteina-kanal estuaren bidezko difusioa baino azkarragoa denez, LH114-W begizta irekiak RCren birsorkuntza azkarragoa ahalbidetu dezake LH116 begizta itxiak baino, eta kinonaren difusioa RCn mugatuagoa izan daiteke. W proteinak RCren bidezko kinonen bihurketan eragiten duen ala ez probatzeko, zitokromoaren oxidazio-analisi bat egin genuen ubikinona 2 (UQ2) kontzentrazio jakin batean (isopreno-buztan laburragoa duen UQ10 naturalaren analogoa) (2E irudia). Kinona kelatuen presentziak Michaelis konstante agerikoaren zehaztasuna oztopatzen badu ere (RC-LH114-W eta RC-LH116 egokiak dira 0,2 ± 0,1 μM eta 0,5 ± 0,2 μM-rako, hurrenez hurren), RC-LH114-W-ren gehienezko tasa (4,6 ± 0,2 e-RC-1 s-1) RC-LH116-rena (3,6 ± 0,1 e-RC-1 s-1) baino % 28 ± 5 handiagoa da.
Hasieran kalkulatu genuen proteina-W nukleo-konplexuaren % 10ean dagoela (16); hemen, argi gutxiko, argi ertaineko eta argi handiko hazkuntza-zelulen okupazio-tasak % 15 ± 0,6, % 11 ± 1 eta % 0,9 ± 0,5 dira, hurrenez hurren (2F irudia). Masa-espektrometriaren konparaketa kuantitatiboak erakutsi zuen histidina-etiketa gehitzeak ez zuela proteina-W-ren ugaritasun erlatiboa murriztu andui basatiekin alderatuta (P = 0,59), beraz, maila hauek ez dira proteina-W aldatuaren ondorio bat (S10 irudia). Hala ere, RC-LH1 konplexuan proteina-W-ren okupazio baxu honek RC batzuk abiadura bizkortuan iraultzea ahalbidetu dezake, eta horrela RC-LH116 konplexuan kinona/kinolona truke motelagoa arindu. Ohartu ginen argiaren okupazio-tasa altua ez datorrela bat transkriptomikako datu berriekin, eta horrek adierazten du pufW genearen adierazpena handitzen dela argi biziaren pean (S11 irudia) (23). pufW transkripzioaren eta RC-LH1 konplexuan proteina-W txertatzearen arteko aldea nahasgarria da eta proteinaren erregulazio konplexua islatu dezake.
RC-LH114-W-n, 6 kardiolipina (CDL), 7 fosfatidilkolina (POPC), 1 fosfatidilglizerol (POPG) eta 29 β-DDM molekula esleitu eta modelatu dira bertan: 6 CDL, 24 POPC, 2 POPG eta 12 βDDM. RC-LH116 (5. irudia, A eta B). Bi egitura hauetan, CDL ia konplexuaren alde zitoplasmatikoan dago kokatuta, POPC, POPG eta β-DDM gehienbat alde luminalean kokatuta dauden bitartean. Bi lipido eta detergente molekula isolatu ziren RC-LH114-W konplexuaren αβ-1etik αβ-6rako eskualdean (5A irudia), eta bost isolatu ziren RC-LH116-ren eskualde baliokidean (5B irudia). Lipido gehiago aurkitu ziren konplexuaren beste aldean, batez ere CDL, RC eta αβ-7tik αβ-13ra artean metatuta (5. irudia, A eta B). Beste lipido eta detergente estrukturalki bereizi batzuk LH1 eraztunaren kanpoaldean daude, eta azil kate ondo bereiziak LH1 azpiunitateen artean hedatzen dira, behin-behinean β-DDM gisa izendatuak RC-LH114-W-n, eta β-DDM gisa definituak RC-n. β-DDM eta POPC-LH116 nahasketa bat. Gure egituran lipido eta detergente kelatzaileen posizio antzekoek adierazten dute lotura-gune fisiologikoki garrantzitsuak direla (S12A irudia). Tch-ko molekula baliokideen posizioek ere koherentzia ona dute. Gentle and Trv. 970 RC-LH1 anduiak (S12 irudia, B-tik E-ra) (9, 12) eta lipidoen buru taldearen hidrogeno-lotura hondakinek kontserbazio nahiko ona erakutsi zuten sekuentzia-lerrokatzean (S13 irudia), eta horrek adierazten du RC-ri lotzen zaion CDL kontserbatua (24), gune hauek RC-LH1 konplexuan kontserba daitezkeela.
(A eta B) RC-LH114-W (A) eta RC-LH116 (B) peptidoak marrazki bizidunen bidez irudikatzen dira, eta pigmentuak, berriz, hagatxoen bidez, 1. irudiko kolore-eskema erabiliz. Lipidoak gorriz ageri dira, eta detergenteak grisez. RC QA eta QB guneei lotutako UQ horia da, eta isolatutako UQ, berriz, urdina. (C eta D) (A) eta (B) bezalako ikuspegi berdinak, lipidoak kenduta. (E-tik G-ra) RC-LH116-ko Q1(E), Q2(F) eta Q3(G)-ren ikuspegi handitua, elkarri eragiten dioten albo-kateekin. Hidrogeno-loturak lerro beltz eten gisa ageri dira.
RC-LH116-n, bai RC QA bai QB UQ, karga-bereizketa prozesuan elektroi-transferentzian parte hartzen dutenak, beren lotura-guneetan deskonposatzen dira. Hala ere, RC-LH114-W-n, QB kinona ez da bereizi eta xehetasunez aztertuko da jarraian. QA eta QB kinonez gain, bi UQ molekula kelatu (RC eta LH1 eraztunen artean kokatuta) esleitzen dira RC-LH114-W egituran, ondo bereizitako buru-taldeen arabera (Q1 eta Q2-n kokatuta, hurrenez hurren). espazioa). 5C irudia). Bi isopreno unitate esleitzen zaizkio Q1-i, eta dentsitate-mapak Q2-ren 10 isopreno-buztan osoak ebazten ditu. RC-LH116-ren egituran, hiru UQ10 molekula kelatu (Q1etik Q3ra, 5D irudia) bereizi ziren, eta molekula guztiek dentsitate garbia dute isats osoan (5. irudia, Dtik Gra). Bi egituretan, Q1 eta Q2-ren kinona buru taldeen posizioek koherentzia bikaina dute (S12F irudia), eta RC-rekin bakarrik elkarreragiten dute. Q1 RC-LH114-W-ren W hutsunearen sarreran dago (1G eta 5, C, D eta E irudiak), eta Q2 QB lotura gunearen ondoan dago (5, C, D) eta F irudiak). L-Trp143 eta L-Trp269 hondar kontserbatuak Q1 eta Q2-tik oso gertu daude eta π-pilaketa interakzio potentzialak eskaintzen dituzte (5, E eta F irudia, eta S12 irudia). L-Gln88, Q1-en oxigeno distaletik 3,0 Å-ra, hidrogeno lotura sendoa eskaintzen du (5E irudia); hondar hau RC guztietan kontserbatzen da, harreman urrunenean izan ezik (S13 irudia). L-Ser91 Thr-ren ordez modu kontserbadorean ordezkatzen da beste RC gehienetan (S13 irudia), Q1-en metil oxigenotik 3,8 angstrom-era dago, eta hidrogeno lotura ahulak eman ditzake (5E irudia). Ez dirudi Q3-k interakzio espezifikorik duenik, baina RC-M azpiunitatearen eta LH1-α 5etik 6ra bitarteko azpiunitatearen arteko eskualde hidrofoboan dago (5. irudia, D eta G). Q1, Q2 eta Q3 edo gertuko kinona kelatuek ere bereizi egin dira Tch. Gentle, Trv. Strain 970 eta Blc-n. Iris egiturak (9, 10, 12) kinona lotura-gune laguntzaile kontserbatu bat adierazten du RC-LH1 konplexuan (S12G irudia). RC-LH116-n deskonposatutako bost UQ-ak bat datoz errendimendu handiko likido kromatografia (HPLC) bidez zehaztutako konplexu bakoitzaren 5,8±0,7-rekin, eta RC-LH114-W-n deskonposatutako hiru UQ-ak baino txikiagoak dira. Neurtutako 6,2±0,3 balioak (S14 irudia) adierazten du egituran ebatzi gabeko UQ molekulak daudela.
