Eskerrik asko Nature.com bisitatzeagatik. Erabiltzen ari zaren nabigatzailearen bertsioak CSS euskarri mugatua du. Emaitza onenak lortzeko, gomendatzen dizugu zure nabigatzailearen bertsio berriago bat erabiltzea (edo Internet Explorer-en bateragarritasun modua desgaitzea). Bitartean, etengabeko laguntza bermatzeko, gunea estilo edo JavaScript gabe erakusten ari gara.
Azido propionikoa (PPA) erabiltzen da mitokondrioen disfuntzioak neurogarapeneko nahasmenduetan, hala nola autismoaren espektroaren nahasmenduan, duen eginkizuna aztertzeko. Jakina da PPAk mitokondrioen biogenesia, metabolismoa eta birsorkuntza eten egiten dituela. Hala ere, PPAk mitokondrioen dinamikan, fisioan eta fusioan dituen eraginak problematikoak dira oraindik, mekanismo horien izaera tenporal konplexua dela eta. Hemen, irudi-teknika kuantitatibo osagarriak erabiltzen ditugu PPAk neurona itxurako SH-SY5Y zelulen mitokondrioen ultraegitura, morfologia eta dinamikan nola eragiten duen ikertzeko. PPAk (5 mM) mitokondrioen azaleran (p < 0,01), Fereten diametroan eta zirkunferentzian (p < 0,05) eta 2. azaleran (p < 0,01) jaitsiera nabarmena eragin zuen. Mitokondrioen gertaeren lokalizatzailearen analisiak fisio eta fusio gertaeren igoera nabarmena (p < 0,05) erakutsi zuen, horrela mitokondrioen sarearen osotasuna mantenduz estres baldintzetan. Gainera, cMYC (p < 0,0001), NRF1 (p < 0,01), TFAM (p < 0,05), STOML2 (p < 0,0001) eta OPA1 (p < 0,05) mRNAren adierazpena nabarmen murriztu zen. 01). Honek mitokondrioen morfologia, biogenesia eta dinamika birmoldatzen direla erakusten du estres baldintzetan funtzioa mantentzeko. Gure datuek PPAk mitokondrioen dinamikan dituen eraginei buruzko ikuspegi berria ematen dute eta irudi-tekniken erabilgarritasuna azpimarratzen dute mitokondrioen estres-erantzunetan parte hartzen duten erregulazio-mekanismo konplexuak aztertzeko.
Mitokondrioak funtsezko parte-hartzaileak dira hainbat zelula-funtziotan, energia-ekoizpenean eta biosintesian duten ohiko eginkizunaz gain. Mitokondrioen metabolismoa kaltzioaren seinaleztapenaren, homeostasi metabolikoaren eta erredoxaren, seinaleztapen inflamatorioaren, aldaketa epigenetikoen, zelulen ugalketaren, bereizketaren eta zelulen heriotza programatuaren erregulatzaile nagusia da1. Bereziki, mitokondrioen metabolismoa funtsezkoa da neuronen garapenerako, biziraupenerako eta funtziorako, eta neuropatologiaren hainbat adierazpenetan inplikatuta dago2,3,4.
Azken hamarkadan, egoera metabolikoa neurogenesiaren, bereizketaren, heltze-prozesuaren eta plastizitatearen erregulatzaile zentral gisa agertu da5,6. Duela gutxi, mitokondrioen morfologia eta dinamika mitosiaren osagai garrantzitsu bihurtu dira, zelulen barruan mitokondrio osasuntsuen multzo bat mantentzen duen prozesu dinamikoa. Mitokondrioen dinamika bide konplexu eta elkarren mendekoek erregulatzen dute, mitokondrioen biogenesi eta bioenergetikatik hasi eta mitokondrioen fisio, fusio, garraio eta garbiketaraino7,8. Integrazio-mekanismo horietako edozein etentzeak mitokondrio-sare osasuntsuen mantentzea kaltetzen du eta ondorio funtzional sakonak ditu neurogarapenean9,10. Izan ere, mitokondrioen dinamikaren deserregulazioa nahasmendu psikiatriko, neuroendekapenezko eta neurogarapeneko askotan ikusten da, besteak beste, autismoaren espektroko nahasmenduetan (AEN)11,12.
