Oraingo *Oraingo helbidea: Kolonia 50931, Alemania, Koloniako Bikaintasun Klusterra Zahartzearekin Lotutako Gaixotasunetan Estres Zelularraren Erantzunari buruz (CECAD).
Mitokondrioen gaixotasunen neuroendekapena itzulezintzat hartzen da, neuronen plastizitate metabolikoa mugatua delako, baina mitokondrioen disfuntzioak gorputzeko neuronen metabolismoaren zelulen autonomian duen eragina ez da ondo ulertzen. Hemen, Purkinje neuronen zelula-espezifiko proteoma aurkezten dugu, mitokondrioen fusio-dinamika etenek eragindako OXPHOS gabezia progresiboa dutenak. Ikusi genuen mitokondrioen disfuntzioak aldaketa sakona eragin zuela proteomikaren arloan, eta horrek, azken finean, zelulen heriotzaren aurretik programa metaboliko zehatzen aktibazio sekuentziala ekarri zuela. Ustekabean, piruvato karboxilasaren (PCx) eta TCA zikloaren bitartekariak osatzen dituzten zahartzearen aurkako beste entzima batzuen indukzio agerikoa zehaztu genuen. PCx-aren inhibizioak estres oxidatiboa eta neuroendekapena areagotu zituen, eta horrek adierazten du aterosklerosiak babes-efektua duela OXPHOS gabeko neuronetan. Neurona endekatuetan mitokondrioen fusioaren berrezarpenak erabat alderantzikatzen ditu ezaugarri metaboliko horiek, eta horrela zelulen heriotza eragozten du. Gure aurkikuntzek mitokondrioen disfuntzioarekiko erresilientzia ematen duten bide ezezagunak identifikatzen dituzte, eta erakusten dute neuroendekapena alderantzikatu daitekeela gaixotasunaren azken faseetan ere.
Mitokondrioen zeregin nagusia neuronen energia-metabolismoa mantentzeko orduan azpimarratzen da gizakien mitokondrio-gaixotasunekin lotutako sintoma neurologiko zabalek. Gaixotasun horietako gehienak mitokondrioen geneen adierazpena erregulatzen duten gene-mutazioek (1, 2) edo mitokondrioen dinamikarekin lotutako geneen suntsipenak eragiten dituzte, eta horrek zeharka eragiten du mitokondrio-DNAren (mtDNA) egonkortasunean (3, 4). Animalia-ereduetan egindako lanek erakutsi dute inguruko ehunen mitokondrioen disfuntzioari erantzunez, bide metaboliko kontserbadoreak (5-7) aktibatu daitezkeela, eta horrek informazio garrantzitsua ematen du gaixotasun konplexu hauen patogenesia sakon ulertzeko. Aldiz, funtsezkoa da garuneko mitokondrioen adenosina trifosfatoaren (ATP) ekoizpenaren porrot orokorrak eragindako zelula mota espezifikoen aldaketa metabolikoen ulermena (8), eta horrek gaixotasunak prebenitzeko edo prebenitzeko erabil daitezkeen helburu terapeutikoak identifikatzeko beharra azpimarratzen du. Neuroendekapena prebenitzea (9). Informazio falta nerbio-zelulek inguruko ehunen zelula motekin alderatuta malgutasun metaboliko oso mugatua dutela uste delako da (10). Zelula hauek neuronei metabolitoen hornidura koordinatzen funtsezko zeregina betetzen dutenez, transmisio sinaptikoa sustatzeko eta lesio eta gaixotasun baldintzei erantzuteko, zelulen metabolismoa garuneko ehunaren baldintza zailetara egokitzeko gaitasuna ia glia-zeluletara mugatzen da (11-14). Gainera, garuneko ehunaren berezko zelulen heterogeneotasunak neurona-aztalburu espezifikoetan gertatzen diren aldaketa metabolikoen azterketa oztopatzen du neurri handi batean. Ondorioz, gutxi dakigu neuronen mitokondrioen disfuntzioaren ondorio zelular eta metaboliko zehatzei buruz.
Mitokondrioen disfuntzioaren ondorio metabolikoak ulertzeko, Purkinje neuronak (PN) isolatu genituen mitokondrioen kanpoko mintzaren fusioaren (Mfn2) suntsipenak eragindako neuroendekapenaren fase desberdinetan. Gizakietan Mfn2 mutazioak Charcot-Marie-Tooth 2A motako (15) neuropatia sentsorial motor hereditario mota batekin lotuta dauden arren, saguetan Mfn2-ren suntsipen baldintzatua oxidazio-fosforilazioaren (OXPHOS) disfuntzioaren indukzio-metodo ezaguna da. Neurona azpimota desberdinak (16-19) eta ondoriozko fenotipo neurodegeneratiboa sintoma neurologiko progresiboekin batera doaz, hala nola mugimendu-nahasmenduak (18, 19) edo zerebeloko ataxia (16). Etiketarik gabeko proteomika kuantitatibo (LFQ), metabolomika, irudigintza eta metodo birologikoen konbinazio bat erabiliz, erakusten dugu neuroendekapen progresiboak piruvato karboxilasa (PCx) eta PNen arteriosklerosia in vivo eragiten duela. Entzimen adierazpena. Aurkikuntza honen garrantzia egiaztatzeko, PCx-ren adierazpena gutxitu genuen Mfn2 gabezia duten PNetan, eta ikusi genuen eragiketa honek estres oxidatiboa areagotu eta neuroendekapena bizkortu zuela, horrela frogatuz azoospermiak zelulen heriotza ematen duela. Egokitzapen metabolikoa. MFN2-ren adierazpen larriek OXPHOS gabezia larria, mitokondrio-DNAren kontsumo masiboa eta itxuraz hautsitako mitokondrio-sarearekin lotutako endekapen terminaleko PN erabat erreskatatu dezakete, eta horrek are gehiago azpimarratzen du neuroendekapen mota hau gaixotasunaren fase aurreratuan ere berreskura daitekeela zelulen heriotza baino lehen.
Mfn2 knockout PN-etan mitokondrioak bistaratzeko, Cre-menpeko mitokondrioei proteina fluoreszente horiaren (YFP) (mtYFP) (20) Cre espresioa bideratzeko aukera ematen dien sagu-andui bat erabili genuen eta mitokondrioen morfologia in vivo egiaztatu genuen. Ikusi genuen PN-etan Mfn2 genearen suntsipenak mitokondrio-sarearen zatiketa mailakatua eragiten zuela (S1A irudia), eta aldaketa goiztiarrena 3 asteko adinarekin aurkitu zela. Aitzitik, PN zelula-geruzaren endekapen nabarmena, Kalbindina immunomarkaketaren galerak frogatzen duen bezala, ez zen 12 asteko adinarekin arte hasi (1. irudia, A eta B). Mitokondrioen morfologian izandako aldaketen lehen aldiko aldaketen eta neurona-heriotzaren hasiera ikusgaiaren arteko denbora-desadostasunak bultzatu gintuen zelulen heriotzaren aurretik mitokondrioen disfuntzioak eragindako aldaketa metabolikoak ikertzera. YFP (YFP+) adierazten duten PN isolatzeko fluoreszentziaz aktibatutako zelula-sortketa ​​(FACS) oinarritutako estrategia bat garatu dugu (1C irudia), eta kontrol-saguetan (Mfn2+ / loxP :: mtYFP loxP- stop-loxP: : L7-cre), hemendik aurrera CTRL (S1B irudia) aipatuko duguna. YFP seinalearen intentsitate erlatiboan oinarritutako ate-estrategiaren optimizazioak PN-en YFP+ gorputza (YFPhigh) PN ez direnetatik (YFPneg) (S1B irudia) edo ustezko axoi/dendrito fluoreszenteen zatietatik (YFPlow; S1D irudia, ezkerrean) purifikatzea ahalbidetzen digu, mikroskopio konfokal bidez baieztatuta (S1D irudia, eskuinean). Sailkatutako populazioaren identitatea egiaztatzeko, LFQ proteomika eta ondoren osagai nagusien analisia egin ditugu, eta YFPhigh eta YFPneg zelulen artean bereizketa argia dagoela ikusi dugu (S1C irudia). YFPhigh zelulek PN markatzaile ezagunen aberastasun garbia erakutsi zuten (hau da, Calb1, Pcp2, Grid2 eta Itpr3) (21, 22), baina ez neuronetan edo beste zelula mota batzuetan adierazitako proteinen aberastasunik (1D irudia). Esperimentu independenteetan bildutako YFPhigh zelula sailkatuen laginen arteko konparaketa batek > 0,9ko korrelazio koefizientea erakutsi zuen, errepikapen biologikoen arteko erreproduzigarritasun ona erakutsiz (S1E irudia). Laburbilduz, datu hauek PN bideragarriaren isolamendu akutu eta espezifikorako gure plana balioztatu zuten. Erabilitako L7-cre gidari sistemak mosaiko birkonbinazioa eragiten duenez erditzearen ondorengo lehen astean (23), saguak CTRLtik eta baldintzapeko (Mfn2 loxP / loxP :: mtYFP loxP-stop-loxP :: L7-cre) neuronak biltzen hasi ginen. Birkonbinazioa amaitutakoan, Mfn2cKO deitzen zaio 4 asteko adinarekin. Amaierako puntu gisa, 8 asteko adina aukeratu genuen, PN geruza osorik zegoenean, mitokondrioen zatiketa agerikoa izan arren (1B irudia eta S1A irudia). Guztira, 3013 proteina kuantifikatu genituen, eta horietatik % 22 inguru MitoCarta 2.0 anotazioetan oinarrituta zeuden, mitokondrio proteoman oinarritutakoak mitokondrio gisa (1E irudia) (1E irudia) (24). 8. astean egindako geneen espresio diferentzialaren analisiak erakutsi zuen proteina guztien % 10,5ek bakarrik izan zituztela aldaketa esanguratsuak (1F irudia eta S1F irudia), eta horietatik 195 proteina beherantz erregulatu ziren eta 120 proteina goranzko erregulatu (1F irudia). Aipatzekoa da datu multzo honen "bide berritzaileen analisiak" erakusten duela modu desberdinean adierazitako geneak batez ere bide metaboliko espezifiko multzo mugatu bati dagozkiola (1G irudia). Interesgarria da, OXPHOS eta kaltzio seinaleztapenarekin lotutako bideen beheranzko erregulazioak fusio-gabezia duten PNetan mitokondrioen disfuntzioaren indukzioa baieztatzen badu ere, aminoazidoen metabolismoa batez ere inplikatzen duten beste kategoria batzuk nabarmen goranzko erregulatuta daudela, eta hori bat dator mitokondrio PNetan gertatzen den metabolismoarekin. Birkableatzea koherentea da. disfuntzioa.
(A) CTRL eta Mfn2cKO saguen zerebelo-sekzioen argazki konfokal adierazgarriak, PNen galera progresiboa erakusten dutenak (kalbindina, grisa); nukleoak DAPIrekin kontra-tindu ziren. (B) (A)-ren kuantifikazioa (bariantza-analisi unidirekzionala, ***P<0,001; n = 4tik 6ra zirkulu hiru saguetatik). (C) Esperimentu-fluxua. (D) Purkinje-ri (goian) eta beste zelula mota batzuei (erdian) dagozkien markatzaileen bero-maparen banaketa. (E) Sailkatutako PN-an identifikatutako mitokondrio-proteinen kopurua erakusten duen Venn diagrama. (F) Mfn2cKO neuronetan modu desberdinean adierazitako proteinen sumendi-diagrama 8 astetan (1,3ko esangura-muga-balioa). (G) Sormen-bideen analisiak 8 astetan sailkatutako Mfn2cKO PN-an goranzko (gorria) eta beheranzko (urdina) bost bide garrantzitsuenak erakusten ditu. Detektatutako proteina bakoitzaren batez besteko adierazpen-maila erakusten da. Gris-eskalako bero-mapa: doitutako P balioa. ns, ez da garrantzitsua.
Proteomika datuek erakutsi zuten I, III eta IV konplexuen proteinen adierazpena pixkanaka gutxitu zela. I, III eta IV konplexuek guztiek mtDNA kodetutako azpiunitate esentzialak zituzten, eta II konplexua, nukleoan kodetua soilik zena, funtsean ez zen aldatu (2A eta S2A irudia). Proteomika emaitzekin bat etorriz, zerebelo-ehunaren sekzioen immunohistokimikak erakutsi zuen PN-ko IV konplexuaren MTCO1 (mitokondrio-zitokromo C oxidasa azpiunitate 1) azpiunitatearen maila pixkanaka gutxitu zela (2B irudia). Mtatp8 mtDNA kodetutako azpiunitatea nabarmen murriztu zen (S2A irudia), eta nukleoan kodetutako ATP sintasa azpiunitatearen egoera egonkorreko maila aldatu gabe mantendu zen, eta hori bat dator mtDNAren adierazpena egonkorra denean ATP sintasa azpimultzo F1 konplexu egonkorrarekin. Eraketa koherentea da. Etenaldia (7). Mfn2cKO PN ordenatuetan denbora errealeko polimerasa-kate-erreakzio bidez (qPCR) mtDNA mailaren ebaluazioak mtDNA kopia kopuruaren pixkanakako jaitsiera baieztatu zuen. Kontrol-taldearekin alderatuta, 8 asteko adinarekin, mtDNA mailaren % 20 inguru baino ez zen mantendu (2C irudia). Emaitza hauekin bat etorriz, Mfn2cKO PN-en mikroskopia konfokaleko tindaketa erabili zen DNA detektatzeko, mitokondrio-nukleotidoen denboraren araberako kontsumoa erakutsiz (2D irudia). Ikusi genuen mitokondrio-proteinen degradazioan eta estres-erantzunean parte hartzen duten hautagai batzuk bakarrik zeudela gora-erregulatuta, besteak beste, Lonp1, Afg3l2 eta Clpx, eta OXPHOS konplexuaren muntaketa-faktoreak. Apoptosian parte hartzen duten proteinen mailetan ez zen aldaketa esanguratsurik detektatu (S2B irudia). Era berean, ikusi genuen kaltzio-garraioan parte hartzen duten mitokondrio eta erretikulu endoplasmatikoaren kanalek aldaketa txikiak baino ez dituztela izan (S2C irudia). Gainera, autofagiarekin lotutako proteinen ebaluazioak ez zuen aldaketa esanguratsurik aurkitu, eta hori bat dator immunohistokimika eta mikroskopia elektronikoaren bidez in vivo behatutako autofagosomen indukzio ikusgarriarekin (S3 irudia). Hala ere, PN-etan OXPHOS disfuntzio progresiboa mitokondrioen aldaketa ultraestruktural nabarmenekin batera doa. Mitokondrio multzoak 5 eta 8 asteko Mfn2cKO PN-en zelula-gorputzetan eta zuhaitz dendritikoetan ikus daitezke, eta barne-mintzaren egiturak aldaketa sakonak jasan ditu (S4 irudia, A eta B). Aldaketa ultraestruktural hauekin eta mtDNAren jaitsiera nabarmenarekin bat etorriz, tetrametilrodamina metil esterrarekin (TMRM) egindako garuneko zerebelo-xerra akutuen analisiak erakutsi zuen Mfn2cKO PN-en mitokondrioen mintz-potentziala nabarmen murriztu zela (S4C irudia).
