Artikulua "Bioerremediazio teknologia aurreratuak eta konposatu organiko sintetikoen (SOC) birziklatze prozesuak" ikerketa gaiaren parte da. Ikusi 14 artikulu guztiak.
Naftalenoa eta ordezkatutako naftalenoak (metilnaftalenoa, azido naftoikoa, 1-naftil-N-metilkarbamatoa, etab.) bezalako pisu molekular baxuko hidrokarburo aromatiko poliziklikoak (HAP) asko erabiltzen dira hainbat industriatan eta genotoxikoak, mutagenikoak eta/edo kartzinogenikoak dira organismoentzat. Konposatu organiko sintetiko (SOC) edo xenobiotiko hauek lehentasunezko kutsatzailetzat hartzen dira eta mehatxu larria dira ingurumen globalerako eta osasun publikorako. Giza jardueren intentsitateak (adibidez, ikatzaren gasifikazioa, petrolioaren fintzea, ibilgailuen isuriak eta nekazaritza aplikazioak) konposatu nonahi dauden eta iraunkor hauen kontzentrazioa, patua eta garraioa zehazten du. Tratamendu/kentze metodo fisiko eta kimikoez gain, biorremediazioa bezalako teknologia berde eta ingurumena errespetatzen dutenak, POCak erabat degradatzeko edo azpiproduktu ez-toxiko bihurtzeko gai diren mikroorganismoak erabiltzen dituztenak, alternatiba seguru, kostu-eraginkor eta itxaropentsu gisa agertu dira. Lurzoruko mikrobiotan dauden Proteobacteria filumetako (Pseudomonas, Pseudomonas, Comamonas, Burkholderia eta Neosphingobacterium), Firmicutes (Bacillus eta Paenibacillus) eta Actinobacteria (Rhodococcus eta Arthrobacter) hainbat bakterio espeziek konposatu organiko desberdinak degradatzeko gaitasuna frogatu dute. Metabolismoaren ikerketak, genomikak eta analisi metagenomikoak bizitza-forma sinple hauetan dagoen konplexutasun eta dibertsitate katabolikoa ulertzen laguntzen digute, eta horiek biodegradazio eraginkorra lortzeko gehiago aplika daitezke. PAHen epe luzeko existentziak degradazio-fenotipo berriak sortu ditu geneen transferentzia horizontalaren bidez, elementu genetikoak erabiliz, hala nola plasmidoak, transposoiak, bakteriofagoak, uharte genomikoak eta elementu konjugatzaile integratzaileak. Sistemen biologiak eta isolatu espezifikoen edo eredu-komunitateen (partzuergoen) ingeniaritza genetikoak PAH hauen biorremediazio integrala, azkarra eta eraginkorra ahalbidetu dezakete efektu sinergikoen bidez. Berrikuspen honetan, naftalenoaren eta ordezkatutako naftalenoa degradatzen duten bakterioen bide metaboliko desberdinetan eta aniztasunean, konposizio eta aniztasun genetikoetan eta erantzun/egokitzapen zelularretan zentratuko gara. Horrek informazio ekologikoa emango du eremuko aplikaziorako eta anduien optimizaziorako biorremediazio eraginkorra lortzeko.
Industrien garapen azkarrak (petrokimikoak, nekazaritza, farmazia, ehunen tinduak, kosmetikoak, etab.) munduko oparotasun ekonomikoari eta bizi-maila hobetzeari lagundu dio. Garapen esponentzial honek konposatu organiko sintetiko (SOC) kopuru handia ekoiztea ekarri du, eta hauek hainbat produktu fabrikatzeko erabiltzen dira. Konposatu arrotz edo SOC horien artean daude hidrokarburo aromatiko poliziklikoak (HAP), pestizidak, herbizidak, plastifikatzaileak, tinduak, farmazia, organofosfatoak, suaren aurkakoak, disolbatzaile organiko lurrunkorrak, etab. Atmosferara, uretako eta lehorreko ekosistemetara isurtzen dira, non eragin multidimentsionalak dituzten, hainbat bioformatan eragin kaltegarriak eraginez, propietate fisiko-kimikoak eta komunitatearen egitura aldatuz (Petrie et al., 2015; Bernhardt et al., 2017; Sarkar et al., 2020). Kutsatzaile aromatiko askok eragin sendo eta suntsitzaileak dituzte ekosistema/biodibertsitate-gune bero askotan (adibidez, koralezko arrezifeak, Artikoko/Antartikoko izotz-geruzak, goi-mendiko aintzirak, itsaso sakoneko sedimentuak, etab.) (Jones 2010; Beyer et al. 2020; Nordborg et al. 2020). Azken ikerketa geomikrobiologikoek erakutsi dute materia organiko sintetikoa (adibidez, kutsatzaile aromatikoak) eta haien deribatuak egitura artifizialen (eraikitako ingurunea) gainazalean (adibidez, granitozko, harrizko, egurrez eta metalezko ondare kulturaleko guneak eta monumentuak) metatzeak haien degradazioa bizkortzen duela (Gadd 2017; Liu et al. 2018). Giza jarduerek monumentuen eta eraikinen degradazio biologikoa areagotu eta okerrera egin dezakete airearen kutsaduraren eta klima-aldaketaren bidez (Liu et al. 2020). Kutsatzaile organiko hauek atmosferako ur-lurrunarekin erreakzionatzen dute eta egituran finkatzen dira, materialaren degradazio fisiko eta kimikoa eraginez. Biodegradazioa oso ezaguna da materialen itxuran eta propietateetan organismo bizidunek eragindako aldaketa desiragarri gisa, eta horien kontserbazioan eragina dute (Pochon eta Jaton, 1967). Konposatu hauen ekintza mikrobiano gehiagok (metabolismoak) egitura-osotasuna, kontserbazio-eraginkortasuna eta balio kulturala murriztu ditzake (Gadd, 2017; Liu et al., 2018). Bestalde, kasu batzuetan, egitura horiei egokitzapen eta erantzun mikrobianoa onuragarria dela ikusi da, biofilmak eta bestelako babes-azalak eratzen baitituzte, usteltze/deskonposizio-tasa murrizten dutenak (Martino, 2016). Beraz, harrizko, metalezko eta egurrezko monumentuetarako epe luzerako kontserbazio-estrategia jasangarri eraginkorrak garatzeak prozesu horretan parte hartzen duten prozesu nagusiak sakonki ulertzea eskatzen du. Prozesu naturalekin (prozesu geologikoak, baso-suteak, sumendi-erupzioak, landareen eta bakterioen erreakzioak) alderatuta, gizakien jarduerek hidrokarburo aromatiko polizikliko (HAP) eta beste karbono organiko (OC) kopuru handiak askatzen dituzte ekosistemetara. Nekazaritzan (DDT, atrazina, karbaril, pentaklorofenola, etab. bezalako intsektizidak eta pestizidak), industrian (petrolio gordina, petrolio-lohiak/hondakinak, petroliotik eratorritako plastikoak, PCBak, plastifikatzaileak, detergenteak, desinfektatzaileak, fumiganteak, lurrinak eta kontserbagarriak), higiene pertsonaleko produktuetan (eguzkitako kremak, desinfektatzaileak, intsektuen uxatzeko produktuak eta musk poliziklikoak) eta munizioetan (2,4,6-TNT bezalako lehergailuak) erabiltzen diren HAP asko planetaren osasunean eragina izan dezaketen xenobiotiko potentzialak dira (Srogi, 2007; Vamsee-Krishna eta Phale, 2008; Petrie et al., 2015). Zerrenda hau zabaldu daiteke petroliotik eratorritako konposatuak (erregai-olioak, lubrifikatzaileak, asfaltenoak), pisu molekular handiko bioplastikoak eta likido ionikoak sartzeko (Amde et al., 2015). 1. taulan hainbat kutsatzaile aromatiko eta haien aplikazioak zerrendatzen dira hainbat industriatan. Azken urteotan, konposatu organiko lurrunkorren, karbono dioxidoaren eta beste berotegi-efektuko gas batzuen isurketa antropogenikoak handitzen hasi dira (Dvorak et al., 2017). Hala ere, eragin antropogenikoak naturalak baino askoz handiagoak dira. Gainera, ikusi dugu hainbat konposatu organiko lurrunkor daudela ingurumen-ingurune askotan, eta biometan eragin kaltegarriak dituzten kutsatzaile emergente gisa identifikatu direla (1. irudia). Ingurumen-agentziek, hala nola Estatu Batuetako Ingurumena Babesteko Agentziak (USEPA), kutsatzaile horietako asko sartu dituzte lehentasun-zerrendan, dituzten propietate zitotoxiko, genotoxiko, mutageniko eta kartzinogenikoengatik. Hori dela eta, hondakinak kutsatutako ekosistemetatik tratatzeko/kentzeko arau zorrotzak eta estrategia eraginkorrak behar dira. Hainbat tratamendu fisiko eta kimiko metodo, hala nola pirolisia, tratamendu termiko oxidatiboa, airearen aireztapena, zabortegiak botatzea, errausketa, etab., ez dira eraginkorrak eta garestiak dira, eta azpiproduktu korrosiboak, toxikoak eta tratatzeko zailak sortzen dituzte. Mundu mailako ingurumen-kontzientzia gero eta handiagoa den heinean, kutsatzaile hauek eta haien deribatuak (hala nola halogenatuak, nitroak, alkiloak eta/edo metiloak) degradatzeko gai diren mikroorganismoek gero eta arreta handiagoa erakartzen ari dira (Fennell et al., 2004; Haritash eta Kaushik, 2009; Phale et al., 2020; Sarkar et al., 2020; Schwanemann et al., 2020). Bertako mikroorganismo hautagai hauek bakarrik edo kultura mistoetan (koloniak) erabiltzeak abantailak ditu ingurumen-segurtasunari, kostuari, eraginkortasunari, eraginkortasunari eta iraunkortasunari dagokionez. Ikertzaileek prozesu mikrobianoak metodo elektrokimiko erredoxekin integratzea ere aztertzen ari dira, hots, sistema bioelektrokimikoekin (BES), kutsatzaileak tratatzeko/kentzeko teknologia itxaropentsu gisa (Huang et al., 2011). BES teknologiak gero eta arreta handiagoa erakarri du bere eraginkortasun handiagatik, kostu baxuagatik, ingurumen-segurtasunagatik, giro-tenperaturan funtzionatzeagatik, material biobateragarriengatik eta azpiproduktu baliotsuak (adibidez, elektrizitatea, erregaia eta produktu kimikoak) berreskuratzeko gaitasunagatik (Pant et al., 2012; Nazari et al., 2020). Genomaren sekuentziazio handiko eta omika tresnen/metodoen etorrerak informazio berri ugari eman du degradatzaile diren hainbat mikroorganismoren erreakzioen erregulazio genetikoari, proteomikari eta fluxumikari buruz. Tresna hauek sistemen biologiarekin konbinatzeak are gehiago hobetu du mikroorganismoen bide katabolikoen hautaketa eta doikuntza (hau da, diseinu metabolikoa) biodegradazio eraginkorra eta eraginkorra lortzeko. Mikroorganismo hautagai egokiak erabiliz biorremediazio estrategia eraginkorrak diseinatzeko, mikroorganismoen potentzial biokimikoa, aniztasun metabolikoa, konposizio genetikoa eta ekologia (autoekologia/sinekologia) ulertu behar ditugu.
1. irudia. Molekula baxuko HAPen iturriak eta bideak hainbat ingurumen-ingurune eta biotan eragina duten hainbat faktoreren bidez. Lerro etenak ekosistema-elementuen arteko elkarrekintzak adierazten dituzte.