L eta M polipeptido pseudosimetrikoek bost TMH dituzte bakoitzak eta heterodimero bat osatzen dute, BChl dimero bat, bi BChl monomero, bi bakteriofago (BPh) monomero, eta hemo gabeko burdina bat eta UQ10 molekula bat edo bi konbinatzen dituena. Zetona talde terminalean hidrogeno loturen presentziaren eta Rps-en metatze ezagunaren bidez, karotenoideak M azpiunitatean sartzen dira, eta cis-3,4-deshidroorhodopina deitzen zaio. Espeziea (25). RC-H-ren kanpoko mintzeko domeinua mintzari lotuta dago TMH bakar baten bidez. RC egitura orokorra antzeko espezieen hiru azpiunitateko RC-ren antzekoa da (adibidez, Rba). sphaeroides (PDB ID: 3I4D). BChl eta BPh-ren makrozikloak, karotenoideen bizkarrezurra eta hemo gabeko burdina gainjartzen dira egitura hauen bereizmen-tartean, baita QA gunean dagoen UQ10 buru-taldea eta RC-LH116-n dagoen QB kinona ere (S15 irudia).
Bi RC egituraren erabilgarritasunak, QB guneen okupazio-tasa desberdinekin, aukera berri bat eskaintzen du QB kinonaren loturarekin batera doazen konformazio-aldaketa koherenteak aztertzeko. RC-LH116 konplexuan, QB kinona guztiz lotutako "proximal" posizioan dago (26), baina RC-LH114-W-ren bereizketak ez du QB kinonarik. Ez dago QB kinonarik RC-LH114-W-n, eta hori harrigarria da, konplexua aktiboa baita, QB kinona estrukturalki ebatzia duen RC-LH116 konplexua baino gehiago. Bi LH1 eraztunek sei kinona inguru kelatzen dituzten arren, bost estrukturalki ebatziak daude RC-LH116 eraztun itxian, eta hiru bakarrik daude estrukturalki mugatuak RC-LH114-W eraztun irekian. Egitura-nahasmendu handitu honek RC-LH114-W QB guneen ordezkapen azkarragoa, konplexuko kinonaren zinetika azkarragoa eta LH1 begizta zeharkatzeko probabilitate handiagoa islatu ditzake. RC-LH114-W-ren RC QB gunean UQ falta konplexu konplexuago eta aktiboago baten ondorioa izan daitekeela iradokitzen dugu, eta RC-LH114-W-ren QB gunea berehala izoztu dela UQ birsorkuntzan. Etapa espezifikoak (QB gunerako sarrera itxita egon da) jarduera honen konformazioa islatzen du.
QB gabe, L-Phe217-ren errotazioa UQ10 loturarekin bateraezina den posizio batera gertatzen da, isatsaren lehen isopreno unitatearekin talka espaziala eragingo baitu (6A irudia). Horrez gain, aldaketa konformazional nagusi nabariak nabariak dira, batez ere de helizea (TMH D eta E arteko begiztan helize laburra) non L-Phe217 QB lotura-poltsikora mugitzen den eta L-Tyr223-ren errotazioa (6A irudia) M-Asp45 egiturarekin hidrogeno lotura hausteko eta QB lotura-gunearen sarrera ixteko (6B irudia). De helizeak bere oinarrian biratzen du, L-Ser209-ren Cα 0,33 Å desplazatzen da, eta L-Val221Cα 3,52 Å desplazatzen da. Ez dago aldaketa behagarririk TMH D eta E-n, bi egituretan gainjarri daitezkeenak (6A irudia). Dakigunez, hau da RC naturalean QB gunea ixten duen lehen egitura. Egitura osoarekin (QBri lotutakoarekin) alderatuta, kinona murriztu aurretik, aldaketa konformazional bat behar dela ikusten da kinonan sartzeko. L-Phe217 biratzen da kinona buru taldearekin π-pilaketa interakzio bat osatzeko, eta helizea kanporantz mugitzen da, L-Gly222-ren eskeletoak eta L-Tyr223-ren alboko kateak hidrogeno lotura sare bat osatzea ahalbidetuz, hidrogeno lotura egitura egonkor batekin (6. irudia, A eta C).
(A) Hologramaren (L katea, laranja/M katea, magenta) eta apo (grisa) egituraren gainjarritako marrazki biziduna, non hondar nagusiak hagaxka itxurako irudikapen moduan bistaratzen diren. UQ10 barra hori batez irudikatzen da. Lerro puntuatuak egitura osoan eratutako hidrogeno loturak adierazten ditu. (B eta C) Apolipoproteinaren gainazaleko irudikapena eta eraztun-egitura osoaren irudikapena, L-Phe217-ren alboko kateko oxigenoa urdinez eta L-Tyr223-ren gorriz nabarmenduz, hurrenez hurren. L azpiunitatea laranja da; M eta H azpiunitateak ez daude koloreztatuta. (D eta E) Apolipoproteina (D) eta (E) RC QB gune osoak [(A)-ren arabera koloreztatuta, hurrenez hurren] eta Thermophilus thermophilus PSII (berdea, urdina kinona plastikoarekin; PDB ID: 3WU2) Lerrokatu (58).