(A) OXPHOS konplexuaren adierazpen-mailaren denbora-analisia. P<0,05 duten proteinak bakarrik kontuan hartu 8 astetan (bi norabideko ANOVA). Lerro puntuatua: Ez dago doikuntzarik CTRLrekin alderatuta. (B) Ezkerrean: MTCO1 aurkako antigorputzarekin markatutako zerebelo-sekzio baten adibidea (eskala-barra, 20 μm). Purkinje zelulen gorputzek okupatutako eremua horiz estalita dago. Eskuinean: MTCO1 mailen kuantifikazioa (bariantzaren analisi unidirekzionala; n = 7tik 20ra bitarteko zelula aztertuak hiru saguetatik). (C) mtDNA kopia-zenbakiaren qPCR analisia ordenatutako PN-an (bariantzaren analisi unidirekzionala; n = 3tik 7ra bitarteko saguak). (D) Ezkerrean: DNA aurkako antigorputz batekin markatutako zerebelo-xerra baten adibidea (eskala-barra, 20 μm). Purkinje zelulen gorputzek okupatutako eremua horiz estalita dago. Eskuinean: mtDNA lesioen kuantifikazioa (bariantzaren analisi unidirekzionala; n = 5etik 9ra bitarteko zelula hiru saguetatik). (E) Zelula osoko patch clamp grabazio batean mitoYFP + Purkinje zelulak (gezia) erakusten dituen zerebelo-sekzio akutu baten adibidea. (F) IV kurbaren kuantifikazioa. (G) CTRL eta Mfn2cKO Purkinje zeluletan despolarizatzaile-korrontearen injekzioaren grabazio adierazgarriak. Goiko traza: AP eragin zuen lehen pultsua. Beheko traza: AP maiztasun maximoa. (H) Sarrera espontaneo postsinaptikoen (sPSP) kuantifikazioa. Grabazio-traza adierazgarria eta bere zoom-erlazioa (I)n ageri dira. Bariantzaren analisi unidirekzionala, hiru saguetatik n = 5etik 20ra aztertu zen. Datuak batez besteko ± SEM gisa adierazten dira; *P<0,05; **P<0,01; ***P<0,001. (J) Patch clamp zulatu modua erabiliz grabatutako AP espontaneoaren traza adierazgarriak. Goiko traza: AP maiztasun maximoa. Beheko traza: AP bakar baten zooma. (K) Kuantifikatu AP maiztasun batez bestekoa eta maximoa (J)ren arabera. Mann-Whitney testa; n = 5 zelula aztertu ziren lau saguetatik. Datuak batez besteko ± SEM gisa adierazten dira; ez dira garrantzitsuak.
OXPHOS kalte agerikoa detektatu zen 8 asteko Mfn2cKO PN-an, eta horrek adierazten du neuronen funtzio fisiologikoa oso anormala dela. Hori dela eta, OXPHOS gabezia duten neuronen ezaugarri elektriko pasiboak aztertu genituen 4 eta 5 aste artean eta 7 eta 8 aste artean, zelula osoko adabaki-klampa grabazioak eginez zerebelo-xerra akutuetan (2E irudia). Ustekabean, Mfn2cKO neuronen batez besteko atseden-mintz potentziala eta sarrera-erresistentzia kontrol-taldearen antzekoak ziren, nahiz eta zelulen artean desberdintasun sotilak egon (1. taula). Era berean, 4 eta 5 asteko adinarekin, ez zen korronte-tentsio erlazioan (IV kurba) aldaketa esanguratsurik aurkitu (2F irudia). Hala ere, 7 eta 8 asteko Mfn2cKO neuronak ez zuen IV erregimenaren (hiperpolarizazio-urratsa) bizirik iraun, eta horrek adierazten du hiperpolarizazio-potentzialarekiko sentikortasun argia dagoela fase berantiar honetan. Aitzitik, Mfn2cKO neuronetan, ekintza-potentzial errepikakorraren (AP) deskargak eragiten dituzten despolarizazio-korronteak ondo jasaten dira, eta horrek adierazten du haien deskarga-eredu orokorrak ez direla nabarmen desberdinak 8 asteko kontrol-neuronenekin alderatuta (1. taula eta 2G irudia). Era berean, korronte postsinaptiko espontaneoen (sPSC) maiztasuna eta anplitudea kontrol-taldekoekin konparagarriak izan ziren, eta gertaeren maiztasuna 4 astetik 5 astera eta 7 astetik 8 astera igo zen, antzeko igoerarekin (2. irudia, H eta I). ​​PN-etan sinapsi-heldutasun aldia (25). Antzeko emaitzak lortu ziren PN-en adabaki zulatuen ondoren. Konfigurazio honek zelulen ATP akatsen balizko konpentsazioa eragozten du, zelula osoko adabaki-klampa grabazioan gerta litekeen bezala. Bereziki, Mfn2cKO neuronen atseden-mintzeko potentziala eta askapen-maiztasun espontaneoa ez ziren eragin (2. irudia, J eta K). Laburbilduz, emaitza hauek adierazten dute OXPHOS disfuntzio agerikoa duten PNek maiztasun handiko deskarga-ereduei ondo aurre egin diezaieketela, eta horrek adierazten du konpentsazio-mekanismo bat dagoela, ia normalak diren erantzun elektrofisiologikoak mantentzeko aukera ematen diena.
Datuak batez besteko ± SEM gisa adierazten dira (bariantza-analisi unidirekzionala, Holm-Sidak-en konparazio anitzeko testa; *P<0,05). Unitate-zenbakia parentesi artean adierazten da.
Proteomika datu-multzoko (1G irudia) kategoriaren batek OXPHOS gabezia larria konpentsatu dezaketen bideak barne hartzen dituen ikertzeari ekin genion, eta horrela azaldu genuen zergatik PN kaltetuak ia elektrofisiologia normala mantendu dezakeen (2. irudia, E-tik K-ra). Proteomikaren analisiak erakutsi zuen kate adarkatuko aminoazidoen (BCAA) katabolismoan parte hartzen duten entzimak nabarmen erregulatuta zeudela (3A irudia eta S5A irudia), eta azken produktua den azetil-CoA (CoA) edo sukzinil CoA-k trikarboxilatoak osatu ditzakeela arteriosklerosia azidoaren (TCA) zikloan. Ikusi genuen BCAA transaminasa 1 (BCAT1) eta BCAT2-ren edukia handitu zela. BCAA katabolismoaren lehen urratsa katalizatzen dute α-ketoglutaratotik glutamatoa sortuz (26). Adar-katea duen keto azido deshidrogenasa (BCKD) konplexua osatzen duten azpiunitate guztiak goranzko erregulazioan daude (konplexuak ondoriozko BCAA karbono-eskeletoaren ondorengo eta itzulezin den deskarboxilazioa katalizatzen du) (3A eta S5A irudiak). Hala ere, ez zen BCAA beraren aldaketa nabarmenik aurkitu ordenatutako PN-etan, eta hori aminoazido esentzial horien zelulen xurgapen handiagoaren edo TCA zikloa osatzeko beste iturri batzuen (glukosa edo azido laktikoa) erabileraren ondorio izan daiteke (S5B irudia). OXPHOS gabeko PN-ek glutaminaren deskonposizio eta transaminazio jarduera handiagoak ere erakutsi zituzten 8 asteko adinarekin, eta hori mitokondrioen glutaminasa (GLS) eta glutamina pirubato transaminasa 2 (GPT2) entzimen goranzko erregulazioak islatu dezake (3. irudia, A eta C). Aipatzekoa da GLS-ren erregulazio positiboa glutaminasa C isoforma empalmatura mugatzen dela (Mfn2cKO/CTRL-ren aldaketa gutxi gorabehera 4,5 aldiz handiagoa da, P = 0,05), eta minbizi-ehunetan duen erregulazio positiboak mitokondrioen bioenergia lagun dezakeela. (27).
(A) Bero-mapak proteina-mailaren aldaketa erakusten du zehaztutako biderako 8 astetan. (B) PCx aurkako antigorputzarekin markatutako zerebelo-xerra baten adibidea (eskala-barra, 20 μm). Gezi horiak Purkinje zelula-gorputzera seinalatzen du. (C) Denbora-ibilbideko proteinen adierazpen-analisia aterosklerosiarako hautagai garrantzitsu gisa identifikatua (t-proba anizkoitza, *FDR <%5; n = 3-5 sagu). (D) Goian: [1-13C]piruvato trazadorean dagoen karbono markatuan sartzeko modu desberdinak erakusten dituen eskema-diagrama bat (hau da, PDH edo bide transarterialaren bidez). Behean: Biolin-diagramak azido aspartiko, azido zitriko eta azido maliko bihurtutako markatu bakarreko karbonoaren (M1) ehunekoa erakusten du, zerebelo-xerra akutuak [1-13C]piruvatoarekin markatu ondoren (t-proba parekatua; ** P <0,01). (E) Adierazitako bidearen denbora-historiaren analisi osoa. P<0,05 duten proteinak bakarrik kontuan hartu 8 astetan. Lerro etena: doikuntza-baliorik ez (bariantza-analisi bi-noranzkoa; * P <0,05; *** P <0,001). Datuak batez besteko ± SEM gisa adierazten dira.
Gure analisian, BCAA katabolismoa erregulazio bide nagusietako bat bihurtu da. Gertakari honek iradokitzen du TCA zikloan sartzen den aireztapen bolumena alda daitekeela OXPHOS gabeko PN-etan. Baliteke neuronen metabolismoaren birkableatze mota garrantzitsu bat izatea, eta horrek eragin zuzena izan dezake neuronen fisiologian eta biziraupenean OXPHOS disfuntzio larria mantentzen den bitartean. Hipotesi honekin bat etorriz, aurkitu genuen PCx entzima antiaterosklerotiko nagusia erregulatuta dagoela (Mfn2cKO/CTRL gutxi gorabehera 1,5 aldiz aldatzen da; 3A irudia), eta horrek piruvatoa oxaloazetato bihurtzea katalizatzen du (28), eta uste da hori garuneko ehunean dagoela. -ren adierazpena astrozitoetara mugatzen da (29, 30). Proteomikaren emaitzekin bat etorriz, mikroskopia konfokalak erakutsi zuen PCx adierazpena espezifikoki eta nabarmen handitzen zela OXPHOS gabeko PN-etan, PCx erreaktibotasuna, berriz, kontrol-taldeko Bergmann glia-zelulen ondokoetara mugatzen zela batez ere (3B irudia). PCx-ren goranzko erregulazio funtzionala probatzeko, zerebelo-xerra akutuak [1-13C]piruvato trazadorearekin tratatu genituen. Piruvatoa piruvato deshidrogenasak (PDH) oxidatzen zuenean, bere isotopo-etiketa desagertu egiten zen, baina TCA zikloaren bitartekarietan sartzen da piruvatoa erreakzio baskularren bidez metabolizatzen denean (3D irudia). Gure proteomika-datuei laguntzeko, trazadore honetako markatzaile ugari ikusi genituen Mfn2cKO xerren azido aspartikoan, azido zitrikoak eta azido malikoak ere joera moderatua izan zuten bitartean, nahiz eta ez esanguratsua izan (3D irudia).
MitoPark saguen dopamina neuronetan, dopamina neuronek mitokondrioen transkripzio faktorearen A genea (Tfam) suntsitzen dutelako mitokondrioen disfuntzioa dutenetan (S6B irudia), PCx espresioa ere nabarmen handitu zen (31), eta horrek adierazten du azetona azidoaren arteriosklerosia. Gaixotasunaren agerpena gorputzeko OXPHOS neuronalaren disfuntzioan zehar erregulatzen dela. Aipatzekoa da aurkitu dela arteriosklerosiarekin lotuta egon daitezkeen neuronetan adieraz daitezkeen entzima bereziak (32-34) nabarmen handitu direla OXPHOSik ez duten PNetan, hala nola propionil-CoA karboxilasa (PCC-A), Malonil-CoAk propionil-CoA sukzinil-CoA bihurtzen du eta mitokondrioen malia entzima 3 (ME3), zeinaren funtzio nagusia piruvatoa malatotik berreskuratzea den (3. irudia, A eta C) (33, 35). Gainera, Pdk3 entziman igoera nabarmena aurkitu genuen, zeinak PDH fosforilatzen eta, beraz, inaktibatzen duen (36), baina ez zen aldaketarik detektatu PDH aktibatzen duen Pdp1 entziman edo PDH entzima konplexuan bertan (3A irudia). Mern2cKO PN-etan, Ser293-n (PDHren entzima-jarduera inhibitzen duela ezagutzen dena) PDH konplexuaren piruvato deshidrogenasa E1 osagaiaren α1 azpiunitate α (PDHE1α) azpiunitatearen fosforilazioa areagotu egin zen (S6C irudia) (S6C irudia). Piruvatoak ez du sarbide baskularrik.