Berrikuspen honetan, naftalenoa eta ordezkatutako naftalenoak bezalako PAH sinpleen degradazioari buruzko datuak laburbiltzen saiatu gara hainbat bakterio isolatuk egindako bide metabolikoak eta dibertsitatea, degradazioan parte hartzen duten entzimak, geneen osaera/edukia eta dibertsitatea, zelulen erantzunak eta biorremediazioaren hainbat alderdi landuz. Maila biokimikoak eta molekularrak ulertzeak ostalari-andui egokiak eta haien ingeniaritza genetiko gehiago identifikatzen lagunduko du lehentasunezko kutsatzaile horien biorremediazio eraginkorrerako. Horrek biorremediazio eraginkorrerako gune espezifikoetako bakterio-partzuergoak ezartzeko estrategiak garatzen lagunduko du.
Konposatu aromatiko toxiko eta arriskutsu ugari egoteak (Huckelen 4n + 2π elektroiak betetzen dituztenak, n = 1, 2, 3, …) mehatxu larria dakar hainbat ingurumen-ingurunerentzat, hala nola airearentzat, lurzoruarentzat, sedimentuentzat eta gainazaleko eta lurpeko urentzat (Puglisi et al., 2007). Konposatu hauek bentzeno eraztun bakarrak (monoziklikoak) edo bentzeno eraztun anitzak (poliziklikoak) dituzte, forma linealean, angeluarrean edo multzokatuan antolatuta, eta egonkortasuna (egonkortasuna/ezegonkortasuna) erakusten dute ingurunean, erresonantzia-energia negatibo handia eta inertzia (inertzia) direla eta, eta hori haien hidrofobikotasunagatik eta egoera murriztuagatik azal daiteke. Eraztun aromatikoa metilo (-CH3), karboxilo (-COOH), hidroxilo (-OH) edo sulfonato (-HSO3) taldeekin ordezkatzen denean, egonkorragoa bihurtzen da, makromolekulenganako afinitate handiagoa du eta bioakumulatzailea da sistema biologikoetan (Seo et al., 2009; Phale et al., 2020). Pisu molekular baxuko hidrokarburo aromatiko polizikliko batzuk (LMWAH), hala nola naftalenoa eta haren deribatuak [metilnaftalenoa, azido naftoikoa, naftalenosulfonatoa eta 1-naftil N-metilkarbamatoa (karbariloa)], AEBetako Ingurumen Babeserako Agentziak lehentasunezko kutsatzaile organikoen zerrendan sartu ditu, genotoxiko, mutageniko eta/edo kartzinogeno gisa (Cerniglia, 1984). NM-PAH mota hau ingurumenera isurtzeak konposatu hauen bioakumulazioa eragin dezake elikadura-kateko maila guztietan, eta horrela ekosistemen osasunean eragina izan dezake (Binkova et al., 2000; Srogi, 2007; Quinn et al., 2009).
HAPek biotara iristen diren iturriak eta bideak batez ere ekosistemako osagai desberdinen migrazioaren eta interakzioen bidez gertatzen dira, hala nola lurzorua, lurpeko urak, gainazaleko ura, laboreak eta atmosfera (Arey eta Atkinson, 2003). 1. irudiak ekosistemetan pisu molekular baxuko HAP desberdinen interakzioak eta banaketa eta biotaren/gizakien esposiziorako bideak erakusten ditu. HAPak gainazaletan metatzen dira airearen kutsaduraren ondorioz eta ibilgailuen isurien, industria-ihes-gasen (ikatzaren gasifikazioa, errekuntza eta kokearen ekoizpena) migrazioaren (noraezean) eta haien metaketaren bidez. Ehun sintetikoen, tindagaien eta pinturaren fabrikazioa bezalako jarduera industrialak; egurra kontserbatzea; kautxua prozesatzea; zementua fabrikatzeko jarduerak; pestiziden ekoizpena; eta nekazaritza-aplikazioak dira HAPen iturri nagusiak lurreko eta uretako sistemetan (Bamforth eta Singleton, 2005; Wick et al., 2011). Ikerketek erakutsi dute hiri eta hiriguneetako, autobideen ondoko eta hiri handietako lurzoruak hidrokarburo aromatiko poliziklikoen (HAP) aurrean sentikorragoak direla zentral elektrikoetatik, etxebizitzen berogailuetatik, aireko eta errepideko trafiko-kargetatik eta eraikuntza-jardueretatik datozen isuriengatik (Suman et al., 2016). (2008) emaitzek erakutsi zuten New Orleanseko (Louisiana, AEB) errepideen ondoko lurzoruko HAPak 7189 μg/kg-koak zirela, eta espazio irekietan, berriz, 2404 μg/kg-koak baino ez zirela. Era berean, 300 μg/kg-ko HAP mailak jakinarazi dira AEBetako hainbat hiritako ikatz-gasifikazio guneen ondoko eremuetan (Kanaly eta Harayama, 2000; Bamforth eta Singleton, 2005). Indiako hainbat hiritako lurzoruetan, hala nola Delhin (Sharma et al., 2008), Agran (Dubey et al., 2014), Mumbain (Kulkarni eta Venkataraman, 2000) eta Visakhapatnam-en (Kulkarni et al., 2014), PAH kontzentrazio handiak daudela jakinarazi da. Konposatu aromatikoak errazago xurgatzen dira lurzoruko partikuletan, materia organikoan eta buztinezko mineraletan, eta horrela ekosistemetako karbono-hustubide nagusi bihurtzen dira (Srogi, 2007; Peng et al., 2008). Ur-ekosistemetan PAHen iturri nagusiak prezipitazioa (prezipitazio hezea/lehorra eta ur-lurruna), hiri-isuria, hondakin-uren isurketa, lurpeko uren karga, etab. dira (Srogi, 2007). Kalkulatzen da itsas ekosistemetako PAHen % 80 inguru prezipitaziotik, sedimentaziotik eta hondakin-isurketatik datozela (Motelay-Massei et al., 2006; Srogi, 2007). Gainazaleko uretan edo hondakin solidoen isurketa-guneetatik datozen lixibiatuetan dauden PAHen kontzentrazio altuagoek lurpeko urak isurtzen dituzte azkenean, eta horrek osasun publikorako mehatxu handia dakar, Hego eta Hego-ekialdeko Asiako biztanleriaren % 70ek baino gehiagok lurpeko urak edaten baititu (Duttagupta et al., 2019). Duela gutxi Duttagupta et al.-ek (2020) Mendebaldeko Bengalako (India) ibaietako (32) eta lurpeko uren (235) analisiak egin zituen, eta ondorioztatu zen hirietako biztanleen % 53k eta landa-biztanleen % 44k (guztira 20 milioi biztanle) naftalenoarekiko (4,9–10,6 μg/L) eta haren deribatuekiko esposizioa izan dezaketela. Lurzoruaren erabilera-eredu desberdinak eta lurpeko uren erauzketa areagotzea dira pisu molekular baxuko PAHen garraio bertikala (adbekzioa) kontrolatzen duten faktore nagusiak lurpean. Nekazaritzako isurketak, udal eta industriako hondakin-uren isurketak eta hondakin solidoen/zaborraren isurketak PAHek eragina dutela ikusi da ibaiertzetan eta lurpeko sedimentuetan. Prezipitazio atmosferikoak are gehiago areagotzen du PAHen kutsadura. PAHen eta haien alkil deribatuen kontzentrazio altuak (guztira 51) jakinarazi dira mundu osoko ibai/isurialdeetan, hala nola Fraser ibaian, Louan ibaian, Denso ibaian, Missouri ibaian, Anacostia ibaian, Ebro ibaian eta Delaware ibaian (Yunker et al., 2002; Motelay-Massei et al., 2006; Li et al., 2010; Amoako et al., 2011; Kim et al., 2018). Ganges ibaiaren arroko sedimentuetan, naftalenoa eta fenantrenoa izan ziren esanguratsuenak (laginen % 70ean detektatu ziren) (Duttagupta et al., 2019). Gainera, ikerketek erakutsi dute edateko uraren klorazioa egiteak PAH oxigenatu eta kloratu toxikoagoak eratzea ekar dezakeela (Manoli eta Samara, 1999). HAPak zerealetan, fruta eta barazkietan pilatzen dira, landareek lurzoru kutsatuetatik, lurpeko uretatik eta prezipitazioetatik xurgatzen dutenean (Fismes et al., 2002). Uretako organismo asko, hala nola arrainak, muskuiluak, txirlak eta ganbak, HAPekin kutsatzen dira janari kutsatua eta itsasoko ura kontsumitzearen bidez, baita ehunen eta azalaren bidez ere (Mackay eta Fraser, 2000). Sukaldaritza/prozesatzeko metodoek, hala nola parrillan egiteak, erretzeak, ketzeak, frijitzeak, lehortzeak, labean egiteak eta ikatzez sukaldatzeak, HAP kopuru handiak sor ditzakete elikagaietan. Hori neurri handi batean ketzeko materialaren aukeraketaren, hidrokarburo fenoliko/aromatikoen edukiaren, sukaldaritza prozeduraren, berogailu motaren, hezetasun edukiaren, oxigeno horniduraren eta errekuntza tenperaturaren araberakoa da (Guillén et al., 2000; Gomes et al., 2013). Hidrokarburo aromatiko poliziklikoak (HAP) ere detektatu dira esnean kontzentrazio desberdinetan (0,75–2,1 mg/L) (Girelli et al., 2014). PAH hauen metaketa elikagaietan elikagaien propietate fisiko-kimikoen araberakoa da, eta haien efektu toxikoak, berriz, funtzio fisiologikoekin, jarduera metabolikoarekin, xurgapenarekin, banaketarekin eta gorputzeko banaketarekin lotuta daude (Mechini et al., 2011).
Hidrokarburo aromatiko poliziklikoen (HAP) toxikotasuna eta eragin kaltegarriak aspalditik dira ezagunak (Cherniglia, 1984). Pisu molekular baxuko hidrokarburo aromatiko poliziklikoek (LMW-HAP) (bi edo hiru eraztun) DNA, RNA eta proteinen modu kobalentean lotu daitezke hainbat makromolekulatara, hala nola, eta kartzinogenikoak dira (Santarelli et al., 2008). Beren izaera hidrofoboagatik, lipido mintzek bereizten dituzte. Gizakietan, zitokromo P450 monooxigenasek HAPak epoxidoetan oxidatzen dituzte, eta horietako batzuk oso erreaktiboak dira (adibidez, bediol epoxidoa) eta zelula normalak gaizto bihurtzea eragin dezakete (Marston et al., 2001). Gainera, HAPen eraldaketa produktuak, hala nola kinonak, fenolak, epoxidoak, diolak, etab., jatorrizko konposatuak baino toxikoagoak dira. HAP batzuek eta haien bitartekari metabolikoek hormonak eta metabolismoko hainbat entzima eragin ditzakete, eta horrela, hazkuntzan, nerbio-sistema zentralean, ugalketa- eta immunitate-sistemetan eragin kaltegarria izan dezakete (Swetha eta Phale, 2005; Vamsee-Krishna et al., 2006; Oostingh et al., 2008). Pisu molekular baxuko HAPen esposizio laburrak biriketako funtzioa kaltetzen duela eta tronbosia eragiten duela jakinarazi da asmatikoetan, eta azaleko, biriketako, maskuriko eta digestio-aparatuko minbizia izateko arriskua areagotzen duela (Olsson et al., 2010; Diggs et al., 2011). Animalien ikerketek ere erakutsi dute HAPen esposizioak ugalketa-funtzioan eta garapenean eragin kaltegarriak izan ditzakeela eta kataratak, giltzurruneko eta gibeleko kalteak eta ikterizia eragin ditzakeela. HAPen bioeraldaketa-produktu batzuek, hala nola diolek, epoxidoek, kinonek eta erradikal askeek (katioiek), DNA aduktuak eratzen dituztela frogatu da. Aduktu egonkorrek DNAren erreplikazio-makinaria aldatzen dutela frogatu da, aduktu ezegonkorrek, berriz, DNA despurinatu dezakete (batez ere adenina eta batzuetan guanina bihurtuz); biek mutazioak eragiten dituzten akatsak sor ditzakete (Schweigert et al. 2001). Gainera, kinonek (benzo-/pan-) oxigeno erreaktiboak diren espezieak (ROS) sor ditzakete, DNAri eta beste makromolekula batzuei kalte hilgarriak eraginez, eta horrela ehunen funtzioan/bideragarritasunean eraginez (Ewa eta Danuta 2017). Pireno, bifenilo eta naftaleno kontzentrazio baxuen eraginpean egoteak minbizia eragiten duela jakinarazi da esperimentu-animalietan (Diggs et al. 2012). Haien toxikotasun hilgarria dela eta, PAH hauek kaltetutako/kutsatutako guneetatik garbitzea/kentzea lehentasuna da.