ASD garapen neurologikoko nahaste heterogeneoa da, arkitektura genetiko eta epigenetiko konplexua duena. ASDren heredagarritasuna ukaezina da, baina azpiko etiologia molekularra oraindik ez da ondo ulertzen. Aurrekliniko ereduetatik, ikerketa klinikoetatik eta multi-omikako datu-multzo molekularretatik lortutako datuek gero eta ebidentzia handiagoa ematen dute ASDn mitokondrioen disfuntzioaren inguruan13,14. Aurretik, ASD duten pazienteen kohorte batean DNA metilazio-baheketa bat egin genuen eta mitokondrioen bide metabolikoetan zehar multzokatutako gene metilatu desberdinak identifikatu genituen15. Ondoren, mitokondrioen biogenesiaren eta dinamikaren erregulatzaile zentralen metilazio diferentziala jakinarazi genuen, eta hori mtDNAren kopia-kopuruaren igoerarekin eta gernu-profil metabolikoaren aldaketarekin lotuta zegoen ASDn16. Gure datuek gero eta ebidentzia handiagoa ematen dute mitokondrioen dinamikak eta homeostasiak zeregin nagusia betetzen dutela ASDren patofisiologian. Beraz, mitokondrioen dinamikaren, morfologiaren eta funtzioaren arteko harremanaren ulermen mekanistikoa hobetzea da bigarren mailako mitokondrioen disfuntzioak ezaugarritzen dituen gaixotasun neurologikoei buruzko ikerketaren helburu nagusia.
Teknika molekularrak sarritan erabiltzen dira gene espezifikoek mitokondrioen estres-erantzunetan duten eginkizuna aztertzeko. Hala ere, ikuspegi hau mugatua izan daiteke mitosiaren kontrol-mekanismoen izaera anitzeko eta tenporala dela eta. Gainera, mitokondrioen geneen adierazpen diferentziala funtzio-aldaketak nabarmentzen diren adierazle zeharkakoa da, batez ere gene kopuru mugatu bat baino ez delako aztertzen normalean. Hori dela eta, mitokondrioen funtzioa eta bioenergetika aztertzeko metodo zuzenagoak proposatu dira17. Mitokondrioen morfologia mitokondrioen dinamikarekin oso lotuta dago. Mitokondrioen forma, konektibitatea eta egitura funtsezkoak dira energia-ekoizpenerako eta mitokondrioen eta zelulen biziraupenerako5,18. Gainera, mitosiaren osagai desberdinek mitokondrioen morfologian izandako aldaketetan jartzen dute arreta, eta horiek mitokondrioen disfuntzioaren amaiera-puntu erabilgarri gisa balio dezakete eta ondorengo mekanisten ikerketarako oinarri bat eman.
Mitokondrioen morfologia zuzenean behatu daiteke transmisio-mikroskopia elektronikoa (TEM) erabiliz, zelulen ultraegituraren azterketa zehatza ahalbidetuz. TEMek zuzenean bistaratzen ditu mitokondrioen kristalen morfologia, forma eta egitura, mitokondrio bakoitzaren bereizmenean, geneen transkripzioan, proteinen adierazpenean edo zelula-populazioetako mitokondrioen funtzio-parametroetan soilik oinarritu beharrean17,19,20. Gainera, TEMek mitokondrioen eta beste organulu batzuen arteko elkarrekintzak aztertzea errazten du, hala nola erretikulu endoplasmatikoa eta autofagosometan, zeinek funtsezko zeregina baitute mitokondrioen funtzioan eta homeostasian21,22. Beraz, TEM abiapuntu ona bihurtzen du mitokondrioen disfuntzioa aztertzeko, bide edo gene espezifikoetan zentratu aurretik. Mitokondrioen funtzioa gero eta garrantzitsuagoa bihurtzen den heinean neuropatologiarako, argi dago in vitro neurona-ereduetan mitokondrioen morfologia eta dinamika zuzenean eta kuantitatiboki aztertzeko beharrizana.