Ustekabean, LH1 gabeko QB gabezia duten RC-en hainbat egitura eskuragarri dauden arren, ikerketa honetan behatutako konformazio-aldaketak ez dira lehenago jakinarazi. Horien artean daude Blc. viridis-en (PDB ID: 3PRC) (27), Tch. tepidum-en (PDB ID: 1EYS) (28) eta Rba. sphaeroides-en (PDB ID: 1OGV) (29) QB agortze-egitura, eta horiek guztiak ia berdinak dira haien QB egitura orokorrarekin. 3PRC-ren azterketa zehatzak agerian utzi zuen LDAO (Lauril Dimetil Amina Oxidoa) detergente molekulak QB posizioaren sarreran lotzen direla, eta horrek konformazio itxi batean berrantolatzea eragotzi dezakeela. LDAO ez da 1EYS edo 1OGV-n posizio berean deskonposatzen, baina RC hauek detergente bera erabiliz prestatzen dira eta, beraz, efektu bera sor dezakete. Rba-ren kristal-egitura. Zitokromo c2-rekin ko-kristalizatutako Sphaeroides RC-k (PDB ID: 1L9B) ere QB gune itxia duela dirudi. Hala ere, kasu honetan, RC-M polipeptidoaren N-terminal eskualdeak (QB lotura-gunearekin elkarreraginez Q helizeko Tyr hondarraren H loturaren bidez) konformazio ez-naturala hartzen du, eta QB konformazio-aldaketa ez da gehiago aztertzen (30). Lasaigarria da ez dugula M polipeptidoaren deformazio mota hau ikusi RC-LH114-W egituran, RC-LH116 RC-ren N-terminal eskualdearen ia berdina baita. Kontuan izan behar da, halaber, detergenteetan oinarritutako LH1 antena desagerrarazi ondoren, PDB-ko apolipoproteina RC-ak bereizi egin zirela, eta horrek barneko kinona multzoak eta lipidoak ezabatu zituen RC-ren eta inguruko LH1 eraztunaren barne-azaleraren arteko hutsunean (31, 32). RC funtzionala izaten jarraitzen du kofaktore guztiak mantentzen dituelako, deskonposagarria den QB kinona izan ezik, hau ez baita hain egonkorra eta askotan galtzen baita prestaketa prozesuan zehar (33). Horrez gain, jakina da LH1 eta lipido zikliko naturalak RC-tik kentzeak eragina izan dezakeela funtzioetan, hala nola karga bereizitako P+QB egoeraren iraupena laburtzean (31, 34, 35). Beraz, espekulatzen dugu RC inguratzen duen tokiko LH1 eraztunaren existentziak "itxitako" QB gunea mantendu dezakeela, horrela QB-tik gertuko tokiko ingurunea mantenduz.
Apolipoproteinak (QB kinonarik gabe) eta egitura osoak QB gunearen birsorkuntzaren bi irudi baino ez diren arren, gertaera-segida bat baino, badira adierazpenak lotura mugatu daitekeela hidrokinonak berriro lotzea saihesteko substratuaren inhibizioa inhibitzeko. Kinololaren eta kinonaren arteko elkarrekintza apolipoproteinaren QB gunearen ondoan desberdina izan daiteke, eta horrek RC-k baztertzea dakar. Aspalditik proposatu izan da konformazio-aldaketek zeregina dutela kinonen loturan eta murrizketan. RC izoztuek kinonak murrizteko duten gaitasuna kaltetuta dago iluntasunera egokitu ondoren (36); X izpien kristalografiak erakusten du kalte hau QB kinonak "distal" konformazio batean harrapatuta egoteagatik dela, posizio proximal aktibotik 4,5 Å ingurura (26), 37). Iradokitzen dugu lotura distalaren konformazio hau apolipoproteinaren eta eraztun-egitura osoaren arteko tarteko egoeraren irudi bat dela, kinonarekin hasierako elkarrekintzaren eta QB gunearen irekieraren ondoren datorrena.
Zenbait bakterio fototrofo eta zianobakterio, alga eta landareen PSII konplexuan aurkitzen den II motako RC-ak egitura eta funtzio kontserbazioa du (38). 6. irudian (D eta E) erakusten den egitura-lerrokatzeak PSII RC-en eta bakterioen RC konplexuaren QB gunearen arteko antzekotasuna azpimarratzen du. Konparazio hau aspalditik izan da eredu bat kinonen lotura eta murrizketa sistema estuki erlazionatuak aztertzeko. Aurreko argitalpenek iradoki zuten konformazio-aldaketak kinonen PSII murrizketarekin batera doazela (39, 40). Beraz, RC-ren eboluzio-kontserbazioa kontuan hartuta, lehenago behatu gabeko lotura-mekanismo hau landare fototrofo oxigenatuetan PSII RC-ren QB guneari ere aplika dakioke.
Rps ΔpufW (etiketarik gabeko pufW ezabaketa) eta PufW-His (C-terminal 10x His-etiketadun proteina-W pufW lokus naturaletik adierazita) anduiak. palustris CGA009 aurreko lanean deskribatu zen (16). Andui hauek eta guraso basati isogenikoa izozkailutik berreskuratu ziren zelula kopuru txiki bat PYE batean (bakoitza 5 g litro -1) lerrokatuz (LB-n gordeta -80 °C-tan, % 50 (p/v) glizerol) proteina, legamia-estraktua eta sukzinato) agarra [% 1,5 (p/v)] zituena. Plaka gau osoan inkubatu zen iluntasunean giro-tenperaturan baldintza anaerobioetan, eta ondoren argi zuriarekin (~50 μmolm-2 s-1) argiztatu zen, OSRAM 116-W-ko halogeno-bonbilek (RS Components, Erresuma Batua) emandakoa, 3-5 egunez, kolonia bakarra agertu arte. Kolonia bakarra erabili zen % 0,1eko (w/v) kasaminoazidoekin osatutako 10 ml M22+ medio (41) inokulatzeko (aurrerantzean M22). Kultura oxigeno gutxiko baldintzetan hazi zen iluntasunean 34 °C-tan, 180 rpm-tan astinduz 48 orduz, eta ondoren, 70 ml kultura baldintza berdinetan inokulatu ziren 24 orduz. 1 ml-ko bolumeneko kultura erdi-aerobio bat erabili zen 30 ml M22 medio 30 ml-ko beirazko botila garden unibertsal batean inokulatzeko eta astinduz irradiatu zen (~50 μmolm-2 s-1) 48 orduz indar magnetiko esterilaren bidez. Ondoren, 30 ml kultura litro 1 ingururekin inokulatu ziren baldintza berdinetan, eta ondoren, ~200 μmolm-2 s-1-tan argiztatutako 9 litro inguru kultura inokulatzeko erabili zen 72 orduz. Zelulak 7132 RCF-tan zentrifugatuz bildu ziren 30 minutuz, 20 mM-ko tris-HCl-ko ~10 ml-tan (pH 8.0) berriro eseki ziren eta -20 °C-tan gorde ziren behar izan arte.