Azkenik, ikusi genuen serina eta glizinaren biosintesiaren superbidea, erlazionatutako mitokondrio-folatoaren (1C) zikloa eta prolinaren biosintesia (1G eta S5C irudia) nabarmen erregulatzen direla aktibazio-prozesuan zehar. Inguruko ehunak aktibatzen dira mitokondrioen disfuntzioarekin (5-7). Proteomika-datu hauek babesten dituen analisi konfokalak erakutsi zuen OXPHOS falta den PN-an, 8 asteko saguen zerebeloko xerra serina hidroximetiltransferasa 2 (SHMT2) jasan zutela, mitokondrio-folatoaren zikloko entzima gako bat. Erantzun immunologiko esanguratsua (S5D irudia). CU-glukosarekin inkubatutako 13 zerebeloko xerra akutuetan, trazabilitate metabolikoaren esperimentuek serina eta prolina biosintesiaren erregulazio gorakorra berretsi zuten, eta horrek adierazten du karbono isoformen fluxua serina eta prolinara handitu zela (S5E irudia). GLS eta GPT2-k sustatutako erreakzioak glutamatoaren sintesiaren eta glutamatoaren eta α-ketoglutaratoaren arteko transaminazioaren arduradunak direnez, haien erregulazio positiboak adierazten du OXPHOS gabezia duten neuronek glutamatoaren eskaria handitu egiten dutela. Honek prolinaren biosintesiaren igoera mantentzea izan dezake helburu (S5C irudia). Aldaketa horien aldean, PN espezifikoen Mfn2cKO saguen zerebelo-astrozitoen analisi proteomiko batek erakutsi zuen bide hauek (antiperoxidasa guztiak barne) ez zirela adierazpenean nabarmen aldatzen, eta horrek erakusten du birbideratze metaboliko hau selektiboa dela degradatutako PNarekiko (S6 irudia, D-tik G-ra).
Laburbilduz, analisi hauek PN-etan bide metaboliko espezifikoen aktibazio tenporalaren eredu nabarmen desberdinak agerian utzi zituzten. Neuronen mitokondrioen funtzio anormalak aterosklerosia goiztiarra eta 1C birmoldaketa ekar ditzakeen arren (3E irudia eta S5C irudia), eta baita I eta IV konplexuen adierazpenean aurreikus daitezkeen aldaketak ere, serina de novo sintesian izandako aldaketak OXPHOS disfuntzioa (3E irudia eta S5C irudia) baino ez dira agertzen. Aurkikuntza hauek estresak eragindako mitokondrioek (1C zikloa) eta zitoplasmak (serinaren biosintesia) TCA zikloan aterosklerosiaren igoerarekin sinergikoki erantzuten duten prozesu sekuentzial bat definitzen dute metabolismo neuronala birmoldatzeko.
8 asteko OXPHOS gabezia duten PNek maiztasun handiko kitzikapen-jarduera mantendu eta birkonexio metaboliko esanguratsua jasan dezakete mitokondrioen disfuntzioa konpentsatzeko. Aurkikuntza honek aukera interesgarri bat sortzen du: une honetan ere, zelula hauek neuroendekapena atzeratzeko edo saihesteko esku-hartze terapeutikoa jaso dezakete. Berandu. Aukera hau bi esku-hartze independenteren bidez konpondu genuen. Lehenengo metodoan, Cre-menpeko adeno-elkartutako birus (AAV) bektore bat diseinatu genuen, MFN2 selektiboki adierazi ahal izateko OXPHOS gabezia duten PNetan in vivo (S7A irudia). MFN2 kodetzen duen AAV eta mCherry erreportari-gene fluoreszentea (Mfn2-AAV) in vitro neurona-kulturetan egiaztatu ziren, eta horrek MFN2 Cre-menpeko moduan adieraztea eragin zuen eta mitokondrioen morfologia erreskatatu zuen, horrela Mfn2cKO neuronen neuromutazioa eragotziz (S7, B, D eta E irudiak). Ondoren, in vivo esperimentuak egin genituen 8 asteko Mfn2-AAV estereotaktikoki Mfn2cKO eta kontrol saguen zerebeloko kortexera eramateko, eta 12 asteko saguak aztertu genituen (4A irudia). Tratatutako Mfn2cKO saguak hil ziren (1. irudia, A eta B) (16). In vivo birusen transdukzioak PNren adierazpen selektiboa eragin zuen zerebeloko zirkulu batzuetan (S7, G eta H irudia). mCherry bakarrik adierazten zuen kontrol AAVaren injekzioak (Ctrl-AAV) ez zuen eragin nabarmenik izan Mfn2cKO animalien neuroendekapen mailan. Aitzitik, Mfn2-AAVrekin transduzitutako Mfn2cKOen analisiak PN zelula geruzaren efektu babesle nabarmena erakutsi zuen (4. irudia, B eta C). Bereziki, neuronen dentsitatea ia bereizezina dirudi kontrol animaliekin alderatuta (4. irudia, B eta C, eta S7, H eta I irudia). MFN1-en adierazpena, baina ez MFN2-ren adierazpena, berdin eraginkorra da neuronen heriotza salbatzeko (4C irudia eta S7, C eta F irudia), eta horrek adierazten du MFN1 ektopikoaren adierazpenak MFN2-ren gabezia eraginkortasunez osatu dezakeela. PN maila bakarreko analisi gehiagok erakutsi zuen Mfn2-AAV-k mitokondrioen ultraegitura neurri handi batean erreskatatu zuela, mtDNA mailak normalizatu zituela eta PCx ​​angiogenesiaren aurkako markatzailearen adierazpen handia alderantzikatu zuela (4. irudia, C-tik E-ra). Atseden egoeran zeuden Mfn2cKO saguen ikuskapen bisualak erakutsi zuen haien jarrera eta sintoma motorrak (S1-etik S3-ra mugimendua) hobetu zirela. Ondorioz, esperimentu hauek erakusten dute OXPHOS-en gabezia larria duten PNetan MFN2 atzeratzea nahikoa dela mtDNAren kontsumoa alderantzikatzeko eta aterosklerosia eragiteko, horrela axoien endekapena eta neuronen heriotza in vivo saihestuz.
(A) Adierazitako bide metabolikoa aktibatzen denean MFN2 kodetzen duen AAV injektatzeko esperimentu-egutegia erakusten duen eskema. (B) Mfn2cKO saguetan 8 astetan transduzitutako eta Kalbindina aurkako antigorputzarekin markatutako 12 asteko zerebelo-xerren irudi konfokal adierazgarriak. Eskuinean: Axoi-zuntzen eskalatzea. Axoi-zoomaren eskala 450 eta 75 μm da. (C) Ezkerrean: Purkinje zelulen dentsitatearen kuantifikazioa AAV transdukzio-begiztan (AAV+) (bariantza-analisi unidirekzionala; n = 3 sagu). Eskuinean: mtDNA foku-analisia PN transduzituan 12. astean (parekatu gabeko t-testa; n = 6 zelula hiru saguetatik). * P <0,05; ** P <0,01. (D) Adierazitako birus-bektoreekin transduzitutako Mfn2cKO zerebelo-sekzioen PNen transmisio-mikrografia elektroniko adierazgarriak. Maskara arrosak dendritek okupatutako eremua erakusten du, eta karratu puntudun horiak eskuinean ematen den zooma erakusten du; n-k nukleoa adierazten du. Eskala-barra, 1 μm. (E)-k 12 astetan transduzitutako PN-n PCx tindaketaren adibide bat erakusten du. Eskala-barra, 20 μm. OE, gehiegizko adierazpena; FC, tolestura-aldaketa.
Azkenik, OXPHOS disfuntzioa izan duten PNetan peroxidasak eragindako zelulen biziraupenaren garrantzia ikertu genuen. AAV-shRNA (ile-pintza laburreko RNA) kodetzen duen mCherry sortu genuen, PCx mRNA (AAV-shPCx) espezifikoki zuzenduta, eta birusa edo bere kontrol nahasia (AAV-scr) Mfn2cKO saguen zerebeloan injektatu genuen. Injekzioa laugarren astean egin zen (5A irudia) PCx-aren ezabatze eraginkorra lortzeko, PCx-aren adierazpena handitzen zen garaian (3C irudia) eta PN zelula-geruza oraindik osorik zegoenean (1A irudia). Aipatzekoa da PCx-aren ezabatzeak (S8A irudia) PN heriotzaren azelerazio nabarmena dakarrela, eta hori infektatutako eraztunera mugatzen dela (5, B eta C irudia). PCx-ren goranzko erregulazioak eragindako efektu metabolikoen mekanismoa ulertzeko, PN-en erredox egoera aztertu genuen PCx-ren knockdown-aren ondoren eta AAV-k bitartekatutako Grx1-roGFP2 biosentsore optikoa aldi berean adierazi ondoren (S8 irudia, B-tik D-ra) glutatione peptidoen erredox potentzialaren aldaketa erlatiboa ebaluatzeko (38). Ondoren, bi fotoiko fluoreszentzia bizitza osoko irudien mikroskopia (FLIM) egin genuen 7 asteko Mfn2cKO-ren edo kontrol-kumeen garuneko xerra akutuetan, FLIM baldintzak egiaztatu ondoren zitoplasmako erredox egoeraren balizko aldaketak detektatzeko (S8 irudia, E-tik G-ra). Analisiak PCx adierazpenik gabeko Mfn2cKO PN bakar baten oxidazio-egoeran igoera nabarmena erakutsi zuen, eta hori desberdina da kontrol-neuronekin edo shRNA nahasia soilik adierazten duten Mfn2cKO PN-ekin alderatuta (5. irudia, D eta E). PCx espresioa gutxitu zenean, egoera oso oxidatua erakusten zuten Mfn2cKO PN-en ehunekoa hirukoiztu baino gehiago handitu zen (5E irudia), eta horrek adierazten du PCx-aren goranzko erregulazioak neurona endekatuen erredox gaitasuna mantentzen zuela.
(A) Adierazitako bide metabolikoa aktibatzen denean shPCx kodetzen duen AAV injektatzeko esperimentu-egutegia erakusten duen eskema. (B) 4 astetan kaltzinoinaren aurkako antigorputzarekin transduzitu eta markatutako Mfn2cKO saguen 8 asteko zerebelo-sekzioen argazki konfokal adierazgarriak. Eskala-barra, 450 μm. (C) Purkinje zelulen dentsitatearen kuantifikazioa AAV-k transduzitutako begiztetan (bariantza-analisi unidirekzionala; n = 3 eta 4 sagu artean). Datuak batez besteko ± SEM gisa adierazten dira; ***P < 0,001. (D) FLIM irudi adierazgarriak Grx1-roGFP2 glutatione redox sentsorearen 7 asteko PNren batez besteko bizi-itxaropena erakusten du zehaztutako baldintza esperimentaletan. LUT (bilaketa-taula) ratioa: biziraupen-denbora-tartea (pikosegundotan). Eskala-barra, 25 μm. (E) Histogramak Grx1-roGFP2-ren bizi-balioen banaketa erakusten du (D)-tik (n=158tik 368ra bi saguetan baldintza bakoitzean). Histograma bakoitzaren gaineko zirkulu-diagramak bizi-balio nabarmen luzeagoak (gorria, oxidatua) edo laburragoak (urdina, murriztua) dituzten zelulen kopurua erakusten du, CTRL-AAV-scr-en batez besteko bizi-balioaren 1 SD gainditzen dutenak. (F) Proposatutako ereduak PCx neuronalaren erregulazio gorakorraren efektu babeslea erakusten du.
Oro har, hemen ematen ditugun datuek erakusten dute MFN2ren berradierazpenak OXPHOS gabezia larria, mtDNA agortze larria eta ista itxurako morfologia oso anormala duen PN aurreratua erabat erreskatatu dezakeela, horrela aurrerapen jarraitua emanez gaixotasun aurreratuetan ere. Neuroendekapenak zelulen heriotza aurreko fasearen ebidentzia itzulgarria eskaintzen du. Malgutasun metaboliko maila hau are gehiago azpimarratzen da neuronen aterosklerosia eragiteko gaitasunagatik (TCA zikloaren birkableatzea), eta horrek PCx adierazpena inhibitzen du OXPHOS gabeko PNetan eta zelulen heriotza areagotzen du, horrela babes-rola jokatuz (5F irudia).
Ikerketa honetan, frogak eman ditugu OXPHOS disfuntzioari neurona partikularrek (PN) duten erantzuna pixkanaka TCA zikloaren aterosklerosiara konbergitzen dela, programa metabolikoek aktibatutako aktibazio-bide diferentzialaren bidez. Proteomikaren analisia metodo osagarri askorekin berretsi dugu eta agerian utzi dugu mitokondrio-disfuntzio larri batek erronka egiten dienean, neuronek aurretik ezezaguna den elastikotasun metaboliko mota bat dutela. Harrigarria bada ere, birkableatzeko prozesu osoak ez du zertan neuroendekapenarekin batera doan egoera metaboliko terminala markatzen pixkanaka eta itzulezin, baina gure datuek iradokitzen dute mantentze-neurona izan daitekeela zelula-heriotza baino lehenagoko fasean ere. Konpentsazio funtzionalaren mekanismoa. Aurkikuntza honek adierazten du neuronek plastizitate metaboliko maila handia dutela gorputzean. Gertakari honek frogatzen du MFN2-ren geroagoko birsartzeak markatzaile metaboliko gakoen adierazpena alderantzikatu eta PN endekapena saihestu dezakeela. Aitzitik, aterosklerosia inhibitzen du eta nerbio transexualak bizkortzen ditu.