Hainbat metodo fisiko eta kimiko erabili dira HAPak kutsatutako gune/inguruneetatik kentzeko. Errausketa, kloraziorik gabe uztea, UV oxidazioa, finkapena eta disolbatzaileen erauzketa bezalako prozesuek desabantaila asko dituzte, besteak beste, azpiproduktu toxikoen eraketa, prozesuaren konplexutasuna, segurtasun eta araudi arazoak, eraginkortasun baxua eta kostu handia. Hala ere, biodegradazio mikrobianoa (biorremediazioa deiturikoa) alternatiba itxaropentsua da, mikroorganismoak kultura puruen edo kolonien moduan erabiltzea dakarrena. Metodo fisiko eta kimikoekin alderatuta, prozesu hau ingurumena errespetatzen duena, ez-inbaditzailea, kostu-eraginkorra eta jasangarria da. Biorremediazioa kaltetutako gunean (in situ) edo bereziki prestatutako gune batean (ex situ) egin daiteke eta, beraz, erremediazio metodo jasangarriagotzat hartzen da metodo fisiko eta kimiko tradizionalak baino (Juhasz eta Naidu, 2000; Andreoni eta Gianfreda, 2007; Megharaj et al., 2011; Phale et al., 2020; Sarkar et al., 2020).
Kutsatzaile aromatikoen degradazioan parte hartzen duten metabolismo mikrobianoaren urratsak ulertzeak ondorio zientifiko eta ekonomiko izugarriak ditu iraunkortasun ekologiko eta ingurumenekoarentzat. Kalkulatzen da 2,1 × 1018 gramo karbono (C) inguru gordetzen direla sedimentuetan eta konposatu organikoetan (hau da, petrolioan, gas naturalan eta ikatzean, hau da, erregai fosiletan) mundu osoan, eta horrek ekarpen handia egiten dio karbonoaren ziklo globalean. Hala ere, industrializazio azkarrak, erregai fosilen erauzketak eta giza jarduerek litosferako karbono-erreserba horiek agortzen ari dira, urtero 5,5 × 1015 g karbono organiko (kutsatzaile gisa) askatuz atmosferara (Gonzalez-Gaya et al., 2019). Karbono organiko horren gehiena lurreko eta itsasoko ekosistemetara sartzen da sedimentazioaren, garraioaren eta isurketaren bidez. Horrez gain, erregai fosiletatik eratorritako kutsatzaile sintetiko berriek, hala nola plastikoek, plastifikatzaileek eta plastiko egonkortzaileek (ftalatoak eta haien isomeroak), itsasoko, lurzoruko eta uretako ekosistemak eta haien biota larriki kutsatzen dituzte, eta horrela klima-arrisku globalak areagotzen dituzte. Hainbat mikroplastiko, nanoplastiko, plastiko zati eta polietilen tereftalatotik (PET) eratorritako monomero produktu toxikoak pilatu dira Ozeano Barean, Ipar Amerika eta Hego-ekialdeko Asia artean, "Pazifikoko Zabor Orban Handia" osatuz, itsas bizitzari kalte eginez (Newell et al., 2020). Ikerketa zientifikoek frogatu dute ezinezkoa dela kutsatzaile/hondakin horiek kentzea metodo fisiko edo kimikoen bidez. Testuinguru honetan, mikroorganismo erabilgarrienak kutsatzaileak oxidatiboki metabolizatzeko gai direnak dira, karbono dioxido, energia kimiko eta beste azpiproduktu ez-toxiko batzuetan, eta horiek azkenean beste mantenugai-ziklo prozesu batzuetan sartzen dira (H, O, N, S, P, Fe, etab.). Beraz, kutsatzaile aromatikoen mineralizazioaren ekofisiologia mikrobianoa eta haren ingurumen-kontrola ulertzea ezinbestekoa da karbono ziklo mikrobianoa, karbono aurrekontu garbia eta etorkizuneko klima-arriskuak ebaluatzeko. Konposatu horiek ingurumenetik kentzeko premiazko beharra ikusita, teknologia garbietan zentratutako hainbat ekoindustria sortu dira. Bestela, ekosistemetan pilatutako industria-hondakinen/hondakin-produktuen balorizazioa (hau da, hondakinetatik aberastasunera bitarteko ikuspegia) ekonomia zirkularraren eta garapen jasangarriko helburuen zutabeetako bat dela uste da (Close et al., 2012). Beraz, degradazio-hautagai potentzial hauen alderdi metabolikoak, entzimatikoak eta genetikoak ulertzea oso garrantzitsua da kutsatzaile aromatiko horiek eraginkortasunez kentzeko eta biorremediatzeko.
Kutsatzaile aromatiko askoren artean, arreta berezia jartzen diegu pisu molekular baxuko HAPei, hala nola naftalenoari eta ordezkatutako naftalenoei. Konposatu hauek petroliotik eratorritako erregaien, ehun-tindagaien, kontsumo-produktuen, pestiziden (naftalina-bolak eta intsektuen uxatzeko produktuak), plastifikatzaileen eta taninoen osagai nagusiak dira, eta, beraz, ekosistema askotan oso hedatuta daude (Preuss et al., 2003). Azken txostenek naftalenoaren kontzentrazioen metaketa nabarmentzen dute akuiferoen sedimentuetan, lurpeko uretan eta lurpeko lurzoruetan, eremu badosoetan eta ibaien oheetan, ingurumenean bioakumulazioa iradokiz (Duttagupta et al., 2019, 2020). 2. taulan naftalenoaren eta bere deribatuen propietate fisiko-kimikoak, aplikazioak eta osasunean dituzten ondorioak laburbiltzen dira. Pisu molekular handiko beste HAP batzuekin alderatuta, naftalenoa eta bere deribatuak ez dira hain hidrofoboak, uretan disolbagarriagoak eta ekosistemetan oso hedatuta daude, beraz, askotan substratu eredu gisa erabiltzen dira HAPen metabolismoa, genetika eta aniztasun metabolikoa aztertzeko. Mikroorganismo kopuru handi batek naftalenoa eta bere deribatuak metabolizatzeko gai dira, eta informazio zabala dago haien bide metabolikoei, entzimei eta ezaugarri erregulatzaileei buruz (Mallick et al., 2011; Phale et al., 2019, 2020). Gainera, naftalenoa eta bere deribatuak ingurumen-kutsaduraren ebaluaziorako prototipo konposatu gisa izendatu dira, ugaritasun eta bioerabilgarritasun handiagatik. AEBetako Ingurumen Babeserako Agentziak kalkulatzen du naftalenoaren batez besteko mailak 5,19 μg direla metro kubikoko zigarro-ketik, batez ere errekuntza osatugabetik, eta 7,8 eta 46 μg artean alboko ketik, kreosotaren eta naftalenoaren eraginpean egotea 100 eta 10.000 aldiz handiagoa den bitartean (Preuss et al. 2003). Naftalenoak, bereziki, espezie, eskualde eta sexu espezifikoetako arnasketa-toxikotasuna eta kartzinogenotasuna dituela ikusi da. Animalien ikerketetan oinarrituta, Minbiziaren Ikerketarako Nazioarteko Agentziak (IARC) naftalenoa "gizakien kartzinogeno posible" gisa sailkatu du (2B taldea)1. Naftaleno ordezkatuen eraginpean egoteak, batez ere arnastearen edo administrazio parenteralaren (ahoaren) bidez, biriketako ehunen lesioak eragiten ditu eta biriketako tumoreen intzidentzia areagotzen du arratoi eta saguetan (2. Toxikologia Programa Nazionala). Efektu akutuen artean, goragalea, oka, sabeleko mina, beherakoa, buruko mina, nahasmena, izerdi ugaria, sukarra, takikardia, etab. daude. Bestalde, espektro zabaleko karbamato intsektizida karbaril (1-naftil N-metilkarbamatoa) toxikoa dela jakinarazi da uretako ornogabeentzat, anfibioentzat, erleentzat eta gizakientzat, eta azetilkolinesterasa inhibitzen duela frogatu da, paralisia eraginez (Smulders et al., 2003; Bulen eta Distel, 2011). Beraz, ezinbestekoa da degradazio mikrobianoaren mekanismoak, erregulazio genetikoa, erreakzio entzimatikoak eta zelularrak ulertzea ingurune kutsatuetan biorremediazio estrategiak garatzeko.
2. taula. Naftalenoaren eta haren deribatuen propietate fisiko-kimikoei, erabilerei, identifikazio-metodoei eta lotutako gaixotasunei buruzko informazio zehatza.
Kutsatutako nitxoetan, kutsatzaile aromatiko hidrofobo eta lipofilikoek hainbat efektu zelular sor ditzakete ingurumeneko mikrobioman (komunitatean), hala nola mintz-jariakortasunean, mintz-iragazkortasunean, lipidoen bigeruzaren hanturan, energia-transferentziaren etenaldian (elektroi-garraio-katea/protoi-indar eragilea) eta mintzarekin lotutako proteinen jardueran (Sikkema et al., 1995). Horrez gain, katekolek eta kinonek bezalako bitartekari disolbagarri batzuek oxigeno-espezie erreaktiboak (ROS) sortzen dituzte eta DNA eta proteinekin aduktuak eratzen dituzte (Penning et al., 1999). Horrela, ekosistemetan konposatu horien ugaritasunak presio selektiboa eragiten die komunitate mikrobianoei degradatzaile eraginkorrak bihurtzeko hainbat maila fisiologikotan, besteak beste, xurgapenean/garraioan, zelula barruko eraldaketan, asimilazioan/erabileran eta konpartimentazioan.
Erribosoma Datu Basearen Proiektuaren II. (RDP-II) bilaketa batek agerian utzi zuen guztira 926 bakterio espezie isolatu zirela naftalenoz edo haren deribatuez kutsatutako ingurune edo aberaste-kulturetatik. Proteobacteria taldeak izan zuen ordezkari kopuru handiena (n = 755), ondoren Firmicutes (52), Bacteroidetes (43), Actinobacteria (39), Tenericutes (10) eta sailkatu gabeko bakterioak (8) (2. irudia). γ-Proteobacteria-ren ordezkariek (Pseudomonadales eta Xanthomonadales) G+C eduki handiko (% 54) Gram-negatiboko talde guztietan nagusi izan ziren, Clostridiales eta Bacillales (% 30) G+C eduki txikiko Gram-positiboko taldeak izan ziren bitartean. Pseudomonas espezieak (kopuru handiena, 338 espezie) naftalenoa eta haren metil deribatuak degradatzeko gai direla jakinarazi da hainbat ekosistema kutsatutan (ikatz-alkitrana, petrolioa, petrolio gordina, lohia, isuritako petrolioa, hondakin-urak, hondakin organikoak eta zabortegiak) zein ekosistema ukigabeetan (lurzorua, ibaiak, sedimentuak eta lurpeko urak) (2. irudia). Gainera, eskualde horietako batzuen aberaste-azterketek eta analisi metagenomikoak agerian utzi dute landu gabeko Legionella eta Clostridium espezieek degradazio-ahalmena izan dezaketela, eta horrek adierazten du bakterio horiek landu behar direla bide berriak eta aniztasun metabolikoa aztertzeko.