Desizoztu ondoren, gehitu desoxirribonukleasa I kristal batzuk (Merck, Erresuma Batua), lisozima (Merck, Erresuma Batua) eta bi Roche holoentzima proteasa inhibitzaile tableta (Merck, Erresuma Batua) berriro esekitako zelulei. 20.000 psi-ko presio-zelula frantses batean (Aminco, AEB), zelulak 8 eta 12 aldiz apurtu ziren. Zelula hautsi gabeak eta hondakin disolbaezinak kendu ondoren 18.500 RCF-tan 15 minutuz zentrifugatuz 4 °C-tan, mintza lisatu pigmentatutik hauspeatu zen 113.000 RCF-tan 2 orduz zentrifugatuz 43.000 °C-tan. Bota frakzio disolbagarria eta bersuspenditu mintz koloreztatua 100-200 ml 20 mM-ko tris-HCl-tan (pH 8.0) eta homogeneizatu agregatu ikusgairik egon arte. Mintz esekia 20 mM tris-HCl-tan (pH 8.0) (Anatrace, AEB) inkubatu zen, % 2 (w/v) β-DDM zuela, ordubetez iluntasunean 4 °C-tan, astiro nahastuz. Ondoren, zentrifugatu 70 °C-tan 150.000 RCF disolbatzeko 4 °C-tan ordubetez, gainerako disolbaezinak kentzeko.
ΔpufW anduiaren disolbatzaile mintza 50 ml-ko DEAE Sepharose ioi truke zutabe batean aplikatu zen, hiru zutabe-bolumen (CV) dituen lotura-bufferraren [20 mM tris-HCl (pH 8.0) % 0.03 (w/v) β-DDM duena]. Garbitu zutabea bi CV lotura-bufferekin, eta ondoren garbitu zutabea 50 mM NaCl duten bi lotura-bufferekin. RC-LH116 konplexua 150 eta 300 mM arteko NaCl-ko gradiente lineal batekin eluitu zen (lotura-bufferrean) 1.75 CV-tan, eta gainerako lotura-konplexua 300 mM NaCl duen lotura-buffer batekin eluitu zen 0.5 CV-tan. Bildu xurgapen-espektroa 250 eta 1000 nm artean, mantendu xurgapen-erlazioa (A880/A280) 1 baino handiagoa duen frakzioa 880 eta 280 nm artean, diluitu bi aldiz lotura-bufferrean eta erabili prozedura bera berriro DEAE zutabean purifikazioan. Diluitu 1,7 baino handiagoak diren A880/A280 erlazioak eta 3,0 baino handiagoak diren A880/A805 erlazioak dituzten frakzioak, egin ioi-trukearen hirugarren txanda eta mantendu 2,2 baino handiagoak diren A880/A280 erlazioak eta 5,0 baino handiagoak diren A880/A805 erlazioak. Konplexu partzialki purifikatua ~2 ml-ra kontzentratu zen Amicon 100.000 pisu molekularreko mozketa-iragazki zentrifugo batean (Merck, Erresuma Batua), eta Superdex 200 16/600 tamaina-esklusio-zutabe batean (GE Healthcare, AEB) kargatu zen, 200 mM NaCl bufferrarekin, eta ondoren buffer berean eluitu zen 1,5 CV-tan. Bildu tamaina-esklusio-frakzioaren xurgapen-espektroak, eta kontzentratu xurgapen-espektroak A880/A280 erlazioekin 2,4tik gorakoekin eta A880/A805 erlazioekin 5,8tik 100era bitartekoekin A880, eta erabili berehala krio-TEM sarearen prestaketarako edo biltegiratzeko. Mantendu -80 °C-tan behar izan arte.
PufW-His anduiaren disolbatzaile mintza 20 ml-ko HisPrep FF Ni-NTA Sepharose zutabe bati aplikatu zitzaion (20 mM tris-HCl (pH 8.0), 200 mM NaCl eta % 0,03 (p/p) dituena) IMAC bufferrean (GE Healthcare). v) β-DDM]. Zutabea bost CV IMAC bufferrean garbitu zen, eta gero bost CV IMAC bufferrean, 10 mM histidina dutenak. Nukleo-konplexua zutabetik eluitu zen 100 mM histidina duten bost IMAC bufferretan. RC-LH114-W konplexua duen frakzioa ~10 ml-ra kontzentratzen da Amicon 100.000 MWCO iragazki batekin (Merck, Erresuma Batua) hornitutako iragazki-tanga batean, 20 aldiz diluitu da lotura-bufferrean, eta gero 25 ml-ko zutabean gehitzen da. DEAE Sepharose zutabean, bufferrean lotutako lau CV erabiltzen dira aldez aurretik. Garbitu zutabea lau CV lotura-bufferrerekin, eta ondoren eluitu konplexua zortzi CV-tan 0 eta 100 mM-ko NaCl-ko gradiente lineal batean (lotura-bufferrean), eta gainerako lau CV-ak 100 mM lotura-bufferrean. Sodio kloruroan eluitu ziren hondar-konplexuak, 2,4 baino handiagoa den A880/A280 erlazioarekin eta 4,6 baino handiagoa den A880/A805 erlazioarekin konbinatuta. Amicon 100.000 MWCO iragazki zentrifugo batean ~2 ml-ra kontzentratu ziren, eta 1,5 CV-ko IMAC-arekin bete ziren aldez aurretik bufferrean orekatutako Superdex 200 16/600 tamainako bazterketa-zutabearekin, eta ondoren buffer berean 1,5 CV-tik gora eluitu ziren. Bildu tamaina-bazterketa frakzioen xurgapen-espektroak eta kontzentratu 2,1etik gorako A880/A280 erlazioekin eta 4,6tik gorako A880/A805 erlazioekin 100etik 480ra, berehala erabili izoztutako TEM sarearen prestaketarako edo -80 °C-tan gorde behar izan arte.
Leica EM GP murgiltze-izozkailu bat erabili zen tenperatura baxuko TEM sareak prestatzeko. Konplexua IMAC bufferrean diluitu zen 50eko A880-raino, eta ondoren 5 μl kargatu ziren QUANTIFOIL 1.2/1.3 karbono-estalidun kobrezko sare berri batean (Agar Scientific, Erresuma Batua). Inkubatu sareak 20 °C-tan eta % 60ko hezetasun erlatiboan 30 segundoz, ondoren lehortu 3 segundoz, eta ondoren itzali etano likidoan -176 °C-tan.
RC-LH114-W konplexuaren datuak eBIC-en (Electronic Bioimaging Center) (British Diamond Light Source) grabatu ziren Titan Krios mikroskopio batekin, 300 kV-ko azelerazio-tentsioan funtzionatzen duena, 130.000×-ko handitze nominalarekin eta -10 ...
RC-LH116 konplexuaren datuak Asterbury Biostructure Laboratory-n (Leedseko Unibertsitatea, Erresuma Batua) mikroskopio bera erabiliz bildu ziren. Datuak zenbaketa moduan bildu ziren 130 k-ko handitzearekin, eta pixelen tamaina 1.065 Å-ra kalibratu zen 4.6 e-Å-2s-1-ko dosiarekin. Filma 12 segundotan grabatu zen eta 48 zatitan banatu zen. Guztira, 3359 film bildu ziren, -1 eta -3 μm arteko defoku-balioekin.