Gure ikerketan aurkikuntza liluragarrienetako bat da OXPHOS gabeko PNek TCA zikloaren metabolismoa alda dezaketela arteriosklerosia estimulatzen duten entzimak erregulatuz. Metabolismoaren birmoldaketa minbizi-zelulen ezaugarri ohikoa da, eta horietako batzuek glutaminaren menpe daude TCA zikloaren bitartekariak osatzeko, baliokide erreduzitzaileak sortzeko, arnasketa-katea bultzatzen dutenak eta lipidoen eta nukleotidoen biosintesiaren aitzindarien ekoizpena mantentzen dutenak (39, 40). Duela gutxiko ikerketa batek erakutsi zuen OXPHOS disfuntzioa jasaten duten ehun periferikoetan, glutamina/glutamato metabolismoaren birkonexioa ere ezaugarri nabarmena dela (5, 41), non glutamina TCA zikloan sartzeko norabidea OXPHOS lesioaren larritasunagatik (41). Hala ere, ez dago ebidentzia argirik gorputzeko neurona-plastizitate metabolikoaren antzekotasunik eta gaixotasunaren testuinguruan duen garrantzia. Duela gutxiko in vitro ikerketa batean, lehen mailako neurona kortikalek glutamato multzoak mobilizatzen dituztela frogatu zen neurotransmisiorako, eta horrela metabolismo oxidatiboa eta aterosklerosia sustatuz estres metabolikoaren baldintzetan (42). Aipatzekoa da TCA zikloaren sukzinato deshidrogenasa entzimaren inhibizio farmakologikoaren pean, piruvato karboxilazioak oxaloazetatoaren sintesia mantentzen duela uste dela zerebelo-granulu neuronetan (34). Hala ere, mekanismo hauen garrantzi fisiologikoa garuneko ehunean (non aterosklerosia batez ere astrozitoetara mugatzen dela uste den) oraindik ere esanahi fisiologiko garrantzitsua du (43). Kasu honetan, gure datuek erakusten dute gorputzean OXPHOSek kaltetutako PNak BCAA degradaziora eta piruvato karboxilaziora alda daitezkeela, eta horiek dira TCA multzoko bitartekarien osagarrien bi iturri nagusiak. BCAA katabolismoak neuronen energia-metabolismoan duen ustezko ekarpena proposatu den arren, glutamatoaren eta GABAren neurotransmisiorako duen eginkizunaz gain (44), oraindik ez dago mekanismo horien frogarik in vivo. Beraz, erraza da espekulatzea PN disfuntzionalek automatikoki konpentsatu dezaketela asimilazio-prozesuak eragindako TCA bitartekarien kontsumoa aterosklerosia handituz. Bereziki, PCx-ren goranzko erregulazioa beharrezkoa izan daiteke azido aspartikoaren eskaria handitzeko, eta hori iradokitzen da mitokondrioen disfuntzioa duten zelula ugaltzaileetan (45). Hala ere, gure metabolomikako analisiak ez zuen aldaketa esanguratsurik agerian utzi Mfn2cKO PN-etan azido aspartikoaren maila egonkorrean (S6A irudia), eta horrek, seguruenik, azido aspartikoaren erabilera metaboliko desberdina islatzen du ugaltzen ari diren zelulen eta post-mitotiko neuronen artean. In vivo neurona disfuntzionaletan PCx-ren goranzko erregulazioaren mekanismo zehatza oraindik karakterizatu gabe dagoen arren, frogatu genuen erantzun goiztiar honek paper garrantzitsua betetzen duela neuronen erredox egoera mantentzeko, eta hori frogatu zen zerebelo-xerratan egindako FLIM esperimentuetan. Bereziki, PN-ek PCx goranzko erregulazioa eragozteak egoera oxidatuago batera eraman dezake eta zelulen heriotza bizkortu. BCAA degradazioaren aktibazioa eta piruvatoaren karboxilazioa ez dira mitokondrioen disfuntzioaren ehun periferikoak karakterizatzeko moduak (7). Beraz, OXPHOS gabezia duten neuronen lehentasunezko ezaugarria direla dirudi, ezaugarri bakarra ez bada ere, neuroendekapenerako garrantzitsua dena. .
Zerebeloaren gaixotasuna neuroendekapenezko gaixotasun heterogeneo mota bat da, normalean ataxia gisa agertzen dena eta askotan PNak kaltetzen dituena (46). Neurona populazio hau bereziki zaurgarria da mitokondrioen disfuntzioarekiko, saguetan duten endekapen selektiboa nahikoa baita gizakien espinocerebelo ataxia ezaugarritzen duten motor sintoma asko erreproduzitzeko (16, 47, 48). Txostenen arabera, gene mutante bat duen sagu transgeniko eredu bat gizakien espinocerebelo ataxiarekin lotuta dago eta mitokondrioen disfuntzioa du (49, 50), OXPHOS gabeziaren ondorioak PNPHn aztertzearen garrantzia azpimarratuz. Hori dela eta, bereziki egokia da neurona populazio berezi hau modu eraginkorrean isolatu eta aztertzea. Hala ere, PNak presioarekiko oso sentikorrak direla eta zerebelo zelulen populazio osoaren proportzio txikia osatzen dutela kontuan hartuta, omikan oinarritutako ikerketa askorentzat, zelula oso gisa bereizteko modu selektiboa oraindik alderdi erronka bat da. Ia ezinezkoa den arren beste zelula mota batzuen (batez ere helduen ehunen) kutsadura erabateko eza lortzea, disoziazio urrats eraginkor bat konbinatu dugu FACSrekin proteomikaren ondorengo analisietarako neurona bideragarri kopuru nahikoa lortzeko, eta proteina estaldura nahiko altua dugu (3000 proteina inguru) zerebelo osoko datu multzoarekin alderatuta (51). Zelula osoen bideragarritasuna mantenduz, hemen eskaintzen dugun metodoak ez digu mitokondrioetako bide metabolikoen aldaketak egiaztatzeko aukera ematen bakarrik, baita bere zitoplasmako parekoen aldaketak egiaztatzeko ere, eta horrek mitokondrioen mintzeko etiketen erabilera osatzen du zelula mota aberasteko. Ehun konplexuetako mitokondrio kopuruaren metodo berria (52, 53). Deskribatzen dugun metodoa ez dago Purkinje zelulen azterketarekin lotuta soilik, baizik eta edozein zelula motatan aplika daiteke erraz garun gaixoetan aldaketa metabolikoak jorratzeko, mitokondrioen disfuntzioaren beste eredu batzuk barne.
Azkenik, birmoldaketa metaboliko honen prozesu honetan leiho terapeutiko bat identifikatu dugu, zelulen estresaren seinale nagusiak erabat alderantzikatu eta neuronen endekapena prebenitu dezakeena. Beraz, hemen deskribatutako birkableatzearen inplikazio funtzionalak ulertzeak funtsezko ikuspegiak eman ditzake mitokondrioen disfuntzioan neuronen bideragarritasuna mantentzeko tratamendu posibleei buruz. Garuneko beste zelula mota batzuetan energia-metabolismoan izandako aldaketak aztertzera bideratutako etorkizuneko ikerketak beharrezkoak dira printzipio honen beste gaixotasun neurologiko batzuetan aplikagarritasuna guztiz agerian uzteko.
MitoPark saguak lehenago deskribatu dira (31). Mfn2 geneak alboan dituzten loxP dituzten C57BL/6N saguak lehenago deskribatu dira (18) eta L7-Cre saguekin gurutzatu dira (23). Sortutako ondorengo heterozigoto bikoitza Mfn2loxP/Mfn2loxP sagu homozigotoekin gurutzatu zen Mfn2rako Purkinje-espezifikoak diren geneen knockout-ak sortzeko (Mfn2loxP/Mfn2loxP; L7-cre). Parekatze azpimultzo batean, Gt (ROSA26) SorStop-mito-YFP aleloa (stop-mtYFP) sartu zen gurutzaketa gehigarrien bidez (20). Animalien prozedura guztiak Europako, nazioko eta erakundeetako jarraibideen arabera egin ziren eta Umwelt eta Verbraucherschutz-eko LandesamtfürNatur-ek (Ipar Renania-Westfalia, Alemania) onartu zituen. Animalien lanak Laborategiko Animalien Zientzien Elkarteen Europako Federazioaren jarraibideak ere jarraitzen ditu.
Haurdun dagoen emakumearen zerbikal-luxazioa anestesiatu ondoren, saguaren enbrioia isolatu zen (E13). Kortexa Hanks-en Gatz Soluzio Orekatuan (HBSS) disekzionatu zen, 10 mM Hepes-ekin osatua, eta Dulbecco-ren Modifikatutako Eagle-ren Medium-ean pasa zen, papaina (20 U/ml) eta zisteina (1μg/ml) dituena. Ehuna DMEM-en inkubatu eta digestio entzimatiko bidez disoziatu. Ml) 37 °C-tan 20 minutuz, eta ondoren mekanikoki ehotu % 10eko behi-fetuaren serumarekin osatua den DMEM-en. Zelulak polilisinaz estalitako beirazko estalkietan erein ziren, 2×106 dentsitatearekin 6 cm-ko hazkuntza-plaka bakoitzeko edo 0,5×105 zelula/cm2-ko dentsitatearekin irudi-analisietarako. 4 ordu igaro ondoren, medioa Neurobasal serumik gabeko medioarekin ordezkatu zen, % 1eko B27 osagarria eta 0,5 mM GlutaMax dituena. Neuronak 37 °C-tan eta % 5eko CO2-tan mantendu ziren esperimentu osoan zehar, eta astean behin eman zitzaien elikadura. In vitro birkonbinazioa eragiteko, AAV9 birus bektore honen 3 μl (24 putzuko hazkuntza-plaka) edo 0,5 μl (24 putzuko plaka) erabili ziren neuronak in vitro bigarren egunean tratatzeko: AAV9.CMV.PI.eGFP. WPRE.bGH (Addgene, 105530-AAV9 katalogo-zenbakia) eta AAV9.CMV.HI.eGFP-Cre.WPRE.SV40 (Addgene, 105545-AAV9 katalogo-zenbakia).
Saguaren Mfn1 eta Mfn2 DNA osagarriak (Addgene plasmidoetatik #23212 eta #23213 lortuak, hurrenez hurren) V5 sekuentziarekin (GKPINPLLGLDST) markatuta daude C-muturrean, eta mCherry-rekin fusionatzen dira markoan T2A sekuentziaren bidez. Grx1-roGFP2 Heidelberg TP Dick DFKZ-ren (Deutsches Krebsforschungszentrum) oparia da. tdTomato kasetea klonazio metodo konbentzionalak erabiliz ordezkatuz, kasetea pAAV-CAG-FLEX-tdTomato bizkarrezurrean (Addgene erreferentzia zenbakia 28306) azpiklonatu zen pAAV-CAG-FLEX-mCherry-T2A-MFN2-V5, pAAV-CAG-FLEX-mCherry-T2A-MFN1-V5 eta pAAV-CAG-FLEX-Grx-roGFP2 bektoreak sortzeko. Antzeko estrategia bat erabili zen pAAV-CAG-FLEX-mCherry kontrol bektorea sortzeko. AAV-shPCx eraikuntza sortzeko, AAV plasmido bektore bat behar da (VectorBuilder, pAAV [shRNA] -CMV-mCherry-U6-mPcx- [shRNA#1]), sagu PCx helburu duen shRNA kodetzen duen DNA sekuentzia duena (5′CTTTCGCTCTAAGGTGCTAAACTCGAGTTTAGCACCTTAGAGCGAAAG 3′). U6 sustatzailearen kontrolpean, mCherry erabiltzen da CMV sustatzailearen kontrolpean. AAV bektore lagungarrien ekoizpena fabrikatzailearen argibideen arabera egin zen (Cell Biolabs). Laburbilduz, erabili mCherry-T2A-MFN2-V5 (pAAV-CAG-FLEX-mCherry-T2A-MFN2-V5), mCherry-T2A-MFN1-V5 (pAAV-CAG-FLEX-mCherry) aldi baterako 293AAV zelulen transfektazioa (T2A-MFN1-V5), mCherry (pAAV-CAG-FLEX-mCherry) edo Grx-roGFP2 (pAAV-CAG-FLEX-Grx-roGFP2) gene kodetzailea duena, baita AAV1 kapside proteina eta proteina osagarria kodetzen dituena ere. Paketatze plasmido plasmidoa, kaltzio fosfato metodoa erabiliz. Birus gordinaren gainnatzailea izozte-desizozte zikloen bidez lortu zen izotz lehorreko/etanol bainu batean eta zelulak fosfato tamponatutako gatz-soluzioan (PBS) lisatu ziren. AAV bektorea iodixanol gradiente etenaren ultrazentrifugazio bidez purifikatu zen (24 ordu 32.000 rpm-tan eta 4 °C-tan) eta Amicon ultra-15 iragazki zentrifugo bat erabiliz kontzentratu zen. AAV1-CAG-FLEX-mCherry-T2A-MFN2-V5 [2,9×1013 genomaren kopia (GC)/ml], AAV1-CAG-FLEX-mCherry (6,1×1012 GC/ml), AAV1-CAG-FLEX-en genomaren titulua aurretik deskribatutakoa bezala izan zen (54), denbora errealeko PCR kuantitatibo bidez (qPCR) neurtua: -MFN1-V5 (1,9×1013 GC/ml) eta AAV1-CAG-FLEX-Grx-roGFP2 (8,9×1012 GC/ml).