2. irudia. Naftalenoz eta naftaleno deribatuez kutsatutako inguruneetan dauden bakterioen ordezkarien taxonomia-dibertsitatea eta banaketa ekologikoa.
Hidrokarburo aromatikoak degradatzen dituzten mikroorganismoen artean, gehienak naftalenoa degradatzeko gai dira karbono eta energia iturri bakar gisa. Naftalenoaren metabolismoan parte hartzen duten gertaeren sekuentzia deskribatu da Pseudomonas sp.-rentzat. (anduiak: NCIB 9816-4, G7, AK-5, PMD-1 eta CSV86), Pseudomonas stutzeri AN10, Pseudomonas fluorescens PC20 eta beste andui batzuk (ND6 eta AS1) (Mahajan et al., 1994; Resnick et al., 1996; Annweiler et al., 2000; Basu et al., 2003; Dennis eta Zylstra, 2004; Sota et al., 2006; Metabolismoa osagai anitzeko dioxigenasa batek abiarazten du [naftaleno dioxigenasa (NDO), eraztun hidroxilatzaile dioxigenasa bat], naftalenoaren eraztun aromatikoetako baten oxidazioa katalizatzen duena oxigeno molekularra beste substratu gisa erabiliz, naftalenoa cis-naftalenodiol bihurtuz (3. irudia). Cis-dihidrodiola 1,2-dihidroxinaftaleno bihurtzen da deshidrogenasa baten bidez. A 1,2-dihidroxinaftaleno dioxigenasa (12DHNDO) eraztun-ebakidura dioxigenasak 1,2-dihidroxinaftalenoa 2-hidroxikromeno-2-karboxiliko azido bihurtzen du. Cis-trans isomerizazio entzimatikoak trans-o-hidroxibenzilidenopiruvatoa sortzen du, eta hau hidratasa aldolasak aldehido saliziliko eta piruvato bihurtzen du. Azido organiko piruvatoa naftalenoaren karbono-eskeletotik eratorritako lehen C3 konposatua izan zen eta bide zentralera bideratu zen karbono-bidera. Gainera, NAD+-menpeko salizilaldehido deshidrogenasak salizilaldehidoa azido saliziliko bihurtzen du. Fase honetako metabolismoari naftalenoaren degradazioaren "goiko bidea" deitzen zaio. Bide hau oso ohikoa da naftalenoa degradatzen duten bakterio gehienetan. Hala ere, badira salbuespen batzuk; adibidez, Bacillus hamburgii 2 termofilikoan, naftalenoaren degradazioa naftaleno 2,3-dioxigenasak hasten du osatzeko... 2,3-dihidroxinaftalenoa (Annweiler et al., 2000).
3. irudia. Naftalenoaren, metilnaftalenoaren, azido naftoikoaren eta karbarilaren degradazio-bideak. Zirkuludun zenbakiek naftalenoa eta bere deribatuak ondorengo produktuetan sekuentzialki bihurtzeaz arduratzen diren entzimak adierazten dituzte. 1 — naftaleno dioxigenasa (NDO); 2, cis-dihidrodiol deshidrogenasa; 3, 1,2-dihidroxinaftaleno dioxigenasa; 4, 2-hidroxikromeno-2-karboxiliko azido isomerasa; 5, trans-O-hidroxibenzilidenopirubato hidratasa aldolasa; 6, salizilaldehido deshidrogenasa; 7, salizilato 1-hidroxilasa; 8, katekol 2,3-dioxigenasa (C23DO); 9, 2-hidroximukonato semialdehido deshidrogenasa; 10, 2-oxopent-4-enoato hidratasa; 11, 4-hidroxi-2-oxopentanoato aldolasa; 12, azetaldehido deshidrogenasa; 13, katekol-1,2-dioxigenasa (C12DO); 14, mukonato zikloisomerasa; 15, mukonolaktona delta-isomerasa; 16, β-ketoadipatenolaktona hidrolasa; 17, β-ketoadipato sukzinil-CoA transferasa; 18, β-ketoadipato-CoA tiolasa; 19, sukzinil-CoA: azetil-CoA sukziniltransferasa; 20, salizilato 5-hidroxilasa; 21 – gentisato 1,2-dioxigenasa (GDO); 22, maleilpirubato isomerasa; 23, fumarilpirubato hidrolasa; 24, metilnaftaleno hidroxilasa (NDO); 25, hidroximetilnaftaleno deshidrogenasa; 26, naftaldehido deshidrogenasa; 27, 3-formilsaliziliko azido oxidasa; 28, hidroxiisoftalato dekarboxilasa; 29, karbaril hidrolasa (CH); 30, 1-naftol-2-hidroxilasa.
Organismoaren eta haren osaera genetikoaren arabera, sortzen den azido salizilikoa gehiago metabolizatzen da, katekol bidearen bidez salizilato 1-hidroxilasa (S1H) erabiliz edo gentisato bidearen bidez salizilato 5-hidroxilasa (S5H) erabiliz (3. irudia). Azido salizilikoa naftalenoaren metabolismoan bitartekari nagusia denez (goiko bidea), azido salizilikotik TCA bitartekarirako urratsak beheko bidea bezala ezagutzen dira askotan, eta geneak operon bakarrean antolatzen dira. Ohikoa da ikustea goiko bideko operoneko (nah) eta beheko bideko operoneko (sal) geneak faktore erregulatzaile komunek erregulatzen dituztela; adibidez, NahR-k eta azido salizilikoak induzitzaile gisa jokatzen dute, bi operonek naftalenoa guztiz metabolizatzea ahalbidetuz (Phale et al., 2019, 2020).
Gainera, katekola ziklikoki 2-hidroximukonato semialdehido bihurtzen da meta bidearen bidez katekol 2,3-dioxigenasak (C23DO) (Yen et al., 1988) eta gehiago hidrolizatzen da 2-hidroximukonato semialdehido hidrolasak 2-hidroxipent-2,4-dienoiko azidoa osatzeko. Ondoren, 2-hidroxipent-2,4-dienoatoa piruvato eta azetaldehido bihurtzen da hidratasa baten (2-oxopent-4-enoato hidratasa) eta aldolasa baten (4-hidroxi-2-oxopentanoato aldolasa) bidez eta gero karbono bide zentralera sartzen da (3. irudia). Bestela, katekola ziklikoki cis,cis-mukonato bihurtzen da orto bidearen bidez katekol 1,2-oxigenasak (C12DO) erabiliz. Mukonato zikloisomerasak, mukonolaktona isomerasak eta β-ketoadipato-nolaktona hidrolasak cis,cis-mukonatoa 3-oxoadipato bihurtzen dute, eta hau karbono bide zentralera sartzen da sukzinil-CoA eta azetil-CoA bidez (Nozaki et al., 1968) (3. irudia).
Gentisato (2,5-dihidroxibenzoato) bidean, eraztun aromatikoa gentisato 1,2-dioxigenasak (GDO) zatitzen du maleilpiruvatoa sortzeko. Produktu hau zuzenean hidroliza daiteke piruvato eta malato bihurtzeko, edo isomerizatu daiteke fumarilpiruvatoa sortzeko, eta ondoren piruvato eta fumarato bihur daiteke (Larkin eta Day, 1986). Bide alternatiboaren aukeraketa bakterio Gram-negatiboetan zein Gram-positiboetan ikusi da, maila biokimiko eta genetikoetan (Morawski et al., 1997; Whyte et al., 1997). Bakterio Gram-negatiboek (Pseudomonas) naftalenoaren metabolismoaren eragilea den azido salizilikoa erabiltzea nahiago dute, eta hau katekol bihurtzeko deskarboxilatu egiten dute salicilato 1-hidroxilasa erabiliz (Gibson eta Subramanian, 1984). Bestalde, bakterio Gram-positiboetan (Rhodococcus), salizilato 5-hidroxilasak azido salizilikoa azido jentisiko bihurtzen du, azido salizilikoak, berriz, ez du eragin induktiborik naftaleno geneen transkripzioan (Grund et al., 1992) (3. irudia).
Jakinarazi da Pseudomonas CSV86, Oceanobacterium NCE312, Marinhomonas naphthotrophicus, Sphingomonas paucimobilis 2322, Vibrio cyclotrophus, Pseudomonas fluorescens LP6a, Pseudomonas eta Mycobacterium espezieek monometilnaftalenoa edo dimetilnaftalenoa degrada dezaketela (Dean-Raymond eta Bartha, 1975; Cane eta Williams, 1982; Mahajan et al., 1994; Dutta et al., 1998; Hedlund et al., 1999). Horien artean, Pseudomonas sp. CSV86-ren 1-metilnaftaleno eta 2-metilnaftaleno degradazio bidea argi eta garbi aztertu da maila biokimiko eta entzimatikoan (Mahajan et al., 1994). 1-Metilnaftalenoa bi bideren bidez metabolizatzen da. Lehenik, eraztun aromatikoa hidroxilatu egiten da (metilnaftalenoaren ordezkatu gabeko eraztuna) cis-1,2-dihidroxi-1,2-dihidro-8-metilnaftalenoa osatzeko, eta hau metil salizilato eta metilkatekol bihurtzen da gehiago, eta gero karbono bide zentralera sartzen da eraztuna hautsi ondoren (3. irudia). Bide horri "karbono iturriaren bidea" deitzen zaio. Bigarren "desintoxikazio bidean", metil taldea NDO bidez hidroxilatu daiteke 1-hidroximetilnaftalenoa osatzeko, eta hau 1-nafto azido bihurtzen da gehiago eta hazkuntza ingurunera kanporatzen da produktu itsu gisa. Ikerketek erakutsi dute CSV86 anduia ez dela gai 1- eta 2-nafto azidoan hazteko karbono eta energia iturri bakar gisa, bere desintoxikazio bidea berretsiz (Mahajan et al., 1994; Basu et al., 2003). 2-metilnaftalenoan, metilo taldeak hidroxilazioa jasaten du hidroxilasaren bidez 2-hidroximetilnaftalenoa osatzeko. Horrez gain, naftaleno eraztunaren ordezkatu gabeko eraztunak eraztun hidroxilazioa jasaten du dihidrodiol bat osatzeko, eta hau 4-hidroximetilkatekol bihurtzen da entzimek katalizatutako erreakzioen serie batean eta bide zentralean sartzen da meta-eraztunaren zatiketa bidearen bidez. Era berean, S. paucimobilis 2322-k NDO erabiltzen zuela jakinarazi zen 2-metilnaftalenoa hidroxilatzeko, eta hau gehiago oxidatzen da metil salizilatoa eta metilkatekola osatzeko (Dutta et al., 1998).