Artikulu honetan, autismoaren espektroaren nahastean mitokondrioen disfuntzioaren eredu neuronal batean mitokondrioen dinamika aztertzen dugu. Aurretik, propionil-CoA karboxilasa betaren (PCCB) metilazio diferentziala jakinarazi genuen ASD15-en, mitokondrioen propionil-CoA karboxilasa entzimaren PCC azpiunitate batean. PCCren deserregulazioak propionil deribatuen metaketa toxikoa eragiten duela ezagutzen da, azido propionikoa (PPA) barne23,24,25. PPAk neuronen metabolismoa eten eta in vivo portaera aldatzen duela frogatu da, eta ASD-n parte hartzen duten neurogarapen mekanismoak aztertzeko animalia-eredu finkatua da26,27,28. Horrez gain, PPAk mitokondrioen mintz potentziala, biogenesia eta arnasketa eten dituela jakinarazi da in vitro, eta asko erabili da neuronen mitokondrioen disfuntzioa modelatzeko29,30. Hala ere, PPAk eragindako mitokondrioen disfuntzioak mitokondrioen morfologian eta dinamikan duen eragina ez da ondo ulertzen oraindik.
Ikerketa honek irudi-teknika osagarriak erabiltzen ditu PPAk SH-SY5Y zelulen mitokondrioen morfologian, dinamikan eta funtzioan dituen efektuak kuantifikatzeko. Lehenik eta behin, TEM metodo bat garatu genuen mitokondrioen morfologian eta ultraegituran izandako aldaketak bistaratzeko17,31,32. Mitokondrioen izaera dinamikoa kontuan hartuta33, mitokondrioen gertaeren lokalizatzailearen (MEL) analisia ere erabili genuen fisio eta fusio gertaeren, mitokondrioen kopuruaren eta bolumenaren arteko orekan PPA estresaren pean gertatzen diren aldaketak kuantifikatzeko. Azkenik, aztertu genuen mitokondrioen morfologia eta dinamika biogenesian, fisioan eta fusioan parte hartzen duten geneen adierazpenaren aldaketekin lotuta dauden ala ez. Guztia hartuta, gure datuek mitokondrioen dinamika erregulatzen duten mekanismoen konplexutasuna argitzearen erronka erakusten dute. TEMen erabilgarritasuna azpimarratzen dugu mitokondrioen morfologia aztertzeko SH-SY5Y zelulen mitosiaren amaiera konbergente neurgarri gisa. Horrez gain, azpimarratzen dugu TEM datuek informazio aberatsena ematen dutela estres metabolikoari erantzunez gertaera dinamikoak ere jasotzen dituzten irudi-teknikekin konbinatzen direnean. Neuronen zelulen mitosia laguntzen duten mekanismo erregulatzaile molekularren karakterizazio gehiagok nerbio-sistemaren eta gaixotasun neurodegeneratiboen osagai mitokondrialari buruzko informazio garrantzitsua eman dezake.