Neurona primarioak izotzez hoztutako 1x PBS-tan kendu, pelletetan sartu eta gero homogeneizatu egin ziren % 0,5eko Triton X-100 / % 0,5eko sodio desoxikolato/PBS lisi bufferrean, fosfatasa eta proteasa inhibitzailea dituena (Roche). Proteinen kuantifikazioa azido bizinkoninikoaren analisia erabiliz egin zen (Thermo Fisher Scientific). Ondoren, proteinak SDS-poliakrilamida gel elektroforesi bidez bereizi ziren, eta gero polibinilideno fluoruro mintz batean (GE Healthcare) transferitu ziren. Blokeatu gune ez-espezifikoak eta inkubatu antigorputz primarioarekin (ikus S1 taula xehetasunetarako) % 5eko esnearekin TBST-tan (Tris-buffered galu Tween-ekin), garbiketa urratsak eta antigorputz sekundarioa TBST inkubatuan. Inkubatu antigorputz primarioarekin gau osoan +4°C-tan. Garbitu ondoren, aplikatu antigorputz sekundarioa 2 orduz giro-tenperaturan. Ondoren, blot bera β-aktina aurkako antigorputz batekin inkubatuz, karga bera baieztatu zen. Kimioluminiszentziara bihurtuz eta kimioluminiszentzia hobetuz detektatzea (GE Healthcare).
Aurretik beirazko estalkietan ereindako neuronak % 4ko paraformaldehidoarekin (PFA)/PBSrekin finkatu ziren zehaztutako denbora-puntuan giro-tenperaturan 10 minutuz. Estalkietan lehenik % 0,1eko Triton X-100/PBSrekin iragazi ziren 5 minutuz giro-tenperaturan, eta ondoren blokeatze-bufferrean [% 3ko behi-serumeko albumina (BSA)/PBS]. Bigarren egunean, estalkietan blokeatze-bufferrean garbitu ziren eta fluoroforoarekin konjugatutako bigarren mailako antigorputz egokiarekin inkubatu ziren 2 orduz giro-tenperaturan; azkenik, laginak ondo garbitu ziren PBSn 4′,6-diamidino-2-Fenilindolarekin (DAPI) kontra-tinduz eta ondoren mikroskopio-portaobjektuan finkatu ziren Aqua-Poly/Mount-ekin.
Saguak (arrak eta emeak) ketamina (130 mg/kg) eta xilazina (10 mg/kg) injekzio intraperitonealaren bidez anestesiatu ziren, eta azalpean eman zitzaien karprofeno analgesikoa (5 mg/kg). Ondoren, konpresa bero batekin hornitutako estereotaktiko tresna batean (Kopf) jarri ziren. Garezurra agerian utzi eta hortz-zulagailu bat erabili zerebelo-kortexaren zatia mehetzeko, hezur mis-ari dagokiona (lambdatik: isatsa 1.8, albokoa 1, IV eta V lobuluei dagokiona). Xiringa-orratz kurbatu bat erabili burezurrean zulo txiki bat egiteko kontu handiz, beheko baskulatura ez nahasteko. Ondoren, beirazko kapilar mehea poliki-poliki sartzen da mikro-zuloan (duramater-aren alde bentralean -1.3tik -1era), eta 200-300 nl AAV injektatzen dira mikro-injektorean (Narishige) eskuzko xiringekin (Narishige) hainbat aldiz presio baxuan, 10-20 minutuko leihoan. Infusioaren ondoren, jarri kapilar-hodia beste 10 minutuz birusa guztiz heda dadin. Kapilarrak kendu ondoren, azala arretaz josi egiten da zauriaren hantura gutxitzeko eta animalia sendatzeko. Animaliak analgesikoekin (caspofen) tratatu ziren ebakuntzaren ondorengo hainbat egunez, eta denbora horretan haien egoera fisikoa arretaz kontrolatu zen, eta ondoren, adierazitako unean eutanasia egin zitzaien. Prozedura guztiak Europako, nazioko eta erakundeetako jarraibideen arabera egin ziren, eta Ipar Renania-Westfalia, Alemania, Umwelt eta Verbraucherschutz-eko LandesamtfürNatur-ek onartu zituen.
Animaliak ketaminarekin (100 mg/kg) eta xilazinarekin (10 mg/kg) anestesiatu ziren, eta bihotza lehenik 0,1 M PBSrekin perfusatu zen, eta gero % 4ko PFArekin PBSn. Ehuna disekzionatu eta % 4ko PFA/PBSn finkatu zen gau osoan 4 °C-tan. Bibrazio-labana bat (Leica Microsystems GmbH, Viena, Austria) erabili zen PBSn finkatutako garuneko ebaki sagitalak (50 μm-ko lodiera) prestatzeko. Bestelakorik zehaztu ezean, aske flotatzen ari ziren ebakien tindaketa goian deskribatutako moduan egin zen (13), giro-tenperaturan eta irabiatuz. Laburbilduz, lehenik eta behin, lortutako xerra % 0,5eko Triton X-100/PBSrekin iragazkortu ziren 15 minutuz giro-tenperaturan; epitopo batzuetarako (Pcx eta Shmt2), tris-EDTA bufferrean 80 °C-tan (PH 9) berotu xerra 25 minutuz urrats honen ordez. Ondoren, atalak blokeatze-bufferrean (% 3 BSA/PBS) inkubatu ziren gau osoan zehar 4 °C-tan, irabiatuz. Hurrengo egunean, atalak blokeatze-bufferrean garbitu eta fluoroforoarekin konjugatutako bigarren mailako antigorputzarekin inkubatu ziren 2 orduz giro-tenperaturan; azkenik, atalak ondo garbitu ziren PBS-n, DAPI-rekin kontra-tindu ziren eta gero AquaPolymount-ekin finkatu ziren mikroskopio-portaobjektu batean.
Laginaren irudiak lortzeko, laser bidezko eskaneatze-mikroskopio konfokal bat (TCS SP8-X edo TCS Digital Light Sheet, Leica Microsystems) erabili zen, argi zuriko laser batekin eta 405 diodoko laser ultramore batekin hornitua. Fluoroforoa kitzikatuz eta seinalea Detektagailu Hibridoarekin (HyDs) bilduz, LAS-X softwarea erabili zen Nyquist laginketaren araberako irudi pilatuak biltzeko modu sekuentzialean: panel ez-kuantitatiboetarako, seinale oso dinamikoak dira (adibidez, zelula somatikoetan eta dendritetan) mtYFP) Erabili HyD PN kopurua detektatzeko BrightR moduan). 0,3tik 6 ns-ra bitarteko atea aplikatzen da atzeko planoa murrizteko.
Zelulen denbora errealeko irudigintza. Neurobasal-A medioan sailkatu ondoren, % 1eko B27 osagarria eta 0,5 mM GlutaMax zituena, zelulak berehala erein ziren poli-l-lisinaz estalitako beirazko laminetan (μ-Slide8 Well, Ibidi, 80826 katalogo zenbakia), eta ondoren 37 °C-tan eta % 5eko CO2-tan mantendu ziren ordubetez zelulak finkatzeko. Denbora errealeko irudigintza Leica SP8 laser eskaneatze mikroskopio konfokal batean egin zen, laser zuri batekin, HyD batekin, 63×[1,4 zenbakizko irekidura (NA)] olio objektibo lente batekin eta berotze etapa batekin hornitua.
Sagua azkar anesteziatu eta burua kendu zitzaion, garuna azkar kendu zitzaion burezurretik, eta 200 μm-ko lodierako (13C markatze-esperimenturako) edo 275 μm-ko lodierako (bi fotoi-esperimenturako) sekzio sagitalean moztu zen, honako material hauekin beteta. Izozkia (HM-650 V, Thermo Fisher Scientific, Walldorf, Alemania) honako substantzia hauekin betetzen da: 125 mM izotzez hoztutako, karbonoz asetutako (% 95 O2 eta % 5 CO2) Ca2 gutxiko + bizkarrezur-muineko likido artifiziala (ACSF) NaCl, 2,5 mM KCl, 1,25 mM sodio fosfato bufferra, 25 mM NaHCO3, 25 mM glukosa, 0,5 mM CaCl2 eta 3,5 mM MgCl2 (310 eta 330 mmol arteko presio osmotikoa). Lortutako garun-xerra horiek pH 7,4 eta 310 eta 320 mmol artean Ca2 + ACSF kontzentrazio handiagoa duen aurre-inkubazio-ganbera batera eraman.
Irudi-prozesuan zehar, xerra irudi-gela dedikatu batera eraman ziren, eta esperimentua ACSF perfusio jarraituaren pean egin zen, 32° eta 33°C arteko tenperatura konstantean. Xerra irudiak egiteko, Leica 25x lente objektibo batekin (NA 0.95, ura) eta Ti: Zafiro laser batekin (Chameleon Vision II, Coherent) hornitutako mikroskopio laser multifotoiko bat (TCS SP8 MP-OPO, Leica Microsystems) erabili zen. FLIM modulua (PicoHarp300, PicoQuant).
Grx1-roGFP2-ren FLIM. PN-en zitoplasma-erredox egoeraren aldaketak bi fotoiko FLIM bidez neurtu ziren garuneko sagital xerratan, non Grx1-roGFP2 biosentsoreak PN-ak zuzendu zituen. PN geruzan, eskuratze-eremua xerra-gainazalaren azpitik 50 eta 80 μm artean hautatzen da, PN bideragarri bat dagoela ziurtatzeko (hau da, egitura perlaturik edo dendritetan zehar neuronen aldaketa morfologikorik ez dagoela) eta roGFP2 sentsore bikoitz positibo bat eta shRNA PCx edo bere kontrol-sekuentzia kodetzen duen AAV (bakoitza mCherry ko-espresatuz). Bildu pila bakarreko irudiak 2x zoom digitalarekin [kitzikapen-uhin-luzera: 890 nm; 512 nm 512 pixel]. Detekzioa: barneko HyD, fluoreszeina isotiozianato (FITC) iragazki-taldea] eta 2-3 minutuko irudien batez bestekoa erabiltzen dira kurba doitzeko fotoi nahikoa biltzen direla ziurtatzeko (guztira 1000 fotoi). Grx1-roGFP2 zundaren sentikortasuna eta FLIM baldintzen egiaztapena roGFP2-ren iraupen-balioa monitorizatuz egin ziren, 10 mM H2O2 exogenoa perfusio ACSF-ra gehitzean (oxidazioa maximizatzeko, iraupena handituz), eta ondoren 2 mM ditiotreitol gehituz (murrizketa-maila minimizatzen du, iraupena murriztuz) (S8 irudia, D-tik G-ra). Erabili FLIMfit 5.1.1 softwarea lortutako emaitzak aztertzeko, irudi osoaren beherakada esponentzial bakarra neurtutako IRF-ra (tresnaren erantzun-funtzioa) egokituz, eta χ2 gutxi gorabehera 1 da. PN bakar baten iraupena kalkulatzeko, nerbio-gorputzaren inguruko maskara eskuz marraztu zen, eta maskara bakoitzeko batez besteko iraupena erabili zen kuantifikaziorako.
Mitokondrio-potentzialaren analisia. Atal akutua ACSF perfusatuari zuzenean gehitutako 100 nM TMRMrekin inkubatu ondoren, PN-en mitokondrio-potentzialaren aldaketak bi fotoiko mikroskopio batekin neurtu ziren. TMRM irudigintza zunda 920 nm-tan kitzikatuz eta barneko HyD (tetrametilrodamina isotiozianatoa: 585/40 nm) erabiliz egin zen; kitzikapen-uhin-luzera bera erabiliz, baina barneko HyD desberdin bat (FITC: 525/50) erabiliz mtYFP irudikatzeko. Erabili ImageJ-ren Image Calculator plugina zelula bakarreko mailan mitokondrio-potentziala ebaluatzeko. Laburbilduz, pluginaren ekuazioa: seinalea = min (mtYFP, TMRM) erabiltzen da Purkinje Somalian TMRM seinalea erakusten duen mitokondrio-eskualdea identifikatzeko dagokion kanalaren pila bakarreko irudi konfokalean. Ondoren, ondoriozko maskarako pixelen azalera kuantifikatzen da, eta ondoren mtYFP kanalaren dagokion atalase bakarreko irudian normalizatzen da mitokondrioen potentziala erakusten duen mitokondrioen frakzioa lortzeko.
Irudia Huygens Pro (Scientific Volume Imaging) softwarearekin dekonboluzionatu zen. Teila eskaneatutako irudietarako, teila bakar baten muntaketa LAS-X softwareak eskaintzen duen jostura automatikoko algoritmoa erabiliz egiten da. Irudiaren kalibrazioaren ondoren, erabili ImageJ eta Adobe Photoshop irudia gehiago prozesatzeko eta distira eta kontrastea uniformeki doitzeko. Erabili Adobe Illustrator grafikoen prestaketarako.
mtDNAren fokuaren analisia. mtDNAren lesioen kopurua kuantifikatu zen DNAren aurkako antigorputzekin markatutako zerebelo-sekzioetan mikroskopio konfokal bidez. Helburu-eremu bakoitza zelula-gorputzarentzat eta zelula bakoitzaren nukleoarentzat sortu zen, eta dagokion eremua Multi Measure plugina (ImageJ softwarea) erabiliz kalkulatu zen. Kendu nukleo-eremua zelula-gorputzaren eremutik zitoplasmaren eremua lortzeko. Azkenik, Analyze Particles plugina (ImageJ softwarea) erabili zen mtDNA adierazten duten zitoplasmako DNA puntuak automatikoki kuantifikatzeko atalase-irudian, eta lortutako emaitzak CTRL saguen PN batez bestekora normalizatu ziren. Emaitzak zelula bakoitzeko nukleosido kopuru batez besteko gisa adierazten dira.
Proteinen espresioaren analisia. Erabili ImageJ-ren Image Calculator plugina PN-n proteinen espresioa zelula bakarreko mailan ebaluatzeko. Laburbilduz, dagokion kanalaren geruza bakarreko irudi konfokalean, seinalea = min (mtYFP, antigorputza) ekuazioaren bidez, Purkinan antigorputz jakin baten aurkako immunerreaktibotasuna erakusten duen mitokondrio-eskualdea identifikatzen da. Ondoren, ondoriozko maskarako pixel-eremua kuantifikatzen da, eta ondoren mtYFP kanalaren dagokion atalase-pilaketa bakarreko irudian normalizatzen da, bistaratutako proteinaren mitokondrio-frakzioa lortzeko.