Datuen prozesamendu guztia Relion 3.0 hodibidean egiten da (42). Erabili Motioncorr 2 (43) izpiaren mugimendua dosi-haztapenaren bidez zuzentzeko, eta ondoren erabili CTFFIND 4.1 (44) CTF (kontraste-transferentzia funtzioa) parametroa zehazteko. Hasierako prozesatze-etapa hauen ondorengo fotomikrografia tipikoak 2. irudian ageri dira. S16. Hautapen automatikoaren txantiloia sortzen da eskuz hautatuz 1000 partikulako 250 pixel inguru 250 pixeleko fotograma batean eta erreferentziazko bi dimentsioko (2D) sailkapenik gabe, horrela laginaren kutsadura betetzen duten edo ezaugarri hautemangarririk ez duten sailkapenak baztertuz. Ondoren, hautaketa automatikoa egin zen mikroargazki guztietan, eta RC-LH114-W 849.359 partikula izan ziren, eta RC-LH116 konplexua 476.547 partikula. Hautatutako partikula guztiek erreferentziarik gabeko 2D sailkapeneko bi txanda jasan dituzte, eta exekuzio bakoitzaren ondoren, karbono-eremuarekin, laginaren kutsadurarekin, ezaugarri agerikorik ez duten partikulak edo gainjarritako partikulak baztertzen dira, eta horren ondorioz 772.033 (% 90,9) eta 359.678 (% 75,5) partikulak erabiltzen dira RC-LH114-W eta RC-LH116-ren 3D sailkapenerako, hurrenez hurren. Hasierako 3D erreferentzia-eredua jaitsiera-gradiente estokastikoaren metodoa erabiliz sortu zen. Hasierako eredua erreferentzia gisa erabiliz, hautatutako partikulak lau kategoriatan sailkatzen dira 3Dn. Kategoria honetako eredua erreferentzia gisa erabiliz, egin 3D fintzea kategoria handieneko partikuletan, ondoren erabili hasierako 15 Å-ko behe-paseko iragazkia disolbatzailearen eremua estaltzeko, gehitu 6 pixel ertz leunen eta prozesatu pixelak goiko detektagailuaren Gatan K2 gailurraren modulazio-transferentzia-funtzioa zuzentzeko. RC-LH114-W datu-multzorako, hasierako eredu hau aldatu zen maskararen ertzetan zegoen dentsitate handia kenduz (UCSF Chimera-n nukleo konplexuaren dentsitatetik deskonektatuta). Emaitza diren ereduak (RC-LH114-W eta RC-LH116-ren bereizmenak 3,91 eta 4,16 Å dira, hurrenez hurren) 3D sailkapenaren bigarren txandarako erreferentzia gisa erabiltzen dira. Erabilitako partikulak hasierako 3D klasean multzokatzen dira eta ez dute korrelazio sendorik auzoarekin. Gainjartzea edo ezaugarri estruktural nabarmenen falta. 3D sailkapenaren bigarren txandaren ondoren, bereizmen handiena zuen kategoria hautatu zen [RC-LH114-W-rako, kategoria bat 377.703 partikula da (% 44,5), RC-LH116-rako, bi kategoria daude, guztira 260.752 partikula (% 54,7), non berdinak diren hasierako biraketaren ondoren lerrokatuta daudenean bakarrik, alde txiki batekin]. Hautatutako partikulak 400 pixeleko kaxa batean berriro erauzten dira eta 3D fintzearen bidez fintzen dira. Disolbatzailearen maskara hasierako 15 Å-ko behe-paseko iragazkia, 3 pixeleko maparen hedapena eta 3 pixeleko maskara leuna erabiliz sortzen da. Partikula bakoitzeko CTF fintzea, partikula bakoitzeko mugimenduaren zuzenketa eta partikula bakoitzeko CTF fintzearen bigarren txanda erabiliz, 3D fintzea, disolbatzailearen maskaratzea eta postprozesamendua egiten dira urrats bakoitzaren ondoren, ondoriozko ehundura gehiago fintzeko. 0,143ko FSC (Fourier Shell Correlation Coefficient) mozketa-balioa erabiliz, RC-LH114-W eta RC-LH116 azken modeloen bereizmenak 2,65 eta 2,80 Å dira, hurrenez hurren. Azken modeloaren FSC kurba 2. S17 irudian ageri da.
Proteina-sekuentzia guztiak UniProtKB-tik deskargatu dira: LH1-β (PufB; UniProt ID: Q6N9L5); LH1-α (PufA; UniProtID: Q6N9L4); RC-L (PufL; UniProt ID: O83005); RC-M (PufM; UniProt ID: A0A4Z7); RC-H (PuhA; UniProt ID: A0A4Z9); Protein-W (PufW; UniProt ID: Q6N1K3). SWISS-MODEL (45) erabili zen RC-ren homologia-eredu bat eraikitzeko, RC-L, RC-M eta RC-H-ren proteina-sekuentziak eta Rba-ren kristal-egitura dituena. sphaeroides RC txantiloi gisa erabili zen (PDB ID: 5LSE) (46). Erabili UCSF Chimera-ko "mapa egokitu" tresna sortutako eredua mapara egokitzeko (47), proteina-egitura hobetzeko eta kofaktore gisa [4×BChl a (monomero liburutegiaren hondar-izena = BCL), 2×BPh a (BPH), UQ10 mota bat edo bi (U10), burdin ez-hemiko bat (Fe) eta 3,4-dihidrohexakarbonilkolina bat (QAK)] Coot (48) erabili gehitzeko. QAK ez dagoenez monomero liburutegian eskuragarri, PHENIX-eko eLBOW tresna erabiliz parametrizatu zen (49).
Ondoren, LH1 azpiunitatea eraiki zen. Hasieran, PHENIX-eko (49) eraikuntza tresna automatikoa erabili zen LH1 sekuentziaren zati bat automatikoki eraikitzeko, mapa eta LH1-α eta LH1-β proteina sekuentziak sarrera gisa erabiliz. Hautatu LH1 azpiunitate osatuena, erauzi eta Coot-en kargatu, eskuz gehitu falta den sekuentzia bertan, eta eskuz findu egitura osoa bi BCl a (BCL) eta spiriloxantina bat (CRT) gehitu aurretik [dagokien Rps-en arabera. LH1 konplexuaren dentsitatea eta karotenoideen edukia ezagutzen da. Espeziea (17)]. Kopiatu LH1 azpiunitate osoa, eta erabili UCSF Chimera "Docking Map Tool" LH1 dentsitatearen ondoko eredu ez den eremuan lotzeko, eta gero findu Coot-en; errepikatu prozesua LH1 azpiunitate guztiak modelatu arte. RC-LH114-W egiturarako, Coot-en esleitu gabeko dentsitatea ateraz, proteina USCF Chimera mapan gainerako osagai ez-proteinikoetatik segmentatzen da eta Autobuild tresna erabiltzen da hasierako eredua eta gainerako azpiunitateak (proteina-W) modelatzeko. PHENIX-en (49). Gehitu falta diren sekuentziak Coot-en (48) emaitza den ereduari, eta gero findu eskuz azpiunitate osoa. Gainerako esleitu gabeko dentsitatea lipidoen (PDB monomero liburutegiaren IDa CDL = CDL, POPC = 6PL eta POPG = PGT), β-DDM detergentearen (LMT) eta UQ10 molekulen (U10) konbinaziora egokitzen da. Erabili PHENIX optimizazioa (49) eta eskuzko optimizazioa Coot-en (48) hasierako eredu osoa hobetzeko, ereduaren estatistikak eta doikuntzaren kalitate bisuala gehiago hobetu ezin arte. Azkenik, erabili LocScale (50) tokiko mapa zorrozteko, eta gero egin esleitu gabeko dentsitatea modelatzeko beste hainbat ziklo eta optimizazio automatikoa eta eskuzkoa.