Azido naftoikoak (ordezkatuak/ordezkatu gabeak) metilnaftalenoaren, fenantrenoaren eta antrazenoaren degradazioan sortzen diren desintoxikazio/bioeraldaketa azpiproduktuak dira, eta erabilitako hazkuntza-ingurunean askatzen dira. Jakinarazi da Stenotrophomonas maltophilia CSV89 lurzoruko isolatuak 1-naftoiko azidoa karbono-iturri gisa metabolizatzeko gai dela (Phale et al., 1995). Metabolismoa eraztun aromatikoaren dihidroxilazioarekin hasten da 1,2-dihidroxi-8-karboxinaftalenoa osatzeko. Sortzen den diola katekol bihurtzen da 2-hidroxi-3-karboxibenzilidenopirubatoaren, 3-formilsalizilikoaren, 2-hidroxiisoftalikoaren eta azido salizilikoaren bidez, eta karbono-bide zentralera sartzen da meta-eraztunaren zatiketa-bidearen bidez (3. irudia).
Karbariloa naftil karbamato pestizida bat da. 1970eko hamarkadan Indian Iraultza Berdea gertatu zenetik, ongarri eta pestizida kimikoen erabilerak nekazaritzako iturri ez-puntualetako hidrokarburo aromatiko poliziklikoen (HAP) isuriak handitzea ekarri du (Pingali, 2012; Duttagupta et al., 2020). Kalkulatzen da Indiako lur landuen % 55 inguru (85.722.000 hektarea) pestizida kimikoekin tratatzen dela. Azken bost urteetan (2015-2020), Indiako nekazaritza sektoreak batez beste 55.000 eta 60.000 tona pestizida erabili ditu urtean (Kooperatiben eta Nekazarien Ongizate Saila, Nekazaritza Ministerioa, Indiako Gobernua, 2020ko abuztua). Gangesko iparraldeko eta erdialdeko lautadetan (populazio eta biztanleria-dentsitate handiena duten estatuetan), pestiziden erabilera oso hedatuta dago laboreetan, intsektizidak nagusi direlarik. Karbaril (1-naftil-N-metilkarbamatoa) espektro zabaleko karbamato intsektizida bat da, toxikotasun ertaina edo handia duena, Indiako nekazaritzan erabiltzen dena, batez beste 100-110 tonako tasan. Sevin izen komertzialarekin saltzen da normalean eta hainbat laboreri (artoa, soja, kotoia, frutak eta barazkiak) eragiten dieten intsektuak (zorriak, su-inurriak, arkakusoak, akaroak, armiarmak eta beste hainbat kanpoko izurrite kontrolatzeko erabiltzen da. Mikroorganismo batzuk, hala nola Pseudomonas (NCIB 12042, 12043, C4, C5, C6, C7, Pseudomonas putida XWY-1), Rhodococcus (NCIB 12038), Sphingobacterium spp. (CF06), Burkholderia (C3), Micrococcus eta Arthrobacter, beste izurrite batzuk kontrolatzeko ere erabil daitezke. RC100-k karbariloa degrada dezakeela jakinarazi da (Larkin eta Day, 1986; Chapalamadugu eta Chaudhry, 1991; Hayatsu et al., 1999; Swetha eta Phale, 2005; Trivedi et al., 2017). Karbariloaren degradazio-bidea sakon aztertu da Pseudomonas sp.-ren C4, C5 eta C6 anduien lurzoruko isolatuetan (Swetha eta Phale, 2005; Trivedi et al., 2016) (3. irudia). Bide metabolikoa karbarilo hidrolasak (CH4) ester loturaren hidrolisiarekin hasten da, 1-naftola, metilamina eta karbono dioxidoa eratzeko. 1-naftola 1,2-dihidroxinaftaleno bihurtzen da 1-naftol hidroxilasaren (1-NH) bidez, eta hau gehiago metabolizatzen da karbono bide zentraletik salizilato eta gentisato bidez. Jakinarazi da karbaril degradatzen duten bakterio batzuek azido salizilikora metabolizatzen dutela katekol orto eraztuna hausteko (Larkin eta Day, 1986; Chapalamadugu eta Chaudhry, 1991). Aipagarria da naftaleno degradatzen duten bakterioek batez ere azido salizilikoa katekolaren bidez metabolizatzen dutela, karbaril degradatzen duten bakterioek, berriz, azido salizilikoa gentisato bidearen bidez metabolizatzea nahiago dutela.
Azido naftalensulfonikoa/azido disulfonikoa eta naftilaminasulfoniko azidoaren deribatuak azo koloratzaileen, hezetzaileen, dispertsatzaileen eta abarren ekoizpenean bitartekari gisa erabil daitezke. Konposatu hauek gizakientzat toxikotasun txikia duten arren, zitotoxikotasun ebaluazioek erakutsi dute hilgarriak direla arrainentzat, dafnientzat eta algentzat (Greim et al., 1994). Pseudomonas generoko ordezkariek (A3, C22 anduiak) metabolismoa abiarazten dutela jakinarazi da azido sulfonikoaren taldea duen eraztun aromatikoaren hidroxilazio bikoitzaren bidez, dihidrodiol bat osatzeko, eta hau, gainera, 1,2-dihidroxinaftaleno bihurtzen da sulfito taldearen haustura espontaneoaren bidez (Brilon et al., 1981). Sortzen den 1,2-dihidroxinaftalenoa naftaleno bide klasikoaren bidez katabolizatzen da, hau da, katekol edo gentisato bidearen bidez (4. irudia). Frogatu da aminonaftalenosulfonikoa eta hidroxinaftalenosulfonikoa erabat degrada daitezkeela bide kataboliko osagarriak dituzten bakterio-partzuergo mistoek (Nortemann et al., 1986). Frogatu da partzuergoko kide batek aminonaftalenosulfonikoa edo hidroxinaftalenosulfonikoa desulfuratzen duela 1,2-dioxigenazio bidez, eta aminosalizilatoa edo hidroxisalizilatoa, berriz, hazkuntza-ingurunera askatzen dela metabolito itsu gisa eta ondoren partzuergoko beste kideek xurgatzen dutela. Azido naftalenosulfonikoa nahiko polarra da, baina gutxi biodegradagarria da eta, beraz, bide desberdinen bidez metaboliza daiteke. Lehenengo desulfurazioa eraztun aromatikoaren eta azido sulfoniko taldearen dihidroxilazio erregioselektiboan gertatzen da; bigarren desulfurazioa 5-sulfosalizilikoaren hidroxilazioan gertatzen da azido saliziliko 5-hidroxilasaren bidez, azido gentisikoa sortzeko, eta hau karbono-bide zentralean sartzen da (Brilon et al., 1981) (4. irudia). Naftalenoaren degradazioaz arduratzen diren entzimak naftaleno sulfonatoaren metabolismoaz ere arduratzen dira (Brilon et al., 1981; Keck et al., 2006).
4. irudia. Naftaleno sulfonatoaren degradaziorako bide metabolikoak. Zirkuluen barruko zenbakiek naftil sulfonatoaren metabolismoaz arduratzen diren entzimak adierazten dituzte, 3. irudian deskribatutako entzimen antzekoak/berdinak.
Pisu molekular baxuko HAPak (LMW-HAP) erreduzigarriak, hidrofoboak eta gutxi disolbagarriak dira, eta, beraz, ez dira naturalki deskonposatzen/degradatzen. Hala ere, mikroorganismo aerobikoek oxidatu ditzakete oxigeno molekularra (O2) xurgatuz. Entzima hauek batez ere oxidorreduktasen klasekoak dira eta hainbat erreakzio egin ditzakete, hala nola eraztun aromatikoaren hidroxilazioa (mono- edo dihidroxilazioa), deshidrogenazioa eta eraztun aromatikoaren haustura. Erreakzio hauetatik lortutako produktuak oxidazio-egoera altuagoan daude eta errazago metabolizatzen dira karbono-bide zentraletik (Phale et al., 2020). Degradazio-bideko entzimak induzigarriak direla jakinarazi da. Entzima hauen jarduera oso baxua edo hutsala da zelulak glukosa edo azido organikoak bezalako karbono-iturri sinpleetan hazten direnean. 3. taulan naftalenoaren eta bere deribatuen metabolismoan parte hartzen duten hainbat entzima (oxigenasak, hidrolasak, deshidrogenasak, oxidasak, etab.) laburbiltzen dira.
3. taula. Naftalenoaren eta haren deribatuen degradazioaz arduratzen diren entzimen ezaugarri biokimikoak.
Erradioisotopoen ikerketek (18O2) erakutsi dute oxigenasen bidez O2 molekularra eraztun aromatikoetan sartzea dela konposatu baten biodegradazio gehiago aktibatzeko urrats garrantzitsuena (Hayaishi et al., 1955; Mason et al., 1955). Oxigeno molekularreko (O2) oxigeno atomo bat (O) substratura sartzea monooxigenasa endogeno edo exogenoek (hidroxilasak ere deituak) abiarazten dute. Beste oxigeno atomo bat uretara erreduzitzen da. Monooxigenasa exogenoek flabina murrizten dute NADH edo NADPHrekin, eta endomonooxigenasetan, berriz, substratuak flabina murrizten du. Hidroxilazioaren posizioak produktuen eraketan aniztasuna eragiten du. Adibidez, salizilato 1-hidroxilasak azido salizilikoa hidroxilatzen du C1 posizioan, katekola sortuz. Bestalde, osagai anitzeko salizilato 5-hidroxilasak (erreduktasa, ferredoxina eta oxigenasa azpiunitateak dituena) azido salizilikoa hidroxilatzen du C5 posizioan, azido gentisikoa sortuz (Yamamoto et al., 1965).
Dioxigenasek bi O2 atomo sartzen dituzte substratuan. Sortzen diren produktuen arabera, eraztun hidroxilatzaile dioxigenasak eta eraztun-ebakitzaile dioxigenasak banatzen dira. Eraztun hidroxilatzaile dioxigenasek substratu aromatikoak cis-dihidrodiol bihurtzen dituzte (adibidez, naftalenoa) eta bakterioen artean oso hedatuta daude. Gaur arte, frogatu da eraztun hidroxilatzaile dioxigenasak dituzten organismoak gai direla hainbat karbono iturri aromatikotan hazteko, eta entzima hauek NDO (naftalenoa), tolueno dioxigenasa (TDO, toluenoa) eta bifenil dioxigenasa (BPDO, bifeniloa) gisa sailkatzen dira. Bai NDOk bai BPDOk hainbat hidrokarburo aromatiko poliziklikoren (toluenoa, nitrotoluenoa, xilenoa, etilbentzenoa, naftalenoa, bifeniloa, fluorenoa, indola, metilnaftalenoa, naftalenosulfonatoa, fenantrenoa, antrazenoa, azetofenona, etab.) oxidazio bikoitza eta alboko kateen hidroxilazioa kataliza ditzakete (Boyd eta Sheldrake, 1998; Phale et al., 2020). NDO oxidorreduktasa batek, ferredoxina batek eta gune aktiboa duen oxigenasa osagai batek osatzen dute (Gibson eta Subramanian, 1984; Resnick et al., 1996). NDOren unitate katalitikoa α azpiunitate handi batek eta β azpiunitate txiki batek osatzen dute, α3β3 konfigurazioan antolatuta. NDO oxigenasa familia handi batekoa da eta bere α azpiunitateak Rieske gune bat [2Fe-2S] eta burdin mononuklear ez-hemiko bat ditu, eta horrek NDOren substratuaren espezifikotasuna zehazten du (Parales et al., 1998). Normalean, ziklo katalitiko batean, piridina nukleotidoaren erredukziotik bi elektroi transferitzen dira gune aktiboan dagoen Fe(II) ioira, erreduktasa, ferredoxina eta Rieske gune baten bidez. Erreduktore baliokideek oxigeno molekularra aktibatzen dute, eta hori substratuaren dihidroxilaziorako aurrebaldintza da (Ferraro et al., 2005). Gaur arte, NDO gutxi batzuk baino ez dira araztu eta karakterizatu xehetasunez andui desberdinetatik, eta naftalenoaren degradazioan parte hartzen duten bideen kontrol genetikoa xehetasunez aztertu da (Resnick et al., 1996; Parales et al., 1998; Karlsson et al., 2003). Eraztun-ebakidura duten dioxigenasek (endo- edo orto-eraztun-ebakidura duten entzimak eta exodiol- edo meta-eraztun-ebakidura duten entzimak) hidroxilatutako konposatu aromatikoetan eragiten dute. Adibidez, orto-eraztun-ebakidura duen dioxigenasa katekol-1,2-dioxigenasa da, eta meta-eraztun-ebakidura duen dioxigenasa, berriz, katekol-2,3-dioxigenasa (Kojima et al., 1961; Nozaki et al., 1968). Hainbat oxigenasaz gain, hainbat deshidrogenasa ere badaude, dihidrodiol, alkohol eta aldehido aromatikoen deshidrogenazioaz arduratzen direnak eta NAD+/NADP+ elektroi-hartzaile gisa erabiltzen dituztenak, metabolismoan parte hartzen duten entzima garrantzitsuenetako batzuk direnak (Gibson eta Subramanian, 1984; Shaw eta Harayama, 1990; Fahle et al., 2020).