Purkinje zelulen dentsitatearen analisia. ImageJ-ren Cell Counter plugina erabili zen Purkinje dentsitatea ebaluatzeko, zenbatutako Purkinje zelulen kopurua zenbatutako zelulek okupatzen duten zerebelo-eraztunaren luzerarekin zatituz.
Laginen prestaketa eta bilketa. Kontrol-taldeko eta Mfn2cKO saguen garunak % 2ko PFA/% 2,5eko glutaraldehidoan finkatu ziren 0,1 M-ko fosfato bufferrean (PB), eta ondoren, korona-ebakiak prestatu ziren ziliatuak erabiliz (Leica Mikrosysteme GmbH, Viena, Austria) (50 eta 60 μm arteko lodiera). Ondoren, PB bufferrean finkatu ziren % 1eko tetraoxidoan eta % 1,5eko potasio ferrozianuroan giro-tenperaturan ordubetez. Ebakiak hiru aldiz garbitu ziren ur destilatuarekin, eta ondoren % 1eko uranil azetatoa zuen % 70eko etanolarekin tindatu ziren 20 minutuz. Ondoren, ebakiak alkohol graduatuan deshidratatu eta Durcupan ACM (Araldite casting resin M) epoxi erretxinetan (Electron Microscopy Sciences, 14040 katalogo-zenbakia) txertatu ziren silikonaz estalitako beirazko laminaren artean, eta azkenik, 60 °C-tan, labean polimerizatu ziren 48 orduz. Zerebelo-kortexaren eremua hautatu eta 50 nm-ko sekzio ultrameheak Leica Ultracut-en (Leica Mikrosysteme GmbH, Viena, Austria) moztu eta poliestirenozko film batez estalitako 2×1 mm-ko kobrezko ebaki-sare batean hartu ziren. Sekzioak % 4ko uranilo azetatoaren disoluzio batekin H2O-tan tindatu ziren 10 minutuz, H2O-rekin garbitu ziren hainbat aldiz, ondoren Reynolds-eko berun zitratoarekin H2O-tan 10 minutuz, eta ondoren H2O-rekin garbitu ziren hainbat aldiz. Mikrografiak Philips CM100 (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, AEB) transmisio-mikroskopio elektroniko batekin atera ziren, TVIPS (Tietz Video and Image Processing System) TemCam-F416 kamera digital bat (TVIPS GmbH, Gauting, AEB). Alemania).
AAVz infektatutako saguentzat, garuna bereizi eta 1 mm-ko lodierako sekzio sagital batean moztu zen, eta zerebeloa fluoreszentzia mikroskopio bat erabiliz aztertu zen AAVz infektatutako eraztuna identifikatzeko (hau da, mCherry adierazten duena). AAV injekzioak Purkinje zelulen geruzaren (hau da, ia geruza osoa) transdukzio-eraginkortasun oso handia lortzen duen esperimentuak baino ez dira erabili gutxienez bi zerebelo-eraztun jarraian. AAVz transduzitutako begizta mikrodisekzionatu zen gau osoan finkapen osteko (% 4 PFA eta % 2,5 glutaraldehido 0,1 M-ko kokoato bufferrean) eta gehiago prozesatu zen. EPON txertatzeko, finkatutako ehuna 0,1 M-ko sodio kokoato bufferrean (Applicihem) garbitu zen, eta % 2 OsO4-rekin (os, Science Services; Caco) inkubatu zen 0,1 M-ko sodio kokoato bufferrean (Applicihem) 4 orduz, eta ondoren 2 orduz garbitu. Errepikatu 3 aldiz 0,1 M-ko kokamida bufferrean. Ondoren, etanolaren serie goranzkoa erabili zen etanol-soluzio bakoitza 4 °C-tan 15 minutuz inkubatzeko ehuna deshidratatzeko. Ehuna propileno oxidora transferitu eta gau osoan inkubatu zen EPON-ean (Sigma-Aldrich) 4 °C-tan. Jarri ehuna EPON freskoan giro-tenperaturan 2 orduz, eta ondoren txertatu 62 °C-tan 72 orduz. Erabili ultramikrotomo bat (Leica Microsystems, UC6) eta diamantezko labana bat (Diatome, Biel, Suitza) 70 nm-ko sekzio ultrameheak mozteko, eta tindatu % 1,5eko uranilo azetatoarekin 15 minutuz 37 °C-tan, eta tindatu berun zitrato-soluzioarekin 4 minutuz. Mikrografia elektronikoak JEM-2100 Plus transmisio-mikroskopio elektroniko batekin (JEOL) egin ziren, Camera OneView 4K 16-bit (Gatan) eta DigitalMicrograph softwarearekin (Gatan) hornituta. Analisirako, mikrografia elektronikoak 5000× edo 10.000× zoom digitalarekin eskuratu ziren.
Mitokondrioen analisi morfologikoa. Analisi guztietarako, mitokondrio bakoitzaren konturoak eskuz marraztu ziren irudi digitaletan ImageJ softwarea erabiliz. Parametro morfologiko desberdinak aztertu ziren. Mitokondrioen dentsitatea zelula bakoitzaren mitokondrioen azalera osoa zitoplasmaren azalerarekin zatituz lortutako ehuneko gisa adierazten da (zitoplasmaren azalera = zelularen azalera-zelula nukleoaren azalera) × 100. Mitokondrioen biribiltasuna [4π∙(azalera/perimetro 2)] formularen bidez kalkulatzen da. Mitokondrioen ista morfologia aztertu eta bi kategoriatan banatu zen ("hodi-formakoa" eta "babak") haien forma nagusien arabera.
Autofagosoma/lisosoma kopuruaren eta dentsitatearen analisia. Erabili ImageJ softwarea autofagosoma/lisosoma bakoitzaren konturak eskuz marrazteko irudi digitalean. Autofagosoma/lisosoma azalera ehuneko gisa adierazten da, zelula bakoitzaren autofagosoma/lisosoma egituraren azalera osoa zitoplasmaren azalerarekin zatituz (zitoplasmaren azalera = zelularen azalera - nukleoaren azalera) × 100. Autofagosomen/lisosomen dentsitatea kalkulatzeko, kopuru osoa zelula bakoitzeko autofagosoma/lisosoma egituren kopuruarekin zatitzen da (zitoplasmaren azalerari dagokionez) (zitoplasmaren azalera = zelularen azalera - nukleoaren azalera).
Etiketatzea sekzio akutuetarako eta laginaren prestaketarako. Glukosa etiketatzea behar duten esperimentuetarako, eraman garuneko xerra akutuak aurre-inkubazio ganbera batera, karbono saturatua (% 95 O2 eta % 5 CO2), Ca2 + ACSF altua (125.0 mM NaCl, 2.5 mM KCl, 1.25 mM sodio fosfato bufferra, 25.0 mM NaHCO3, 25.0 mM d-glukosa, 1.0 mM CaCl2 eta 2.0 mM MgCl2, pH 7.4ra eta 310etik 320 mOsmra egokituta) eta non glukosa 13C6- Glukosa ordezkapena den (Eurisotop, katalogo zenbakia CLM-1396). Piruvato markaketa behar duten esperimentuetarako, garuneko xerra akutuak Ca2 + ACSF handiago batera eraman (125.0 mM NaCl, 2.5 mM KCl, 1.25 mM sodio fosfato bufferra, 25.0 mM NaHCO3, 25.0 mM d-glukosa, 1.0 mM CaCl2 eta gehitu 2.0 mM MgCl2, pH 7.4ra eta 310etik 320mOsmra egokitu), eta gehitu 1 mM 1-[1-13C]piruvato (Eurisotop, katalogo zenbakia CLM-1082). Inkubatu atalak 90 minutuz 37°C-tan. Esperimentuaren amaieran, atalak azkar garbitu ziren 75 mM amonio karbonatoa zuen ur-disoluzio batekin (pH 7.4), eta ondoren homogeneizatu ziren 40:40:20 (v:v:v) azetonitriloa (ACN): metanola: ura. Sekzioak izotzean 30 minutuz inkubatu ondoren, laginak 21.000 g-tan zentrifugatu ziren 10 minutuz 4 °C-tan, eta gainnadante gardena SpeedVac kontzentradore batean lehortu zen. Lortutako metabolito lehortuaren pelleta -80 °C-tan gorde zen analisia egin arte.
13C-rekin markatutako aminoazidoen kromatografia likido-masa-espektrometria bidezko analisia. Kromatografia likido-masa-espektrometria (LC-MS) analisirako, metabolito-pelleta 75 μl LC-MS kalitateko uretan (Honeywell) berriro eseki zen. 21.000 g-tan 5 minutuz 4 °C-tan zentrifugatu ondoren, gainnatzaile argituaren 20 μl erabili ziren aminoazidoen fluxuaren analisirako, eta gainerako erauzkinaren gainerakoa berehala erabili zen anioien analisirako (ikus behean). Aminoazidoen analisia aurretik deskribatutako bentzoil kloruroaren deribatizazio-protokoloa erabiliz egin zen (55, 56). Lehen urratsean, 10 μl 100 mM sodio karbonato (Sigma-Aldrich) gehitu zitzaizkion 20 μl metabolito-erazkinari, eta ondoren 10 μl % 2ko bentzoil kloruro (Sigma-Aldrich) gehitu zitzaizkion LC kalitateko ACNari. Lagina laburki zurrunbiloan irabiatu zen eta ondoren 21.000 g-tan zentrifugatu zen 5 minutuz 20 °C-tan. Garbitutako gainnadantea 2 ml-ko autolagingailu-fiala batera eraman, beirazko txertatze konikoa duena (200 μl-ko bolumena). Laginak Acquity iClass ultra-high performance LC sistema (Waters) erabiliz aztertu ziren, Q-Exactive (QE)-HF (Ultra High Field Orbitrap) bereizmen handiko zehaztasuneko masa-espektrometrora (Thermo Fisher Scientific) konektatuta. Analisia egiteko, deribatutako laginaren 2 μl 100 × 1,0 mm-ko silize T3 zutabe batean (Waters) injektatu ziren, 1,8 μm-ko partikulak zituena. Emari-abiadura 100 μl/min da, eta buffer sistema A bufferrak (10 mM amonio formiatoa eta % 0,15 azido formikoa uretan) eta B bufferrak (ACN) ditu. Gradientea honako hau da: % 0 B 0 minututan; % 0 B. % 0tik % 15era B 0tik 0,1 minutura; % 15etik % 17ra B 0,1etik 0,5 minutura; B % 17tik % 55era 0,5etik 14 minutura; B % 55etik % 70era 14tik 14,5 minutura; % 14,5etik % 70era B 18 minutura; % 100eko B 18tik 19 minutura; % 100etik % 0ra B 19tik 19,1 minutura; % 0ko B 19,1etik 28 minutura (55, 56). QE-HF masa-espektrometroak ionizazio positiboko moduan funtzionatzen du, 50 eta 750 arteko m/z (masa/karga erlazioa) masa-tartearekin. Aplikatutako bereizmena 60.000 da, eta lortutako irabazi-kontroleko (AGC) ioi-helburua 3×106 da, eta ioi-denbora maximoa 100 milisegundokoa da. Berotutako elektroihinztadura bidezko ionizazio-iturriak (ESI) 3,5 kV-ko ihinztadura-tentsioan, 250 °C-ko kapilar-tenperaturan, 60 AU-ko zorro-aire-fluxuan (unitate arbitrarioak) eta 20 AU-ko aire-fluxu laguntzailean funtzionatzen du. 250 °C-tan. S lentea 60 AU-tan ezarrita dago.
13C-rekin markatutako azido organikoen anioi kromatografia-MS analisia. Gainerako metabolito prezipitatua (55 μl) Dionex ioi kromatografia sistema bat (ICS 5000+, Thermo Fisher Scientific) erabiliz aztertu zen, QE-HF masa espektrometro batera (Thermo Fisher Scientific) konektatuta. Laburbilduz, 5 μl metabolito-estraktu HPLCz hornitutako Dionex IonPac AS11-HC zutabe batean injektatu ziren (2 mm × 250 mm, partikula-tamaina 4 μm, Thermo Fisher Scientific) push-in begizta partzialeko moduan, 1eko betetze-erlazioarekin.) Dionex IonPac AG11-HC guard zutabea (2 mm x 50 mm, 4 μm, Thermo Fisher Scientific). Zutabearen tenperatura 30 °C-tan mantentzen da, eta autolagintzailea 6 °C-tan ezartzen da. Erabili ur desionizatua duen potasio hidroxido kartutxo bat potasio hidroxido gradiente bat sortzeko eluente-sortzailearen bidez. Metabolitoen bereizketa 380 μl/min-ko fluxu-abiaduran, gradiente hau aplikatuz: 0tik 3 minutura, 10 mM KOH; 3tik 12 minutura, 10tik 50 mM KOH; 12tik 19 minutura, 50tik 100 mM KOH; 19tik 21 minutura, 100 mM KOH; 21etik 21,5 minutura, 100tik 10 mM KOH. Zutabea berriro orekatu zen 10 mM KOH-rekin 8,5 minutuz.
Elututako metabolitoak 150 μl/min-ko isopropanol osagarri-jario batekin konbinatzen dira zutabearen ondoren, eta ondoren, ionizazio negatibo moduan funtzionatzen duen bereizmen handiko masa-espektrometro batera bideratzen dira. MS-k m/z 50etik 750era bitarteko masa-tartea kontrolatzen du, 60.000ko bereizmenarekin. AGC 1×106-ra ezarrita dago, eta ioi-denbora maximoa 100 ms-tan mantentzen da. Berotutako ESI iturria 3,5 kV-ko ihinztadura-tentsioan erabili zen. Ioi-iturriaren beste ezarpenak hauek dira: kapilar-tenperatura 275 °C; zorro-gasaren fluxua, 60 AU; gas laguntzailearen fluxua, 20 AU 300 °C-tan, eta S lentearen ezarpena 60 AU-tan.