Dagozkien peptidoak, kofaktoreak eta beren dentsitateetan lotutako beste lipido eta kinonak 1. eta 2. irudietan ageri dira, S18tik S23ra. Azken ereduaren informazio estatistikoa S1 taulan ageri da.
Bestelakorik zehaztu ezean, UV/Vis/NIR xurgapen-espektroak Cary60 espektrofotometro batean (Agilent, AEB) bildu ziren, 250 nm-tik 1000 nm-ra bitarteko 1 nm-ko tarteetan eta 0,1 segundoko integrazio-denborarekin.
Diluitu lagina kuartzozko kubeta batean, 2 mm-ko bidearekin, 1eko A880raino, eta bildu xurgapen-espektroa 400 eta 1000 nm artean. Espektro dikroiko zirkularrak Jasco 810 espektropolarimetro batean (Jasco, Japonia) bildu ziren, 1 nm-ko tarteetan, 400 nm eta 950 nm artean, 20 nm min-1-ko eskaneatze-abiaduran.
Molaren itzaltze-koefizientea nukleo-konplexua gutxi gorabehera 50eko A880 batera diluituz zehazten da. Diluitu 10 μl-ko bolumena 990 μl lotura-bufferrean edo metanolean, eta bildu xurgapen-espektroa berehala BChl degradazioa minimizatzeko. Metanol-lagin bakoitzaren BChl edukia kalkulatu zen 771 nm-tan 54,8 mM-1 cm-1-ko itzaltze-koefizientearen bidez, eta itzaltze-koefizientea zehaztu zen (51). Zatitu neurtutako BChl kontzentrazioa 32z (RC-LH114-W) edo 36z (RC-LH116) nukleo-konplexuaren kontzentrazioa zehazteko, eta ondoren, hau erabiliko da paraleloan bufferrean bildutako lagin beraren xurgapen-espektroa zehazteko. Hiru neurketa errepikatu egin ziren lagin bakoitzerako, eta BChl Qy maximoaren batez besteko xurgapena erabili zen kalkulurako. RC-LH114-W-ren itzaltze-koefizientea 878 nm-tan neurtua 3280±140 mM-1 cm-1 da, eta RC-LH116-ren itzaltze-koefizientea, berriz, 880 nm-tan neurtua 3800±30 mM-1 cm-1.
UQ10 (52) puntuko metodoaren arabera kuantifikatu zen. Laburbilduz, alderantzizko faseko HPLC (RP-HPLC) Agilent 1200 HPLC sistema erabiliz egin zen. Disolbatu RC-LH116 edo RC-LH114-W 0,02 nmol inguru % 0,02 (w/v) burdin kloruro duen 50:50 metanol:kloroformo 50 μl-tan, eta injektatu aurrez orekatutako Beckman Coulter Ultrasphere ODS 4,6 mm Disolbatu 1 ml-1 min-1-tan 40 °C-tan HPLC disolbatzailean (80:20 metanol:2-propanol) ×25 cm-ko zutabe batean. Egin eluzio isokratikoa HPLC disolbatzaile batean xurgapena kontrolatzeko 275 nm-tan (UQ10), 450 nm-tan (karotenoideak) eta 780 nm-tan (BChl) ordubetez. 275 nm-ko kromatogramaren 25,5 minututan gailurra integratu zen, eta ez zuen beste konposatu detektagarririk. Integratutako eremua erabiltzen da erauzitako UQ10-ren molar kantitate kalkulatzeko, 0 eta 5,8 nmol arteko estandar puruen injekziotik kalkulatutako kalibrazio-kurba erreferentziatzat hartuta (S14 irudia). Lagin bakoitza hiru errepikapenetan aztertu zen, eta jakinarazitako errorea batez bestekoaren SDari dagokio.
0,1eko Qy xurgapen maximoa duen RC-LH1 konplexua duen disoluzio bat prestatu zen 30 μM-ko zaldi-bihotz zitokromo c2 murriztuarekin (Merck, Erresuma Batua) eta 0 eta 50 μMUQ2 artean (Merck, Erresuma Batua). Hiru 1 ml-ko lagin prestatu ziren UQ2 kontzentrazio bakoitzean eta gau osoan inkubatu ziren iluntasunean 4 °C-tan, neurketa egin aurretik iluntasunera guztiz egokitzen zela ziurtatzeko. Disoluzioa OLIS RSM1000 espektrofotometro modular batean sartu zen, 300 nm-ko sugar/500 lerroko sare batekin, 1,24 mm-ko sarrera batekin, 0,12 mm-ko erdiko aldean eta 0,6 mm-ko irteerako zirrikituekin hornitua. 600 nm-ko iragazki luze bat jarri zen laginaren fotohodiaren eta erreferentziazko fotobiderkatzaile hodiaren sarreran, kitzikapen-argia baztertzeko. Xurgapena 550 nm-tan kontrolatu zen, 0,15 segundoko integrazio-denborarekin. Kitzikapen-argia 880 nm-ko M880F2 LED-etik (Argi Igorle Diodoa) (Thorlabs Ltd., Erresuma Batua) igortzen da zuntz optikoko kable baten bidez % 90eko intentsitatean DC2200 kontrolagailu baten bidez (Thorlabs Ltd., Erresuma Batua) eta argi-iturrira igortzen da 90°-ko angeluan. Neurketa-izpia ispiluaren aurkakoa da laginak hasieran xurgatu ez zuen argia itzultzeko. Kontrolatu xurgapena 50 segundoko iluminantziaren aurretik 10 segundo lehenago. Ondoren, xurgapena 60 segundoz kontrolatu zen iluntasunean, kinololak zitokromo c23+ espontaneoki zenbateraino murrizten duen ebaluatzeko (ikus S8 irudia datu gordinak ikusteko).
Datuak 0,5 eta 10 segundo arteko hasierako tasa lineal bat egokituz prozesatu ziren (UQ2 kontzentrazioaren arabera) eta hiru laginen tasen batez bestekoa kalkulatuz UQ2 kontzentrazio bakoitzean. Dagokion itzaltze-koefizientearen bidez kalkulatutako RC-LH1 kontzentrazioa erabili zen tasa eraginkortasun katalitiko bihurtzeko, Origin Pro 2019-n (OriginLab, AEB) irudikatuta, eta Michaelis-Menten ereduari egokitu zitzaion Km eta Kcat balio agerikoak zehazteko.