Mitokondrioen estresa eragiteko, SH-SY5Y zelulak PPArekin tratatu ziren 3 mM eta 5 mM sodio propionato (NaP) erabiliz. TEM aurretik, laginak kriogenikoki prestatu ziren presio handiko izoztea eta izoztea erabiliz (1a irudia). Mitokondrioen irudien analisi-hodi automatizatu bat garatu genuen hiru errepikapen biologikotan mitokondrioen populazioen zortzi parametro morfologiko neurtzeko. Ikusi genuen PPA tratamenduak lau parametro nabarmen aldatzen zituela: 2. azalera, azalera, perimetroa eta Feret diametroa (1b-e irudiak). 2. azalera nabarmen jaitsi zen 3 mM eta 5 mM PPA tratamenduekin (p = 0,0183 eta p = 0,002, hurrenez hurren) (1b irudia), azalera (p = 0,003), perimetroa (p = 0,0106) eta Feret diametroa nabarmen jaitsi ziren bitartean. Murrizketa nabarmena (p = 0,0172) egon zen 5 mM tratamendu-taldean kontrol-taldearekin alderatuta (1c-e irudiak). Azalera eta zirkunferentziaren murrizketa esanguratsuek erakutsi zuten 5 mM PPArekin tratatutako zelulek mitokondrio txikiagoak eta biribilduagoak zituztela, eta mitokondrio horiek kontrol-zeluletakoak baino luzangagoak ez zirela. Hori Feret diametroaren murrizketa esanguratsuarekin ere bat dator, partikulen ertzen arteko distantzia handiena murriztea adierazten duen parametro independentea. Kristalei ultraegituran aldaketak ikusi ziren: kristalei PPA estresaren eraginpean gutxiago nabarmendu zitzaizkien (1a irudia, B panela). Hala ere, irudi guztiek ez zuten argi islatzen kristalei ultraegiturak, beraz, aldaketa horien analisi kuantitatiboa ez zen egin. TEM datu hauek hiru eszenatoki posible islatu ditzakete: (1) PPAk fisioa hobetzen du edo fusioa inhibitzen du, dauden mitokondrioak txikitzea eraginez; (2) biogenesi hobetuak mitokondrio berriak eta txikiagoak sortzen ditu edo (3) bi mekanismoak aldi berean eragiten ditu. Baldintza hauek ezin badira ere TEM bidez bereizi, aldaketa morfologiko esanguratsuek PPA estresaren pean mitokondrioen homeostasian eta dinamikan aldaketak adierazten dituzte. Ondoren, parametro gehigarriak aztertu genituen dinamika horiek eta horien azpian dauden mekanismo potentzialak hobeto karakterizatzeko.
Azido propionikoak (PPA) mitokondrioen morfologia birmoldatzen du. (a) Transmisio-mikroskopia elektronikoaren (TEM) irudi adierazgarriak, mitokondrioen tamaina gutxitzen dela eta mitokondrioak txikiagoak eta biribilduagoak bihurtzen direla erakusten dutenak PPA tratamendua handitu ahala; 0 mM (tratatu gabe), 3 mM eta 5 mM, hurrenez hurren. Gezi gorriek mitokondrioak adierazten dituzte. (b–e) 24 orduz PPArekin tratatutako SH-SY5Y zelulak TEMerako prestatu ziren eta emaitzak Fiji/ImageJ erabiliz aztertu ziren. Zortzi parametroetatik lauk desberdintasun esanguratsuak erakutsi zituzten kontrol-zelulen (tratatu gabe, 0 mM PPA) eta tratatutako zelulen (3 mM eta 5 mM PPA) artean. (b) 2. eskualdea, (c) Eremua, (d) Perimetroa, (e) Fereten diametroa. Bariantzaren analisi unidirekzionala (kontrola vs. tratamendua) eta Dunnett-en konparazio anitzeko testa erabili ziren desberdintasun esanguratsuak zehazteko (p < 0,05). Datu-puntuek zelula bakoitzaren batez besteko mitokondrio-balioa adierazten dute, eta errore-barrek batez bestekoa ± SEM adierazten dute. Erakusten diren datuek n = 3 adierazten dute, gutxienez 24 zelula erreplika bakoitzeko; guztira 266 irudi aztertu dira; *-k p < 0,05 adierazten du, **-k p < 0,01 adierazten du.