Hidrolasak (esterasak, amidasak) bezalako entzimak bigarren entzima klase garrantzitsu bat dira, ura erabiltzen dutenak lotura kobalenteak hausteko eta substratuaren espezifikotasun zabala erakusten dutenak. Karbaril hidrolasa eta beste hidrolasa batzuk periplasmaren (mintz-transzendeko) osagaitzat hartzen dira Gram-negatiboko bakterioen kideetan (Kamini et al., 2018). Karbarilak amida eta ester lotura ditu; beraz, esterasa edo amidasa bidez hidroliza daiteke 1-naftola osatzeko. Rhizobium rhizobium AC10023 anduiko karbarilak eta Arthrobacter RC100 anduiko karbarilak esterasa eta amidasa gisa funtzionatzen dutela jakinarazi da, hurrenez hurren. Arthrobacter RC100 anduiko karbarilak ere amidasa gisa funtzionatzen du. RC100ak lau N-metilkarbamato klaseko intsektizida hidrolizatzen dituela frogatu da, hala nola karbaril, metomilo, azido mefenamikoa eta XMC (Hayaatsu et al., 2001). Jakinarazi zen Pseudomonas sp. C5pp-en CH-k karbarilaren (% 100eko jarduera) eta 1-naftil azetatoaren (% 36ko jarduera) gainean eragin dezakeela, baina ez 1-naftilazetamidaren gainean, esterasa bat dela adieraziz (Trivedi et al., 2016).
Ikerketa biokimikoek, entzimen erregulazio-ereduek eta analisi genetikoek erakutsi dute naftalenoaren degradazio-geneek bi unitate erregulatzaile edo "operon" induzigarri dituztela: nah ("gorako bidea", naftalenoa azido saliziliko bihurtzen duena) eta sal ("behera bidea", azido salizilikoa katekolaren bidez karbono-bide zentralera bihurtzen duena). Azido salizilikoa eta bere analogoak induzitzaile gisa joka dezakete (Shamsuzzaman eta Barnsley, 1974). Glukosa edo azido organikoen aurrean, operoia erreprimituta dago. 5. irudiak naftalenoaren degradazioaren antolaketa genetiko osoa erakusten du (operon forman). Nah genearen hainbat aldaera/forma izendatu (ndo/pah/dox) deskribatu dira eta sekuentzia-homologia handia (% 90) dutela ikusi da Pseudomonas espezie guztien artean (Abbasian et al., 2016). Naftalenoaren goiko bideko geneak, oro har, adostasun-ordenan antolatuta zeuden, 5A irudian erakusten den bezala. Beste gene bat, nahQ, naftalenoaren metabolismoan parte hartzen zuela ere jakinarazi zen, eta normalean nahC eta nahE artean kokatzen zen, baina bere benetako funtzioa argitu gabe dago oraindik. Era berean, naftalenoarekiko kimiotaxiaz arduratzen den nahY genea nah operoiaren mutur distalean aurkitu zen kide batzuetan. Ralstonia sp.-n, glutation S-transferasa (gsh) kodetzen duen U2 genea nahAa eta nahAb artean kokatuta zegoela aurkitu zen, baina ez zuen naftalenoaren erabileraren ezaugarrietan eraginik izan (Zylstra et al., 1997).
5. irudia. Bakterio espezieen artean naftalenoaren degradazioan zehar behatutako antolaketa eta aniztasun genetikoa; (A) Naftalenoaren goiko bidea, naftalenoaren metabolismoa azido salizilikora; (B) Naftalenoaren beheko bidea, azido salizilikoa katekol bidez karbono bide zentralera; (C) azido salizilikoa gentisato bidez karbono bide zentralera.
"Beheko bidea" (sal operona) normalean nahGTHINLMOKJ-z osatuta dago eta salizilatoa piruvato eta azetaldehido bihurtzen du katekol metatze-ebakidura bidearen bidez. nahG genea (salizilato hidroxilasa kodetzen duena) operoiaren mutur proximalean kontserbatuta dagoela ikusi da (5B irudia). Naftalenoa degradatzen duten beste andui batzuekin alderatuta, P. putida CSV86-n nah eta sal operonak tandemean daude eta oso erlazionatuta daude (7,5 kb inguru). Bakterio Gram-negatibo batzuetan, hala nola Ralstonia sp. U2, Polaromonas naphthalenivorans CJ2 eta P. putida AK5, naftalenoa karbono metabolito zentral gisa metabolizatzen da gentisato bidearen bidez (sgp/nag operon moduan). Gene-kasetea normalean nagAaGHAbAcAdBFCQEDJI forman irudikatzen da, non nagR (LysR motako erregulatzaile bat kodetzen duen) goiko muturrean kokatuta dagoen (5C irudia).
Karbariloa karbono-ziklo zentralean sartzen da 1-naftolaren, 1,2-dihidroxinaftalenoaren, azido salizilikoaren eta azido gentizikoaren metabolismoaren bidez (3. irudia). Ikerketa genetiko eta metabolikoetan oinarrituta, bide hau "gora" (karbariloa azido saliziliko bihurtzea), "erdikoa" (azido salizilikoa azido gentizikoa bihurtzea) eta "behera" (azido gentizikoa karbono-bide zentraleko bitartekari bihurtzea) bi zatitan banatzea proposatu da (Singh et al., 2013). C5pp-ren (supercontig A, 76.3 kb) analisi genomikoak agerian utzi zuen mcbACBDEF geneak karbariloa azido salizilikora bihurtzean parte hartzen duela, ondoren mcbIJKLk azido salizilikoa azido gentizikora bihurtzean, eta mcbOQPk azido gentizikoa karbono zentraleko bitartekarietara (fumaratoa eta piruvatoa, Trivedi et al., 2016) bihurtzean (6. irudia).
Jakinarazi da hidrokarburo aromatikoen (naftalenoa eta azido salizilikoa barne) degradazioan parte hartzen duten entzimak dagokien konposatuek induzitu eta glukosa edo azido organikoak bezalako karbono iturri sinpleek inhibitu ditzaketela (Shingler, 2003; Phale et al., 2019, 2020). Naftalenoaren eta bere deribatuen bide metabolikoen artean, naftalenoaren eta karbarilaren ezaugarri erregulatzaileak aztertu dira neurri batean. Naftalenoarentzat, bai bide goreneko bai beheko bideetako geneak NahR-k erregulatzen ditu, LysR motako trans-jarduten erregulatzaile positibo bat. Azido salizilikoak nah genea induzitzeko eta ondorengo adierazpen maila altua lortzeko beharrezkoa da (Yen eta Gunsalus, 1982). Gainera, ikerketek erakutsi dute ostalariaren faktore integratzailea (IHF) eta XylR (sigma 54-menpeko transkripzio erregulatzailea) ere funtsezkoak direla naftalenoaren metabolismoan geneen transkripzio aktibaziorako (Ramos et al., 1997). Ikerketek erakutsi dute katekol meta-eraztunaren irekitze bideko entzimak, hain zuzen ere katekol 2,3-dioxigenasa, naftalenoaren eta/edo azido salizilikoaren presentzian induzitzen direla (Basu et al., 2006). Ikerketek erakutsi dute katekol orto-eraztunaren irekitze bideko entzimak, hain zuzen ere katekol 1,2-dioxigenasa, azido bentzoikoaren eta cis,cis-mukonatoaren presentzian induzitzen direla (Parsek et al., 1994; Tover et al., 2001).
C5pp anduian, bost genek, mcbG, mcbH, mcbN, mcbR eta mcbS-k, karbariloen degradazioa kontrolatzeaz arduratzen diren transkripzio-erregulatzaileen LysR/TetR familiako erregulatzaileak kodetzen dituzte. McbG gene homologoa Burkholderia RP00725-en fenantrenoaren metabolismoan parte hartzen duen LysR motako PhnS erregulatzailearekin (% 58ko aminoazido identitatea) erlazionatuta dagoela ikusi zen (Trivedi et al., 2016). McbH genea tarteko bidean (azido salizilikoa azido gentiziko bihurtzea) parte hartzen duela ikusi zen eta Pseudomonas eta Burkholderia-en LysR motako NagR/DntR/NahR transkripzio-erregulatzaileari dagokio. Familia honetako kideek azido salizilikoa degradazio-geneen indukziorako molekula efektore espezifiko gisa ezagutzen dutela jakinarazi da. Bestalde, LysR eta TetR motako transkripzio-erreguladoreei dagozkien hiru gene, mcbN, mcbR eta mcbS, identifikatu ziren bide behekoan (gentisato-karbono bide zentraleko metabolitoak).
Prokariotoetan, plasmidoen, transposoien, profagoen, uharte genomikoen eta elementu konjugatzaile integratzaileen (ICE) bidezko geneen transferentzia horizontalaren prozesuak (eskuratzea, trukea edo transferentzia) bakterioen genomaren plastizitatearen arrazoi nagusiak dira, funtzio/ezaugarri espezifikoen irabazia edo galera eraginez. Horri esker, bakterioek ingurumen-baldintza desberdinetara azkar egokitzen dira, ostalariarentzako abantaila metaboliko egokitzaile potentzialak eskainiz, hala nola konposatu aromatikoen degradazioa. Aldaketa metabolikoak askotan degradazio-operonen, haien mekanismo erregulatzaileen eta entzimen espezifikotasunen doikuntza finaren bidez lortzen dira, eta horrek konposatu aromatiko sorta zabalago baten degradazioa errazten du (Nojiri et al., 2004; Phale et al., 2019, 2020). Naftalenoaren degradaziorako gene-kaseteak hainbat elementu mugikortan daudela ikusi da, hala nola plasmidoetan (konjugatzaileak eta ez-konjugatzaileak), transposoietan, genometan, ICEetan eta bakterio-espezie desberdinen konbinazioetan (5. irudia). Pseudomonas G7-n, NAH7 plasmidoaren nah eta sal operoiak orientazio berean transkribatzen dira eta mobilizaziorako Tn4653 transposasa behar duen transposoi akastun baten parte dira (Sota et al., 2006). Pseudomonas NCIB9816-4 anduian, genea pDTG1 plasmido konjugatiboan aurkitu zen bi operoi gisa (gutxi gorabehera 15 kb-ko distantziarekin) kontrako norabideetan transkribatu zirenak (Dennis eta Zylstra, 2004). Pseudomonas putida AK5 anduian, pAK5 plasmido ez-konjugatiboak naftalenoaren degradazioaren arduradun den entzima kodetzen du gentisato bidearen bidez (Izmalkova et al., 2013). Pseudomonas PMD-1 anduian, nah operoia kromosoman dago, sal operoia, berriz, pMWD-1 plasmido konjugatiboan (Zuniga et al., 1981). Hala ere, Pseudomonas stutzeri AN10-n, naftalenoaren degradazio-gene guztiak (nah eta sal operoiak) kromosoman daude eta, seguruenik, transposizio, birkonbinazio eta birmoldaketa gertaeren bidez errekrutatzen dira (Bosch et al., 2000). Pseudomonas sp. CSV86-n, nah eta sal operoiak genoman daude ICE (ICECSV86) moduan. Egitura tRNAGly-k babesten du, eta ondoren birkonbinazio/eranskin guneak adierazten dituzten errepikapen zuzenak (attR eta attL) eta tRNAGly-ren bi muturretan kokatutako fago itxurako integrasa bat daude, beraz, egituraz ICEclc elementuaren antzekoa da (ICEclcB13 Pseudomonas knackmusii-n klorokokatekol degradaziorako). Jakinarazi da ICEko geneak konjugazio bidez transferi daitezkeela transferentzia-maiztasun oso baxuarekin (10-8), eta horrela degradazio-propietateak hartzaileari transferitzen dizkiotela (Basu eta Phale, 2008; Phale et al., 2019).