Aldi baterako xurgapenaren neurketetarako, RC-LH1 lagina ~2μM-ra diluitu zen 50 mM sodio askorbatoa (Merck, AEB) eta 0,4 mM terbutina (Merck, AEB) zituen IMAC bufferrean. Azido askorbikoa erabiltzen da sakrifizio-elektroi emaile gisa, eta tert-butaklofenoa QB inhibitzaile gisa, RC emaile nagusia murriztuta mantentzen dela ziurtatzeko (hau da, fotooxidatu gabe) neurketa-prozesu osoan zehar. Gutxi gorabehera 3 ml lagin gehitzen dira biraka ari den zelula pertsonalizatu batera (0,1 m diametrokoa gutxi gorabehera, 350 RPM), 2 mm-ko bide optiko-luzerarekin, laser bidean dagoen laginak kitzikapen-pultsuen artean iluntasunera egokitzeko denbora nahikoa izan dezan ziurtatzeko. Erabili ~100 fs-ko laser pultsuak Ti: Sapphire laser sistema (Spectra Physics, AEB) anplifikatzeko, lagina 880 nm-tan kitzikatzeko, 1 kHz-ko errepikapen-tasan (20 nJ NIRrako edo 100 nJ Visrako). Datuak bildu aurretik, jarri lagina kitzikapen-argiaren eraginpean 30 minutuz. Esposizioak QA inaktibazioa eragingo du (baliteke QA behin edo bitan murriztea). Baina kontuan izan prozesu hau itzulgarria dela, iluntasunera egokitzeko aldi luze baten ondoren, RC poliki-poliki itzuliko baita QA jarduerara. Helios espektrometro bat (Ultrafast Systems, AEB) erabili zen espektro iragankorrak neurtzeko, -10 eta 7000 ps arteko atzerapen-denborarekin. Erabili Surface Xplorer softwarea (Ultrafast Systems, AEB) datu-multzoak destalkatzeko, gero batu eta estandarizatu. Erabili CarpetView software paketea (Light Conversion Ltd., Lituania) datu-multzo konbinatua erabiltzeko desintegrazioarekin lotutako espektro diferentzialak lortzeko, edo erabili tresnaren erantzunarekin hainbat adierazle konboluzionatzen dituen funtzio bat Origin-en (OriginLab, AEB) uhin-luzera bakarreko espektro-bilakaera egokitzeko.
Goian aipatu bezala (53), LH1 konplexua zuen film fotosintetiko bat prestatu zen, RC eta LH2 antena periferikorik gabe. Mintza 20 mM-ko tris-tan diluitu zen (pH 8.0) eta ondoren 2 mm-ko bide optikoko kuartzozko kubeta batean kargatu zen. 30nJ-ko laser pultsu bat erabili zen lagina 540 nm-tan kitzikatzeko, -10 eta 7000 ps arteko atzerapen-denborarekin. Prozesatu datu-multzoa Rps.pal laginarentzat deskribatutako moduan.
Mintza 150.000 RCF-tan zentrifugatuz pelletatu zen 2 orduz 4 °C-tan, eta ondoren, 880 nm-tan bere xurgapena 20 mM tris-HCl-tan (pH 8,0) eta 200 mM NaCl-tan berriro eseki zen. Mintza % 2ko (w/v) β-DDM-tan poliki-poliki irabiatuz disolbatu, ordubetez iluntasunean 4 °C-tan. Lagina 100 mM trietilamonio karbonatoan (pH 8,0) diluitu zen (TEAB; Merck, Erresuma Batua) 2,5 mg ml-1-ko proteina-kontzentraziora iritsi arte (Bio-Rad analisia). Prozesaketa gehiago aurretik argitaratutako metodoaren arabera egin zen (54), 50 μg proteina diluitu zen guztira 50 μl TEAB-tan, % 1eko (w/v) sodio lauratoa zuena (Merck, Erresuma Batua). 60 segundoz sonikazioaren ondoren, 5 mM tris(2-karboxietil)fosfinarekin (Merck, Erresuma Batua) murriztu zen 37 °C-tan 30 minutuz. S-alkilaziorako, inkubatu lagina 10 mM metil S-metiltiometanosulfonatoarekin (Merck, Erresuma Batua) eta gehitu 200 mM isopropanol stock disoluzio batetik 10 minutuz giro-tenperaturan. Digestio proteolitikoa 2 μg tripsina/endoproteinasa Lys-C nahasketa (Promega Erresuma Batua) gehituz egin zen eta 37 °C-tan inkubatu zen 3 orduz. Laurato gainazal-aktiboena 50 μl etil azetato eta 10 μl % 10 (v/v) LC mailako azido trifluoroazetiko (TFA; Thermo Fisher Scientific, Erresuma Batua) gehituz erauzi zen eta 60 segundoz zurrunbiloatuz. Faseen bereizketa sustatu zen 15.700 RCF-tan zentrifugatuz 5 minutuz. Fabrikatzailearen protokoloaren arabera, C18 biraketa-zutabe bat (Thermo Fisher Scientific, Erresuma Batua) erabili zen peptidoa zuen fase baxua arretaz aspiratzeko eta gatza kentzeko. Hutsean zentrifugatuz lehortu ondoren, lagina % 0,5eko TFA eta % 3ko azetonitriloan disolbatu zen, eta 500 ng nanofluxuko RP kromatografia bidez aztertu ziren, masa-espektrometriarekin batera, aurretik zehaztutako sistemaren parametroak erabiliz.
Erabili MaxQuant v.1.5.3.30 (56) proteinen identifikazio eta kuantifikaziorako Rps. palustris proteomaren datu-basea bilatzeko (www.uniprot.org/proteomes/UP000001426). Masa-espektrometriaren proteomikaren datuak ProteomeXchange Alliance-n gorde dira PRIDE bazkideen biltegiaren bidez (http://proteomecentral.proteomexchange.org), PXD020402 datu-multzoaren identifikatzailearekin.
RPLC bidezko analisietarako, elektroihinztadura ionizazio masa espektrometriarekin batera, RC-LH1 konplexua Rps basatietatik prestatu zen. Aurretik argitaratutako metodoa (16) erabiliz, palustris zeluletan sortutako proteina kontzentrazioa 2 mg ml-1 izan zen 20 mM Hepes-en (pH 7,8), 100 mM NaCl eta % 0,03 (w/v) β- (Bio-Rad analisia)) DDM-tan. Fabrikatzailearen protokoloaren arabera, erabili 2D purifikazio kit bat (GE Healthcare, AEB) 10 μg proteina prezipitazio metodoaren bidez ateratzeko, eta prezipitatua disolbatu 20 μl % 60 (v/v) azido formiko (FA), % 20 (v/v) azetonitrilo eta % 20 (v/v) uretan. Bost mikrolitro aztertu ziren RPLC bidez (Dionex RSLC) masa espektrometriarekin batera (Maxis UHR-TOF, Bruker). Erabili MabPac 1.2×100 mm zutabea (Thermo Fisher Scientific, Erresuma Batua) 60 °C-tan eta 100 μlmin -1-tan bereizteko, % 85 (v / v) A disolbatzailearen [% 0,1 (v / v) FA eta % 0,02 (V/v) TFA ur-disoluzioa] eta % 85 (v/v) B disolbatzailearen [% 0,1 (v/v) FA eta % 0,02 (v/v) % 90 (v/v) azetonitrilo TFA-n] gradiente batekin. Elektroihinztadura ionizazio iturri estandarra eta lehenetsitako parametroak 60 minutu baino gehiagoz erabiliz, masa espektrometroak 100 eta 2750 m/z arteko balioak lortzen ditu (masa-karga erlazioa). ExPASy bioinformatika baliabideen atariaren FindPept tresnaren laguntzarekin (https://web.expasy.org/findpept/), mapatu masa espektroa konplexuaren azpiunitateetara.