Mitokondrioen dinamikak PPAri nola erantzuten dion hobeto karakterizatzeko, mitokondrioak tetrametilrodamina etil esterrarekin (TMRE) tindatu genituen eta denbora-tarte mikroskopia eta MEL analisia erabili genituen mitokondrioak lokalizatzeko eta kuantifikatzeko, 3 eta 5 mM PPA-tan 24 ordu igaro ondoren. Fisio eta fusio gertaeren tratamendua. (2a irudia). MEL analisia egin ondoren, mitokondrioak gehiago aztertu ziren mitokondrio egituren kopurua eta haien batez besteko bolumena kuantifikatzeko. 3 mM-tan fisio gertaeren kopuruan igoera txiki baina esanguratsua ikusi genuen [4,9 ± 0,3 (p < 0,05)] fisioarekin alderatuta [5,6 ± 0,3 (p < 0,05)] eta fusioarekin [5,4 ± 0,5 (p < 0,05)] eta fusioarekin [5,4 ± 0,5 (p < 0,05)] <0,05)] gertaerak nabarmen handitu ziren 5 mM-tan kontrolarekin alderatuta (3b irudia). Mitokondrioen kopurua nabarmen handitu zen bai 3 [32,6 ± 2,1 (p < 0,05)] bai 5 mM-tan [34,1 ± 2,2 (p < 0,05)] (3c irudia), mitokondrio-egitura bakoitzaren batez besteko bolumena aldatu gabe mantendu zen bitartean (3c irudia). 3d). Guztira hartuta, honek iradokitzen du mitokondrioen dinamikaren birmoldaketak mitokondrio-sarearen osotasuna arrakastaz mantentzen duen erantzun konpentsatzaile gisa balio duela. 3 mM PPA-tan fisio-gertaeren kopuruaren igoerak iradokitzen du mitokondrioen kopuruaren igoera neurri batean mitokondrioen fisioari zor zaiola, baina batez besteko mitokondrioen bolumena funtsean aldatu gabe mantentzen denez, ezin da baztertu biogenesia erantzun konpentsatzaile gehigarri gisa. Hala ere, datu hauek TEM bidez behatutako mitokondrio-egitura txikiago eta biribilekin bat datoz eta PPA-k eragindako mitokondrioen dinamikan aldaketa esanguratsuak ere erakusten dituzte.
Azido propionikoak (PPA) mitokondrioen birmoldaketa dinamikoa eragiten du sarearen osotasuna mantentzeko. SH-SY5Y zelulak landu, 3 eta 5 mM PPArekin tratatu ziren 24 orduz eta TMRE eta Hoechst 33342rekin tindatu ziren, ondoren MEL analisi bat eginez. (a) Denbora-tarteko mikroskopia irudi adierazgarriak, koloreak eta intentsitate maximoaren proiekzio binarizatuak erakusten dituztenak 2. denboran (t2) baldintza bakoitzerako. Irudi bitar bakoitzean adierazitako eskualde hautatuak hobetu eta 3Dn bistaratzen dira hiru denbora-tarte desberdinetan (t1-t3) denboran zeharreko dinamika ilustratzeko; fusio gertaerak berdez nabarmenduta daude; fisio gertaerak berdez nabarmenduta daude. Gorriz bistaratzen da. (b) Baldintza bakoitzeko gertaera dinamikoen batez besteko kopurua. (c) Zelula bakoitzeko mitokondrio-egitura kopuruaren batez besteko kopurua. (d) Zelula bakoitzeko mitokondrio-egitura bakoitzaren batez besteko bolumena (µm3). Erakusten diren datuak tratamendu-talde bakoitzeko n = 15 zelularen ordezkari dira. Erakusten diren errore-barrek batez bestekoa ± SEM adierazten dute, eskala-barra = 10 μm, * p < 0,05.