Karbariloaren degradazioaren arduradun diren gene gehienak plasmidoetan daude. Arthrobacter sp. RC100-k hiru plasmido ditu (pRC1, pRC2 eta pRC300), eta horietatik bi plasmido konjugatibo, pRC1 eta pRC2, karbariloa gentisato bihurtzen duten entzimak kodetzen dituzte. Bestalde, gentisatoa karbono metabolito zentraletan bihurtzean parte hartzen duten entzimak kromosoman daude (Hayaatsu et al., 1999). Rhizobium generoko bakterioak. AC100 anduiak, karbariloa 1-naftol bihurtzeko erabiltzen denak, pAC200 plasmidoa dauka, eta honek CH kodetzen duen cehA genea darama, Tnceh transposoiaren parte gisa, txertatze elementuen antzeko sekuentziek (istA eta istB) inguratuta (Hashimoto et al., 2002). Sphingomonas CF06 anduian, karbaril degradazio-genea bost plasmidotan dagoela uste da: pCF01, pCF02, pCF03, pCF04 eta pCF05. Plasmido hauen DNA homologia handia da, geneen bikoizketa gertaera baten existentzia adieraziz (Feng et al., 1997). Bi Pseudomonas espeziek osatutako karbaril degradatzen duen sinbionte batean, 50581 anduiak mcd karbaril hidrolasa genea kodetzen duen pCD1 plasmido konjugatiboa (50 kb) dauka, eta 50552 anduiko plasmido konjugatiboak 1-naftol degradatzen duen entzima bat kodetzen du (Chapalamadugu eta Chaudhry, 1991). Achromobacter WM111 anduian, mcd furadan hidrolasa genea 100 kb-ko plasmido batean dago (pPDL11). Gene hau plasmido desberdinetan (100, 105, 115 edo 124 kb) agertzen dela frogatu da, eskualde geografiko desberdinetako bakterio desberdinetan (Parekh et al., 1995). Pseudomonas sp. C5pp-en, karbariloaren degradazioaz arduratzen diren gene guztiak 76,3 kb-ko sekuentzia duen genoma batean daude (Trivedi et al., 2016). Genomaren analisiak (6,15 Mb) 42 MGE eta 36 GEI agerian utzi zituen, eta horietatik 17 MGE A superkontigean zeuden (76,3 kb), batez besteko G+C eduki asimetrikoarekin (% 54-60 mol), geneen transferentzia horizontalaren gertakari posibleak iradokiz (Trivedi et al., 2016). P. putida XWY-1-ek karbariloaren degradazio-geneen antzeko antolamendua erakusten du, baina gene hauek plasmido batean daude (Zhu et al., 2019).
Maila biokimiko eta genomikoko eraginkortasun metabolikoaz gain, mikroorganismoek beste propietate edo erantzun batzuk ere erakusten dituzte, hala nola kimiotaxia, zelula gainazalaren aldaketa propietateak, konpartimentazioa, lehentasunezko erabilera, biosurfaktanteen ekoizpena, etab., kutsatutako inguruneetan kutsatzaile aromatikoak eraginkorrago metabolizatzen laguntzen dietenak (7. irudia).
7. irudia. Kutsatzaile arrotzen biodegradazio eraginkorrerako hidrokarburo aromatikoak degradatzen dituzten bakterio idealen erantzun zelularren estrategia desberdinak.
Kimiotaksia erantzunak kutsatzaile organikoen degradazioa areagotzen duten faktoretzat hartzen dira ekosistema heterogeneoki kutsatuetan. (2002) ikerketak frogatu zuen Pseudomonas sp. G7-ren naftalenoarekiko kimiotaxiak naftalenoaren degradazio-tasa handitu zuela sistema akuatikoetan. G7 andui basatiak naftalenoa askoz azkarrago degradatu zuen kimiotaxia gabeko andui mutante batek baino. NahY proteina (mintz-topologia duten 538 aminoazido) NAH7 plasmidoko metakleo-bideko geneekin batera transkribatuta zegoela ikusi zen, eta kimiotaxia-transduktoreak bezala, proteina honek naftalenoaren degradaziorako kimiohartzaile gisa funtzionatzen duela dirudi (Grimm eta Harwood 1997). Hansel et al.-ek (2009) egindako beste ikerketa batek erakutsi zuen proteina kimiotaktikoa dela, baina bere degradazio-tasa altua dela. (2011) ikerketak Pseudomonas-en (P. putida) erantzun kimiotaktikoa frogatu zuen naftaleno gaseosoarekiko, non gas-faseko difusioak naftalenoaren fluxu etengabea eragiten zuen zeluletara, eta horrek zelulen erantzun kimiotaktikoa kontrolatzen zuen. Ikertzaileek kimiotaktika-portaera hau erabili zuten degradazio-tasa areagotuko zuten mikrobioak diseinatzeko. Ikerketek erakutsi dute kimiosentsore-bideek beste zelula-funtzio batzuk ere erregulatzen dituztela, hala nola zelulen zatiketa, zelula-zikloaren erregulazioa eta biofilmen eraketa, eta horrela degradazio-tasa kontrolatzen laguntzen dutela. Hala ere, propietate hau (kimiotaxia) degradazio eraginkorrerako aprobetxatzea hainbat oztopo daude. Oztopo nagusiak hauek dira: (a) hartzaile paralogo desberdinek konposatu/ligando berdinak ezagutzen dituzte; (b) hartzaile alternatiboen existentzia, hau da, tropismo energetikoa; (c) hartzaile-familia bereko domeinu sentsorialetan sekuentzia-desberdintasun esanguratsuak; eta (d) bakterioen sentsore-proteina nagusiei buruzko informazio falta (Ortega et al., 2017; Martin-Mora et al., 2018). Batzuetan, hidrokarburo aromatikoen biodegradazioak metabolito/tarteko anitz sortzen ditu, eta horiek bakterio-talde batentzat kimiotaktikoak izan daitezke, baina besteentzat nazkagarriak, prozesua are gehiago konplikatuz. Ligandoen (hidrokarburo aromatikoen) eta hartzaile kimikoen arteko elkarrekintzak identifikatzeko, sentsore-proteina hibridoak (PcaY, McfR eta NahY) eraiki genituen Pseudomonas putida eta Escherichia coli-ren sentsore- eta seinaleztapen-domeinuak fusionatuz, eta hauek azido aromatikoen, TCA bitartekarien eta naftalenoaren hartzaileak dituzte helburu, hurrenez hurren (Luu et al., 2019).
Naftalenoaren eta beste hidrokarburo aromatiko poliziklikoen (HAP) eraginpean, bakterioen mintzaren egiturak eta mikroorganismoen osotasunak aldaketa nabarmenak jasaten dituzte. Ikerketek erakutsi dute naftalenak azil-katearen interakzioan interakzio hidrofoboen bidez eragiten duela, eta horrela mintzaren hantura eta jariakortasuna handitzen dituela (Sikkema et al., 1995). Efektu kaltegarri horri aurre egiteko, bakterioek mintzaren jariakortasuna erregulatzen dute iso/anteiso adar-kateetako gantz-azidoen arteko erlazioa eta gantz-azidoen konposizioa aldatuz eta cis-gantz-azido asegabeak dagokien trans-isomeroetan isomerizatuz (Heipieper eta de Bont, 1994). Naftaleno tratamenduan hazitako Pseudomonas stutzerin, gantz-azido saturatuen eta asegabeen arteko erlazioa 1,1etik 2,1era igo zen, eta Pseudomonas JS150n, berriz, erlazio hori 7,5etik 12,0ra igo zen (Mrozik et al., 2004). Naftalenoan hazi zirenean, Achromobacter KAs 3-5 zelulek naftaleno kristalen inguruan zelula-agregazioa eta zelula-gainazaleko kargaren jaitsiera erakutsi zuten (-22,5etik -2,5 mV-ra), zitoplasmaren kondentsazio eta bakuolizazioarekin batera, zelulen egituran eta zelulen gainazaleko propietateetan izandako aldaketak adieraziz (Mohapatra et al., 2019). Zelula/gainazaleko aldaketak zuzenean lotuta dauden arren kutsatzaile aromatikoen xurgapen hobeagoarekin, bioingeniaritza estrategia garrantzitsuak ez dira guztiz optimizatu. Zelulen formaren manipulazioa gutxitan erabili da prozesu biologikoak optimizatzeko (Volke eta Nikel, 2018). Zelulen zatiketa eragiten duten geneen ezabatzeak zelulen morfologian aldaketak eragiten ditu. Zelulaen zatiketa eragiten duten geneen ezabatzeak zelulen morfologian aldaketak eragiten ditu. Bacillus subtilis-en, zelulen septumaren SepF proteina septumaren eraketan parte hartzen duela frogatu da eta zelulen zatiketaren ondorengo urratsetarako beharrezkoa da, baina ez da gene esentziala. Bacillus subtilis-en peptido glikano hidrolasak kodetzen dituzten geneak ezabatzeak zelulen luzapena, hazkunde-tasa espezifikoa handitzea eta entzimen ekoizpen-ahalmena hobetzea eragin zuen (Cui et al., 2018).
Karbariloaren degradazio-bidearen konpartimentazioa proposatu da Pseudomonas C5pp eta C7 anduien degradazio eraginkorra lortzeko (Kamini et al., 2018). Proposatzen da karbariloa periplasmako espaziora garraiatzen dela kanpoko mintzeko septumaren bidez eta/edo porina difusorien bidez. CH periplasmako entzima bat da, karbariloaren hidrolisia 1-naftol bihurtzeko katalizatzen duena, hau egonkorragoa, hidrofoboagoa eta toxikoagoa baita. CH periplasman lokalizatzen da eta afinitate txikia du karbariloarekiko, horrela 1-naftolaren eraketa kontrolatuz, horrela zeluletan metatzea eragotziz eta zelulengan duen toxikotasuna murriztuz (Kamini et al., 2018). Sortzen den 1-naftola zitoplasmara garraiatzen da barneko mintzaren bidez, partizioaren eta/edo difusioaren bidez, eta ondoren 1NH afinitate handiko entzimak 1,2-dihidroxinaftaleno bihurtzeko hidroxilatzen da karbono-bide zentralean metabolismo gehiago izateko.