Zelulak 72 orduz hazi ziren 100 ml-ko NF-argi baxua (10μMm-2 s-1), ertaina (30μMm-2 s-1) edo altua (300μMm-2 s-1) erabiliz. M22 medioa (amonio sulfatoa kendu eta sodio sukzinatoa sodio azetatoz ordezkatzen den M22 medioa) 100 ml-ko torlojuzko botila batean (23). Bost 30 segundoko ziklotan, 0,1 mikrako beirazko aleak 1:1eko bolumen-erlazioan sartu ziren zelulak lisatzeko eta izotzean hoztu ziren 5 minutuz. Materia disolbaezina, hautsi gabeko zelulak eta beirazko aleak 16.000 RCF-tan zentrifugatuz kendu ziren 10 minutuz mahai gaineko mikrozentrifuga batean. Mintza Ti 70.1 errotore batean bereizi zen, 100.000 RCF-rekin, 20 mM-ko tris-HCl-tan (pH 8.0), % 40/% 15eko (p/p) sakarosa gradientearekin, 10 orduz.
Aurreko lanean deskribatu bezala, PufW-n (16) His etiketaren immunodetekzioa. Laburbilduz, RC kontzentrazio bera duen nukleo konplexu purifikatua (11,8 nM) edo mintza (oxidazioaren bidez zehaztuta, espektro diferentzia murriztua kenduz eta gel tindatuan kargarekin bat etorriz) 2x SDS kargatzeko bufferrean (Merck, Erresuma Batua) bi aldiz diluituta. Proteinak % 12ko bis-tris NuPage gel erreplika batean bereizi ziren (Thermo Fisher Scientific, Erresuma Batua). Gel bat Coomassie Brilliant Blue-rekin (Bio-Rad, Erresuma Batua) tindatu zen RC-L azpiunitatea kargatu eta bistaratzeko. Bigarren geleko proteina metanol-aktibatutako polibinilideno fluoruro (PVDF) mintzera (Thermo Fisher Scientific, Erresuma Batua) transferitu zen immunoanalisietarako. PVDF mintza 50 mM tris-HCl (pH 7,6), 150 mM NaCl, % 0,2 (v/v) Tween-20 eta % 5 (w/v) esne gaingabetu hautsetan blokeatu zen, eta ondoren, anti-His antigorputz primarioarekin inkubatu zen (antigorputz bufferra diluitu [50 mM tris-HCl (pH 7,6), 150 mM NaCl eta % 0,05 (v/v) Tween-20] 1:1000 A190-114A, Bethyl Laboratories, AEB] 4 orduz. Antigorputz-bufferrean 3 aldiz 5 minutuz garbitu ondoren, mintza errefau peroxidasa (Sigma-Aldrich, Erresuma Batua) eta saguaren aurkako bigarren mailako antigorputzarekin konbinatu zen (antigorputz-bufferrean 1:10.000 diluitua). Inkubatu detekzioa ahalbidetzeko (antigorputz-bufferrean 3 garbitu eta 5 minutura) WESTAR ETA C 2.0 kimioluminiszentzia substratua (Cyanagen, Italia) eta Amersham Imager 600 (GE Healthcare, Erresuma Batua) erabiliz.
Gel edo immunoanalisi bidezko errei tindatu bakoitzaren intentsitate-banaketa marraztuz, gailurraren azpiko azalera integratuz eta RC-L (gel tindatua) eta Protein-W (immunoanalisia) intentsitate-erlazioa kalkulatuz, ImageJ-n (57) prozesatu irudia. Erlazio hauek erlazio molar bihurtu ziren RC-LH114-W lagin puruan RC-L eta proteina-W arteko erlazioa 1:1 zela suposatuz eta datu-multzo osoa horren arabera normalizatuz.
Artikulu honetarako material osagarriak lortzeko, ikus http://advances.sciencemag.org/cgi/content/full/7/3/eabe2631/DC1
Artikulu hau Creative Commons Aitortu Lizentziaren baldintzen arabera banatzen da, sarbide irekikoa. Artikuluak edozein euskarritan erabilera, banaketa eta erreprodukzio mugagabea baimentzen du, jatorrizko lana behar bezala aipatzen bada.
Oharra: Zure helbide elektronikoa ematea baino ez dizugu eskatzen, orrialdera gomendatzen duzun pertsonak mezu elektronikoa ikustea nahi duzula eta spam-a ez dela jakin dezan. Ez dugu helbide elektronikorik hartuko.
Galdera hau bisitaria zaren ala ez egiaztatzeko eta spam bidalketa automatikoa saihesteko erabiltzen da.
David J. K. Swainsbury, Park Qian, Philip J. Jackson, Kaitlyn M. Faries, Dariusz M. Niedzwiedzki, Elizabeth C. Martin, David A. Farmer, Lorna A. Malone, Rebecca F. Thompson, Neil A. Ranson, Daniel P. Canniffe, Mark J. Dickman, Dewey Holten, Christine Kirmaier, Andrew Hitchcock, C. Neil Hunter
Erreakzio-zentroan dagoen argi-tranpa 1 konplexuaren bereizmen handiko egiturak kinonaren dinamikari buruzko ikuspegi berriak eskaintzen ditu.
David J. K. Swainsbury, Park Qian, Philip J. Jackson, Kaitlyn M. Faries, Dariusz M. Niedzwiedzki, Elizabeth C. Martin, David A. Farmer, Lorna A. Malone, Rebecca F. Thompson, Neil A. Ranson, Daniel P. Canniffe, Mark J. Dickman, Dewey Holten, Christine Kirmaier, Andrew Hitchcock, C. Neil Hunter
Erreakzio-zentroan dagoen argi-tranpa 1 konplexuaren bereizmen handiko egiturak kinonaren dinamikari buruzko ikuspegi berriak eskaintzen ditu.
©2021 Zientziaren Aurrerapenerako Amerikako Elkartea. eskubide guztiak erreserbatuta. AAAS HINARI, AGORA, OARE, CHORUS, CLOCKSS, CrossRef eta COUNTER-en bazkidea da. ScienceAdvances ISSN 2375-2548.