13C markatutako metabolitoen datuen analisia. Isotopoen erlazioaren datuen analisia egiteko, TraceFinder softwarea (4.2 bertsioa, Thermo Fisher Scientific) erabili da. Konposatu bakoitzaren identitatea erreferentziazko konposatu fidagarri batekin egiaztatu eta modu independentean aztertu da. Isotopoen aberaste-analisia egiteko, 13C isotopo (Mn) bakoitzaren ioi kromatogramaren (XIC) azalera [M + H] + -tik atera da, non n helburu-konposatuaren karbono-zenbakia den, aminoazidoak aztertzeko erabiltzen dena edo [MH] + anioiak aztertzeko erabiltzen dena. XIC-ren masa-zehaztasuna milioiko bost zati baino txikiagoa da, eta RT-ren zehaztasuna 0,05 minutukoa da. Aberaste-analisia detektatutako isotopo bakoitzaren eta dagokion konposatuaren isotopo guztien baturaren arteko erlazioa kalkulatuz egiten da. Erlazio hauek isotopo bakoitzerako ehuneko balio gisa ematen dira, eta emaitzak aberaste-ehuneko molar gisa (MPE) adierazten dira, aurretik deskribatu bezala (42).
Neurona pellet izoztua % 80ko metanol izoztuan (v/v) homogeneizatu zen, zurrunbiloan irabiatu eta -20 °C-tan inkubatu zen 30 minutuz. Lagina berriro zurrunbiloan irabiatu eta +4 °C-tan irabiatu 30 minutuz. Lagina 21.000 g-tan zentrifugatu zen 5 minutuz 4 °C-tan, eta ondoren, lortutako gainnadantea bildu eta SpeedVac kontzentratzaile bat erabiliz lehortu zen 25 °C-tan ondorengo analisietarako. Goian deskribatu bezala, LC-MS analisia egin zen sailkatutako zelulen aminoazidoetan. TraceFinder erabiliz (4.2 bertsioa, Thermo Fisher Scientific), datuen analisia konposatu bakoitzaren masa monoisotopikoa erabiliz egin zen. Metabolitoen datuen normalizazio kuantila preprocessCore software paketea (57) erabiliz egin zen.
Xerraren prestaketa. Sagua azkar anesteziatu zen karbono dioxidoarekin eta burua moztu zitzaion, garuna azkar kendu zitzaion burezurretik, eta izotzez betetako bibrazio-labana (HM-650 V, Thermo Fisher Scientific, Walldorf, Alemania) erabili zen 300 eta 375 μm-ko sekzio sagitaletan mozteko. Karbono hotzeko gasifikazioa (% 95 O2 eta % 5 CO2). Ca2 baxua + ACSF (125.0 mM NaCl, 2.5 mM KCl, 1.25 mM sodio fosfato bufferra, 25.0 mM NaHCO3, 25.0 mM d-glukosa, 1.0 mM CaCl2 eta 6.0 mM MgCl2. pH 7.4ra eta 310 eta 330 mOsm artean egokitu. Lortutako garuneko xerra hauek Ca2 + ACSF kontzentrazio handiagoa duen ganbera batera eraman (125.0 mM NaCl, 2.5 mM KCl, 1.25 mM sodio fosfato bufferra, 25.0 mM NaHCO3, 25.0 mM d-glukosa, 4.0 mM CaCl2 eta 3.5 mM MgCl2) pH 7.4 eta 310 eta 320 mOsm artean). Gorde xerra hauek 20-30 minutuz, grabatu aurretik leheneratu ahal izateko.
grabaketa. Grabaketa guztietarako, grabaketa-ganbera finko batekin eta 20x uretan murgiltzeko lente objektibo batekin (Scientifica) hornitutako mikroskopio-plataforma bat erabili zen. Ustezko Purkinje zelulak identifikatu ziren (i) gorputzaren tamaina, (ii) zerebeloaren kokapen anatomikoa eta (iii) mtYFP erreporter gene fluoreszentearen adierazpena erabiliz. 5 eta 11 megaohmio arteko punta-erresistentzia duen adabaki-pipeta borosilikatozko beirazko kapilar batekin (GB150-10, 0,86 mm × 1,5 mm × 100 mm, Science Products, Hofheim, Alemania) eta Instruments (P-1000, Sutter), Novato, CA) pipeta horizontal batekin ateratzen da. Grabaketa guztiak ELC-03XS npi adabaki-klamp anplifikadorearekin (npi electronic GmbH, Tam, Alemania) egin ziren, Signal softwareak kontrolatzen zuena (6.0 bertsioa, Cambridge Electronic, Cambridge, Erresuma Batua). Esperimentua 12,5 kHz-ko laginketa-tasan grabatu zen. Seinalea bi Bessel iragazki laburrekoekin iragazten da, 1,3 eta 10 kHz-ko ebakitze-maiztasunekin, hurrenez hurren. Mintzaren eta pipetaren kapazitantzia anplifikadorearen bidez konpentsatzen da konpentsazio-zirkuitu baten bidez. Esperimentu guztiak Orca-Flash 4.0 kamera baten (Hamamatsu, Gerden, Alemania) kontrolpean egin ziren, eta kamera hori Hokawo softwareak kontrolatzen zuen (2.8 bertsioa, Hamamatsu, Gerden, Alemania).
Zelula osoen konfigurazio eta analisi arrunta. Grabatu aurretik, bete pipeta barne-disoluzioarekin, honako substantzia hauek dituena: 4,0 mM KCl, 2,0 mM NaCl, 0,2 mM EGTA, 135,0 mM potasio glukonato, 10,0 mM Hepes, 4,0 mM ATP (Mg), 0,5 mM guanosina trifosfatoa (GTP) (Na) eta 10,0 mM kreatinina fosfatoa pH 7,25era egokitu ziren, eta presio osmotikoa 290 mOsm (sakarosa) izan zen. Mintza hausteko 0 pA-ko indarra aplikatu ondoren, atseden-mintzeko potentziala neurtu zen. Sarrerako erresistentzia -40, -30, -20 eta -10 pA-ko korronte hiperpolarizatuak aplikatuz neurtzen da. Neurtu tentsio-erantzunaren magnitudea eta erabili Ohm-en legea sarrerako erresistentzia kalkulatzeko. Jarduera espontaneoa tentsio-pintza batean erregistratu zen 5 minutuz, eta sPSC identifikatu eta neurtu zen Igor Pro-n (32 7.01 bertsioa, WaveMetrics, Lake Oswego, Oregon, AEB) aitortze erdiautomatikoko script bat erabiliz. IV kurba eta egoera egonkorreko korrontea neurtzen dira bateria potentzial desberdinetan pitzatuz (-110 mV-tik hasita) eta tentsioa 5 mV-ko urratsetan handituz. AP-ren ekoizpena despolarizatzaile-korronte bat aplikatuz probatu zen. Pitza ezazu zelula -70 mV-tan despolarizatzaile-korrontearen pultsu bat aplikatzen duzun bitartean. Doitu grabazio-unitate bakoitzaren urrats-tamaina bereizita (10etik 60 pA-ra). Kalkulatu AP maiztasun maximoa, AP maiztasun handiena eragiten duten pultsu-puntak eskuz zenbatuz. AP atalasea aztertzen da AP bat edo gehiago lehenengo abiarazten dituen despolarizatzaile-pultsuaren bigarren deribatua erabiliz.
Adabaki zulatuen konfigurazioa eta azterketa. Egin adabaki zulatuen erregistroa protokolo estandarrak erabiliz. Erabili ATP eta GTP gabeko pipeta bat, osagai hauek ez dituena: 128 mM glukonato K, 10 mM KCl, 10 mM Hepes, 0,1 mM EGTA eta 2 mM MgCl2, eta egokitu pH 7,2ra (KOH erabiliz). ATP eta GTP zelula barruko disoluziotik kanpo uzten dira zelula mintzaren iragazkortasun kontrolaezina saihesteko. Adabaki pipeta anfoterizina duen barne-disoluzio batekin betetzen da (gutxi gorabehera 200 eta 250 μg/ml artean; G4888, Sigma-Aldrich) adabaki zulatuen erregistro bat lortzeko. Anfoterizina dimetil sulfoxidoan disolbatu zen (azken kontzentrazioa: % 0,1etik % 0,3ra; DMSO; D8418, Sigma-Aldrich). Erabilitako DMSO kontzentrazioak ez zuen eragin nabarmenik izan aztertutako neuronengan. Zulatze-prozesuan zehar, kanalaren erresistentzia (Ra) etengabe kontrolatu zen, eta esperimentua Ra eta AP-ren anplitudea egonkortu ondoren hasi zen (20-40 minutu). Jarduera espontaneoa tentsio eta/edo korronte-pintza batean neurtzen da 2 eta 5 minutuz. Datuen analisia Igor Pro (7.05.2 bertsioa, WaveMetrics, AEB), Excel (2010 bertsioa, Microsoft Corporation, Redmond, AEB) eta GraphPad Prism (8.1.2 bertsioa, GraphPad Software Inc., La Jolla, CA) erabiliz egin zen. AP espontaneoak identifikatzeko, IgorPro-ren NeuroMatic v3.0c plugina erabiltzen da. Identifikatu AP-ak automatikoki erregistro bakoitzerako banan-banan doitzen den atalase jakin bat erabiliz. Puntaren tartea erabiliz, zehaztu puntuaren maiztasun maximo berehalakoa eta puntuaren batez besteko maiztasuna duen puntuaren maiztasuna.
PN isolamendua. Aurretik argitaratutako protokoloari egokituz, PNak saguaren zerebelotik purifikatu ziren etapa zehatz batean (58). Laburbilduz, zerebeloa disekzionatu eta xehatu egin zen izotzez hoztutako disoziazio-ingurune batean [HBSS Ca2+ eta Mg2+ gabe, 20 mM glukosa, penizilina (50 U/ml) eta estreptomizina (0,05 mg/ml) osatuta], eta ondoren ingurunea papainan digeritu [HBSS, 1-zisteina·HCl (1 mg/ml), papainarekin (16 U/ml) eta desoxirribonukleasa I (DNase I; 0,1 mg/ml) osatuta]. Tratatu 30 minutuz 30 °C-tan. Lehenik eta behin, garbitu ehunak arrautza-mukusa (10 mg/ml), BSA (10 mg/ml) eta DNasa (0,1 mg/ml) dituen HBSS medioan giro-tenperaturan, digestio entzimatikoa saihesteko, eta ondoren, 20 mM glukosa duen HBSS medioan. HBSS-n astiro-astiro ehoz, penizilina (50 U/ml), estreptomizina (0,05 mg/ml) eta DNasa (0,1 mg/ml) askatu ziren zelula bakarrak. Sortutako zelulen suspentsioa 70 μm-ko zelula-iragazki batetik iragazi zen, ondoren zelulak zentrifugazio bidez pelletatu ziren (1110 rpm, 5 minutu, 4 °C) eta sailkatze-medioan berriro eseki ziren [HBSS, 20 mM glukosarekin osatua, % 20 behi-fetuaren seruma, penizilina (50 U/ml) eta estreptomizina (0,05 mg/ml)]; ebaluatu zelulen bideragarritasuna propidio ioduroarekin eta egokitu zelulen dentsitatea 1 × 10⁶ eta 2 × 10⁶ zelula/ml artean. Zitometria egin aurretik, suspentsioa 50 μm-ko zelula-iragazki batetik iragazi zen.
Zitometro-fluxua. Zelulen sailkapena 4 °C-tan egin zen FACSAria III makina (BD Biosciences) eta FACSDiva softwarea (BD Biosciences, 8.0.1 bertsioa) erabiliz. Zelulen esekidura 100 μm-ko tobera bat erabiliz sailkatu zen, 20 psi-ko presiopean, ~2800 gertaera/seg-ko abiaduran. Ohiko ate-irizpideek (zelulen tamaina, bereizketa bimodala eta sakabanaketa-ezaugarriak) ezin dutenez PN beste zelula motetatik behar bezala isolatzea bermatu, ate-estrategia mitoYFP+ ​​eta kontrol mitoYFP − saguetan YFP intentsitatearen eta autofluoreszentziaren zuzeneko konparazioan oinarritzen da. YFP lagina 488 nm-ko laser-lerro batekin irradiatuz kitzikatzen da, eta seinalea 530/30 nm-ko banda-iragazki bat erabiliz detektatzen da. MitoYFP+ ​​saguetan, Rosa26-mitoYFP erreporter genearen indar erlatiboa ere erabiltzen da neuronen gorputzaren eta axoi-zatiak bereizteko. 7-AAD 561 nm-ko laser hori batekin kitzikatzen da eta 675/20 nm-ko banda-iragazki batekin detektatzen da zelula hilak baztertzeko. Astrozitoak aldi berean bereizteko, zelula-suspentsioa ACSA-2-APC-rekin tindatu zen, ondoren lagina 640 nm-ko laser-lerro batekin irradiatu zen, eta 660/20 nm-ko banda-iragazki bat erabili zen seinalea detektatzeko.
Bildutako zelulak zentrifugazio bidez pelletatu ziren (1110 rpm, 5 minutu, 4 °C) eta -80 °C-tan gorde ziren erabili arte. Mfn2cKO saguak eta haien kumeak egun berean sailkatzen dira prozeduraren aldakortasuna minimizatzeko. FACS datuen aurkezpena eta analisia FlowJo softwarea erabiliz egin ziren (FlowJo LLC, Ashland, Oregon, AEB).