Mikroorganismoek xenobiotiko karbono iturriak degradatzeko gaitasun genetikoak eta metabolikoak badituzte ere, haien erabileraren egitura hierarkikoa (hau da, karbono iturri sinpleen lehentasuna konplexuen gainetik erabiltzea) oztopo nagusia da biodegradaziorako. Karbono iturri sinpleen presentziak eta erabilerak PAHak bezalako karbono iturri konplexuak/ez-lehentasunezkoak degradatzen dituzten entzimak kodetzen dituzten geneak gutxitzen ditu. Adibide ondo aztertu bat da glukosa eta laktosa Escherichia coli-ri batera ematen zaizkionean, glukosa laktosa baino eraginkorrago erabiltzen dela (Jacob eta Monod, 1965). Jakinarazi da Pseudomonasek hainbat PAH eta konposatu xenobiotiko degradatzen dituela karbono iturri gisa. Pseudomonasen karbono iturrien erabileraren hierarkia azido organikoak > glukosa > konposatu aromatikoak da (Hylemon eta Phibbs, 1972; Collier et al., 1996). Hala ere, badago salbuespen bat. Interesgarria da, Pseudomonas sp. CSV86-k egitura hierarkiko berezia erakusten du, hidrokarburo aromatikoak (azido bentzoikoa, naftalenoa, etab.) lehentasunez erabiltzen dituena glukosa baino, eta hidrokarburo aromatikoak azido organikoekin batera metabolizatzen dituena (Basu et al., 2006). Bakterio honetan, hidrokarburo aromatikoen degradazio eta garraiorako geneak ez dira gutxitzen, glukosa edo azido organikoak bezalako bigarren karbono iturri baten aurrean ere. Glukosa eta hidrokarburo aromatikoen ingurunean hazi zirenean, ikusi zen glukosaren garraio eta metabolismorako geneak gutxitzen zirela, hidrokarburo aromatikoak lehenengo fase logaritmikoan erabili zirela eta glukosa bigarren fase logaritmikoan erabili zela (Basu et al., 2006; Choudhary et al., 2017). Bestalde, azido organikoen presentziak ez zuen eraginik izan hidrokarburo aromatikoen metabolismoaren adierazpenean, beraz, bakterio hau biodegradazio ikerketetarako hautagai anduia izatea espero da (Phale et al., 2020).
Jakina da hidrokarburoen bioeraldaketak estres oxidatiboa eta antioxidatzaileen entzimen gorakada eragin ditzakeela mikroorganismoetan. Naftalenoaren biodegradazio ez-eraginkorrak, bai fase geldikorreko zeluletan, bai konposatu toxikoen aurrean, oxigeno espezie erreaktiboen (ROS) eraketa dakar (Kang et al. 2006). Naftalenoa degradatzen duten entzimek burdin-sufre multzoak dituztenez, estres oxidatibopean, hemoaren eta burdin-sufre proteinen burdina oxidatu egingo da, eta horrek proteinen inaktibazioa eragingo du. Ferredoxina-NADP+ erreduktasak (Fpr), superoxido dismutasarekin (SOD) batera, NADP+/NADPH eta ferredoxina edo flavodoxina bi molekulen arteko erredukzio erreakzio itzulgarria bitartekatzen du, horrela ROSak deuseztatuz eta burdin-sufre zentroa leheneratuz estres oxidatibopean (Li et al. 2006). Jakinarazi da Pseudomonas-en Fpr eta SodA (SOD) estres oxidatiboak eragin ditzakeela, eta SOD eta katalasa jarduera handituak ikusi dira lau Pseudomonas anduitan (O1, W1, As1 eta G1) naftalenoa gehitutako baldintzetan hazkuntzan zehar (Kang et al., 2006). Ikerketek erakutsi dute azido askorbikoa edo burdin ferrosoa (Fe2+) bezalako antioxidatzaileak gehitzeak naftalenoaren hazkunde-tasa handitu dezakeela. Rhodococcus erythropolis naftaleno ingurunean hazi zenean, estres oxidatiboarekin lotutako zitokromo P450 geneen transkripzioa handitu egin zen, besteak beste, sodA (Fe/Mn superoxido dismutasa), sodC (Cu/Zn superoxido dismutasa) eta recA (Sazykin et al., 2019). Naftalenoan hazitako Pseudomonas zelulen proteomika-analisi kuantitatibo konparatiboak erakutsi zuen estres oxidatiboaren erantzunarekin lotutako hainbat proteinen goranzko erregulazioa estresari aurre egiteko estrategia bat dela (Herbst et al., 2013).
Mikroorganismoek biosurfaktanteak sortzen dituztela jakinarazi da karbono hidrofobo iturrien eraginpean. Surfaktante hauek gainazaleko konposatu anfifilikoak dira, olio-ura edo aire-ura interfazeetan agregatuak sor ditzaketenak. Horrek pseudo-disolbagarritasuna sustatzen du eta hidrokarburo aromatikoen adsorzioa errazten du, biodegradazio eraginkorra lortuz (Rahman et al., 2002). Propietate horiei esker, biosurfaktanteak asko erabiltzen dira hainbat industriatan. Surfaktante kimikoak edo biosurfaktanteak bakterioen kulturei gehitzeak hidrokarburoen degradazioaren eraginkortasuna eta abiadura hobetu ditzake. Biosurfaktanteen artean, Pseudomonas aeruginosa-k sortutako ramnolipidoak sakonki aztertu eta karakterizatu dira (Hisatsuka et al., 1971; Rahman et al., 2002). Gainera, beste biosurfaktante mota batzuk lipopeptidoak (Pseudomonas fluorescens-eko muzinak), 378 emultsionatzailea (Pseudomonas fluorescens-etik) (Rosenberg eta Ron, 1999), Rhodococcus-eko trehalosa disakarido lipidoak (Ramdahl, 1985), Bacillus-eko likenina (Saraswathy eta Hallberg, 2002), eta Bacillus subtilis-eko (Siegmund eta Wagner, 1991) eta Bacillus amyloliquefaciens-eko (Zhi et al., 2017) surfaktanteak dira. Surfaktante indartsu hauek gainazaleko tentsioa 72 dina/cm-tik 30 dina/cm baino gutxiagora murrizten dutela frogatu da, hidrokarburoen xurgapen hobea ahalbidetuz. Jakinarazi da Pseudomonas, Bacillus, Rhodococcus, Burkholderia eta beste bakterio espezie batzuek ramnolipido eta glikolipidoetan oinarritutako biosurfaktante ugari sor ditzaketela naftaleno eta metilnaftaleno inguruneetan hazten direnean (Kanga et al., 1997; Puntus et al., 2005). Pseudomonas maltophilia CSV89-k Biosur-Pm biosurfaktante estrazelularra sor dezake azido naftoikoa bezalako konposatu aromatikoetan hazten denean (Phale et al., 1995). Biosur-Pm-ren eraketaren zinetikak erakutsi zuen bere sintesia hazkuntzaren eta pH-aren araberako prozesua dela. Ikusi zen pH neutroan zelulek sortutako Biosur-Pm kantitatea 8,5eko pH-an baino handiagoa zela. 8,5ean hazitako zelulak hidrofobikoagoak ziren eta afinitate handiagoa zuten konposatu aromatiko eta alifatikoekiko 7,0ean hazitako zelulek baino. Rhodococcus spp.-n... N6, karbono-nitrogeno (C:N) erlazio handiagoa eta burdinaren muga dira zelulaz kanpoko biosurfaktanteen ekoizpenerako baldintza optimoak (Mutalik et al., 2008). Biosurfaktanteen (surfaktinen) biosintesia hobetzeko ahaleginak egin dira, anduiak eta hartzidura optimizatuz. Hala ere, hazkuntza-ingurunean dagoen surfaktantearen titulua baxua da (1,0 g/L), eta horrek erronka bat dakar eskala handiko ekoizpenerako (Jiao et al., 2017; Wu et al., 2019). Hori dela eta, ingeniaritza genetikoaren metodoak erabili dira bere biosintesia hobetzeko. Hala ere, bere ingeniaritza-aldaketa zaila da operoiaren tamaina handiagatik (∼25 kb) eta quorum sensing sistemaren erregulazio biosintetiko konplexuagatik (Jiao et al., 2017; Wu et al., 2019). Hainbat aldaketa genetiko egin dira Bacillus bakterioetan, batez ere surfaktina ekoizpena handitzeko helburuarekin, sustatzailea (srfA operona) ordezkatuz, YerP surfaktina esportazio proteina eta ComX eta PhrC faktore erregulatzaileak gehiegi adieraziz (Jiao et al., 2017). Hala ere, ingeniaritza genetikoko metodo hauek aldaketa genetiko bat edo gutxi batzuk baino ez dituzte lortu eta oraindik ez dira ekoizpen komertzialera iritsi. Beraz, beharrezkoa da ezagutzan oinarritutako optimizazio metodoen azterketa gehiago egitea.
PAHen biodegradazio-azterketak batez ere laborategiko baldintza estandarretan egiten dira. Hala ere, kutsatutako guneetan edo kutsatutako inguruneetan, faktore abiotiko eta biotiko askok (tenperatura, pHa, oxigenoa, mantenugaien erabilgarritasuna, substratuaren bioerabilgarritasuna, beste xenobiotiko batzuk, azken produktuen inhibizioa, etab.) mikroorganismoen degradazio-ahalmena aldatzen eta eragiten dutela frogatu da.
Tenperaturak eragin nabarmena du PAHen biodegradazioan. Tenperatura igotzen den heinean, oxigeno disolbatuaren kontzentrazioa gutxitzen da, eta horrek mikroorganismo aerobikoen metabolismoan eragiten du, oxigeno molekularra behar baitute hidroxilazio edo eraztun-haustura erreakzioak egiten dituzten oxigenasen substratuetako bat bezala. Askotan aipatzen da tenperatura altuak jatorrizko PAHak konposatu toxikoago bihurtzen dituela, eta horrela biodegradazioa inhibitzen duela (Muller et al., 1998).
Ohartu da PAH kutsatutako gune askok pH balio muturrekoak dituztela, hala nola meategietako drainatze azidoaren bidezko gune kutsatuak (pH 1-4) eta lixibiatu alkalinoekin kutsatutako gas naturalaren/ikatzaren gasifikazio guneak (pH 8-12). Baldintza hauek biodegradazio prozesuan eragin handia izan dezakete. Beraz, mikroorganismoak biorremediaziorako erabili aurretik, gomendatzen da pHa doitzea produktu kimiko egokiak gehituz (oxidazio-erredukzio potentzial ertaina edo oso baxua dutenak), hala nola amonio sulfatoa edo amonio nitratoa lurzoru alkalinoetarako edo kaltzio karbonatoarekin edo magnesio karbonatoarekin kareztatzea gune azidoetarako (Bowlen et al. 1995; Gupta eta Sar 2020).
Kaltetutako eremurako oxigeno-hornikuntza da PAHen biodegradazioaren abiadura mugatzen duen faktorea. Ingurunearen erredox baldintzak direla eta, in situ biorremediazio prozesuek normalean kanpoko iturrietatik oxigenoa sartzea eskatzen dute (lantzea, aire-zipriztinak eta produktu kimikoen gehikuntza) (Pardieck et al., 1992). Odenkranz et al. (1996) frogatu zuten magnesio peroxidoa (oxigenoa askatzen duen konposatua) akuifero kutsatu bati gehitzeak BTEX konposatuak eraginkortasunez biorremediatu zitzakeela. Beste ikerketa batek fenolaren eta BTEXaren in situ degradazioa ikertu zuen akuifero kutsatu batean, sodio nitratoa injektatuz eta erauzketa-putzuak eraikiz biorremediazio eraginkorra lortzeko (Bewley eta Webb, 2001).