Goian aipatu bezala (59), denbora errealeko PCR erabiltzen da sailkatutako neuronetatik DNA isolatzeko, ondorengo mtDNA kuantifikatzeko. Linealtasuna eta atalase-sentsibilitatea hasieran qPCR zelula kopuru desberdinetan exekutatuz probatu ziren. Laburbilduz, bildu 300 PN 50 mM tris-HCl (pH 8,5), 1 mM EDTA, % 0,5 Tween 20 eta proteinasa K (200 ng/ml) dituen lisi-bufferrean eta inkubatu 55 °C-tan 120 minutuz. Zelulak 95 °C-tan inkubatu ziren 10 minutuz proteinasa K-ren inaktibazio osoa ziurtatzeko. mt-Nd1-erako espezifikoa den TaqMan zunda bat (Thermo Fisher) erabiliz, mtDNA PCR erdi-kuantitatibo bidez neurtu zen 7900HT Denbora Errealeko PCR sisteman (Thermo Fisher Scientific). Science, Mm04225274_s1 katalogo zenbakia), mt-Nd6 (Thermo Fisher Scientific, AIVI3E8 katalogo zenbakia) eta 18S (Thermo Fisher Scientific, Hs99999901_s1 katalogo zenbakia) geneak.
Proteomaren laginaren prestaketa. Disoluzioa 95 °C-tan 10 minutuz berotu eta sonikatuz, lisi-bufferrean [6 M guanidina kloruroa, 10 mM tris(2-karboxietil) fosfina hidrokloruroa, 10 mM kloroazetamida eta 100 mM tris-Lisatu neurona izoztuen pelletak HCl-tan]. Bioruptor-ean (Diagenode) 10 minutuz (30 segundoko pultsu / 30 segundoko etenaldi-aldia). Lagina 20 mM tris-HCl-tan (pH 8.0) 1:10 diluitu zen, 300 ng tripsina urrearekin (Promega) nahastu zen eta gau osoan inkubatu zen 37 °C-tan digestio osoa lortzeko. Bigarren egunean, lagina 20.000 g-tan zentrifugatu zen 20 minutuz. Gainnatzailea % 0,1eko azido formikoarekin diluitu zen, eta disoluzioa gatzgabetu zen auto-egindako StageTips-ekin. Lagina SpeedVac tresna batean (Eppendorf concentrator plus 5305) lehortu zen 45 °C-tan, eta ondoren peptidoa % 0,1eko azido formikoan eseki zen. Lagin guztiak pertsona berak prestatu zituen aldi berean. Astrozitoen laginak aztertzeko, 4 μg gatzgabetutako peptidoak tandem masa etiketa batekin markatu ziren (TMT10plex, 90110 katalogo zenbakia, Thermo Fisher Scientific), peptidoaren eta TMT erreaktiboaren arteko 1:20 proportzioarekin. TMT markaketarako, 0,8 mg TMT erreaktibo 70 μl ACN anhidrotan berriro eseki ziren, eta lehortutako peptidoa 9 μl 0,1 M TEAB (trietilamonio bikarbonatoa)-tan berreraiki zen, eta horri 7 μl TMT erreaktibo ACN-tan gehitu zitzaion. Kontzentrazioa % 43,75ekoa zen. 60 minutuko inkubazioaren ondoren, erreakzioa % 5eko hidroxilamina 2 μlrekin itzali zen. Etiketatutako peptidoak bildu, lehortu, % 0,1eko azido formiko (FA) 200 μl-tan berriro eseki, bitan banatu eta, ondoren, gatzgabetu egin ziren eurek egindako StageTip puntak erabiliz. UltiMate 3000 ultra errendimendu handiko likido kromatografoa erabiliz (UltiMate 3000 ultra errendimendu handiko likido kromatografoa), bi erdietako bat frakzionatu zen 1 mm x 150 mm-ko Acquity kromatografia zutabe batean, 130 Å1,7 μm-ko C18 partikulez beteta (Waters, katalogo zenbakia: SKU: 186006935). Thermo Fisher Scientific). Banandu peptidoak 30 μl/min-ko emarian, banandu % 1etik % 50era bitarteko B bufferrean 85 minutuz 96 minutuko gradiente mailakatu batekin, % 50etik % 95era bitarteko B bufferrean 3 minutuz, eta ondoren 8 minutu % 95eko B bufferrean; A bufferra % 5eko ACN eta 10 mM-ko amonio bikarbonatoa (ABC) da, eta B bufferra % 80ko ACN eta 10 mM-ko ABC. Bildu frakzioak 3 minuturo eta konbinatu bi taldetan (1 + 17, 2 + 18, etab.) eta lehortu hutsean zentrifuga batean.
LC-MS/MS analisia. Masa-espektrometriarako, peptidoak (r119.aq zenbakia) 25 cm-ko eta 75 μm-ko barne-diametroko PicoFrit zutabe analitiko batean (lente objektibo berria, PF7508250 pieza-zenbakia) bereizi ziren, 1,9 μm-ko ReproSil-Pur 120 C18-AQ medioarekin (Dr. Maisch, mat) hornituta. Erabili EASY-nLC 1200 (Thermo Fisher Scientific, Alemania). Zutabea 50 °C-tan mantendu zen. A eta B bufferrak % 0,1eko azido formikoa uretan eta % 0,1eko azido formikoa % 80ko ACN-tan dira, hurrenez hurren. Peptidoak % 6tik % 31ra bitarteko B bufferrean bereizi ziren 65 minutuz eta % 31tik % 50era bitarteko B bufferrean 5 minutuz, 200 nl/min-ko gradiente batekin. Elututako peptidoak Orbitrap Fusion masa-espektrometro batean aztertu ziren (Thermo Fisher Scientific). Peptido aitzindariaren m/z neurketa 120.000ko bereizmenarekin egiten da, 350 eta 1500 m/z arteko tartean. % 27ko talka-energia normalizatua erabiliz, 2 eta 6 arteko karga-egoera duen aitzindaririk indartsuena hautatzen da energia handiko C tranpa disoziazio (HCD) ebakidurarako. Ziklo-denbora 1 s-tan ezartzen da. Peptido-zatiaren m/z balioa ioi-tranpan neurtu zen, 5×104 AGC jomuga txikiena eta 86 ms-ko injekzio-denbora maximoa erabiliz. Zatikatutakoaren ondoren, aitzindaria bazterketa dinamikoaren zerrendan jarri zen 45 s-rako. TMTz markatutako peptidoak 50 cm-ko eta 75 μm-ko Acclaim PepMap zutabe batean (Thermo Fisher Scientific, 164942 katalogo zenbakia) bereizi ziren, eta migrazio espektroak Orbitrap Lumos Tribrid masa espektrometro batean (Thermo Fisher Scientific) aztertu ziren, eremu handiko uhin-forma asimetrikoko ioien (FAIMS) ekipamenduarekin (Thermo Fisher Scientific) hornitua, bi konpentsazio-tentsiotan funtzionatzen duena: −50 eta −70 V. Sinkronizazio aitzindariaren arabera hautatutako MS3 erabiltzen da TMT txostenaren ioi-seinalearen neurketarako. Peptidoen bereizketa EASY-nLC 1200-n egin zen, % 90eko gradiente linealaren eluzioa erabiliz, % 6tik % 31ra bitarteko buffer-kontzentrazioarekin; A bufferra % 0,1 FA zen, eta B bufferra % 0,1 FA eta % 80 ACN. Analisi-zutabea 50 °C-tan funtzionatzen du. Erabili FreeStyle (1.6 bertsioa, Thermo Fisher Scientific) jatorrizko fitxategia FAIMS konpentsazio-tentsioaren arabera zatitzeko.
Proteinen identifikazioa eta kuantifikazioa. Andromeda bilaketa-motor integratua erabiliz, jatorrizko datuak MaxQuant 1.5.2.8 bertsioa erabiliz aztertu ziren (https://maxquant.org/). Aequorea victoria-tik lortutako Cre errekonbinasa eta YFP sekuentziez gain, peptido zatien espektroetan bilatu zen saguaren erreferentzia proteomaren sekuentzia kanonikoa eta isoforma sekuentzia (Proteome ID UP000000589, UniProt-etik 2017ko maiatzean deskargatua). Metioninaren oxidazioa eta proteinen N-terminal azetilazioa aldaketa aldakor gisa ezarri ziren; zisteinaren karbamoil metilazioa aldaketa finko gisa ezarri zen. Digestio-parametroak "espezifikotasuna" eta "tripsina/P" gisa ezarri dira. Proteinak identifikatzeko erabilitako peptido eta bizarra peptido kopuru minimoa 1 da; peptido bakar kopuru minimoa 0 da. Peptidoen maparen parekatze-baldintzetan, proteinen identifikazio-tasa 0,01 izan zen. "Bigarren Peptidoa" aukera gaituta dago. Erabili "errendimenduen arteko bat etortzea" aukera identifikazio arrakastatsuak jatorrizko fitxategi desberdinen artean transferitzeko. Erabili LFQ gutxieneko erlazio kontaketa 1 etiketa gabeko kuantifikaziorako (LFQ) (60). LFQ intentsitatea gutxienez bi balio baliodun iragazten da genotipo talde batean gutxienez denbora-puntu bakoitzean, eta 0,3ko zabalera duen banaketa normal batetik estrapolatzen da eta 1,8 behera mugitzen da. Erabili Perseus konputazio plataforma (https://maxquant.net/perseus/) eta R (https://r-project.org/) LFQ emaitzak aztertzeko. Limma software paketeko bi norabideko t test moderatua erabili zen adierazpen diferentzialaren analisirako (61). Datuen analisi esploratorioa ggplot, FactoMineR, factoextra, GGally eta pheatmap erabiliz egiten da. TMT oinarritutako proteomika datuak MaxQuant 1.6.10.43 bertsioa erabiliz aztertu ziren. Bilatu proteomika datu gordinak UniProt-en giza proteomika datu-basetik, 2018ko irailean deskargatu zena. Analisiak fabrikatzaileak emandako isotopoen purutasun zuzenketa faktorea barne hartzen du. Erabili limma R-n adierazpen diferentzialaren analisia egiteko. Jatorrizko datuak, datu-basearen bilaketaren emaitzak eta datuen analisi-lan-fluxua eta emaitzak ProteomeXchange aliantzan gordetzen dira PRIDE bazkideen biltegiaren bidez, PXD019690 datu-multzoaren identifikatzailearekin.
Funtzio-anotazioek analisia aberasten dute. Ingenuity Pathway Analysis (QIAGEN) tresna erabili zen datu-multzoaren funtzio-anotazioen terminoen aberastasuna zehazteko 8 astetan (1. irudia). Laburbilduz, LC-MS/MS (tandem masa-espektrometria) datuen analisitik lortutako proteina-zerrenda kuantitatiboa erabiltzen da honako iragazki-irizpide hauekin: Mus musculus hautatzen da espezie eta atzeko plano gisa, eta kategoriak Benjaminik doitutako P balioa erakusten du, 0,05 edo txikiagoa den aberastasunerako esanguratsutzat jotzen dena. Grafiko honetarako, multzo bakoitzeko bost gehiegizko kategoria nagusiak erakusten dira, doitutako P balioan oinarrituta. T-proba anizkoitza erabiliz, Benjamini, Krieger eta Yekutieliren bi faseko bultzada lineal programa erabiliz (Q = 5%), denbora-ibilbideko proteinen adierazpen-analisia egiten da kategoria bakoitzean identifikatutako hautagai garrantzitsuetan, eta errenkada bakoitza bereizita aztertzen da. Ez dago SD koherente bat hartu beharrik.
Ikerketa honen emaitzak argitaratutako datu-baseekin alderatzeko eta 1. irudian Venn diagrama bat sortzeko, proteina-zerrenda kuantitatiboa MitoCarta 2.0 anotazioekin konbinatu dugu (24). Erabili Draw Venn Diagram (http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/Venn/) online tresna diagrama sortzeko.
Proteomikaren analisirako erabilitako prozedura estatistikoei buruzko informazio zehatza lortzeko, jo ezazu Materialak eta Metodoak atalera. Bestelako esperimentu guztietarako, informazio zehatza dagokion legendan aurki daiteke. Bestelakorik zehaztu ezean, datu guztiak batez besteko ± SEM gisa adierazten dira, eta analisi estatistiko guztiak GraphPad Prism 8.1.2 softwarea erabiliz egin ziren.
Artikulu honetarako material osagarriak lortzeko, ikus http://advances.sciencemag.org/cgi/content/full/6/35/eaba8271/DC1
Artikulu hau Creative Commons Aitortu-EzKomertziala Lizentziaren baldintzen arabera banatzen da, eta edozein euskarritan erabiltzea, banatzea eta erreproduzitzea baimentzen du, betiere azken erabilera ez bada irabazi komertzialik lortzeko eta jatorrizko lana zuzena dela bada premisa. Erreferentzia.
Oharra: Zure helbide elektronikoa ematea baino ez dizugu eskatzen, orrialdera gomendatzen duzun pertsonak mezu elektronikoa ikustea nahi duzula eta spam-a ez dela jakin dezan. Ez dugu helbide elektronikorik hartuko.
Galdera hau bisitaria zaren ala ez egiaztatzeko eta spam bidalketa automatikoa saihesteko erabiltzen da.
Egileak: E. Motori, I. Atanassov, SMV Kochan, K. Folz-Donahue, V. Sakthivelu, P. Giavalisco, N. Toni, J. Puyal, N.-G. Larson
Neurona disfuntzionalen proteomikaren analisiak agerian utzi zuen programa metabolikoak aktibatzen direla neuroendekapena geldiarazteko.
Egileak: E. Motori, I. Atanassov, SMV Kochan, K. Folz-Donahue, V. Sakthivelu, P. Giavalisco, N. Toni, J. Puyal, N.-G. Larson
Neurona disfuntzionalen proteomikaren analisiak agerian utzi zuen programa metabolikoak aktibatzen direla neuroendekapena geldiarazteko.
©2020 Zientziaren Aurrerapenerako Amerikako Elkartea. eskubide guztiak erreserbatuta. AAAS HINARI, AGORA, OARE, CHORUS, CLOCKSS, CrossRef eta COUNTER-en bazkidea da. ScienceAdvances ISSN 2375-2548.