Azido propionikoak (PPA) mitokondrioen dinamikarekin lotutako geneen transkripzio-zapalkuntza eragiten du. SH-SY5Y zelulak 3 eta 5 mM PPArekin tratatu ziren 24 orduz. Geneen kuantifikazio erlatiboa RT-qPCR erabiliz egin zen eta B2M-ra normalizatu zen. Mitokondrioen biogenesiaren geneak (a) cMYC, (b) TFAM, (c) NRF1 eta (d) NFE2L2. Mitokondrioen fusio eta fisio geneak (e) STOML2, (f) OPA1, (g) MFN1, (h) MFN2 eta (i) DRP1. Desberdintasun esanguratsuak (p < 0,05) ANOVA norabide bakarrekoa (kontrola vs. tratamendua) eta Dunnett-en konparazio anitzeko testa erabiliz probatu ziren: *-k p < 0,05 adierazten du, **-k p < 0,01 adierazten du eta ****-k p < 0,0001 adierazten du. Barrek batez besteko adierazpena ± SEM adierazten dute. Erakusten diren datuek n = 3 (STOML2, OPA1, TFAM), n = 4 (cMYC, NRF1, NFE2L2) eta n = 5 (MFN1, MFN2, DRP1) erreplika biologiko adierazten dituzte.
TEM eta MEL analisietatik lortutako datuek batera adierazten dute PPAk mitokondrioen morfologia eta dinamika aldatzen dituela. Hala ere, irudi-teknika hauek ez dute informaziorik ematen prozesu horiek bultzatzen dituzten azpiko mekanismoei buruz. Horregatik, mitokondrioen dinamikaren, biogenesiaren eta mitosiaren bederatzi erregulatzaile nagusiren mRNAren adierazpena aztertu genuen PPA tratamenduari erantzunez. Zelula mieloma onkogenea (cMYC), arnasketa faktore nuklearra (NRF1), mitokondrioen transkripzio faktorea 1 (TFAM), NFE2-antzeko transkripzio faktorea BZIP (NFE2L2), gastrina-antzeko proteina 2 (STOML2), nerbio optikoaren atrofia 1 (OPA1), Mitofusina 1 (MFN1), Mitofusina 2 (MFN2) eta dinaminarekin lotutako proteina 1 (DRP1) kuantifikatu genituen 3 mM eta 5 mM PPArekin 24 orduz tratatu ondoren. 3 mM-ko (p = 0,0053, p = 0,0415 eta p < 0,0001, hurrenez hurren) eta 5 mM-ko (p = 0,0031, p = 0,0233, p < 0,0001) PPA tratamendua ikusi genuen (3a-c irudia). ARNm-aren adierazpenaren jaitsiera dosiaren araberakoa izan zen: cMYC, NRF1 eta TFAM-en adierazpena 5,7, 2,6 eta 1,9 aldiz jaitsi zen 3 mM-tan, hurrenez hurren, eta 11,2, 3 eta 2,2 aldiz 5 mM-tan. Aldiz, NFE2L2 erredox biogenesi zentraleko genea ez zen aldatu PPAren kontzentrazio batean ere, nahiz eta adierazpenaren jaitsieraren antzeko dosiaren araberako joera bat ikusi zen (3d irudia).
Fisioaren eta fusioaren erregulazioan parte hartzen duten gene klasikoen adierazpena ere aztertu genuen. STOML2 fusioan, mitofagian eta biogenesian parte hartzen duela uste da, eta bere adierazpena nabarmen murriztu zen (p < 0,0001) 3 mM-tan (2,4 aldiz aldaketa) eta 5 mM-tan (2,8 aldiz aldaketa) PPA-n (1. irudia). 3d). Era berean, OPA1 fusio-genearen adierazpena gutxitu zen 3 mM-tan (1,6 aldiz aldaketa) eta 5 mM-tan (1,9 aldiz aldaketa) PPA-n (p = 0,006 eta p = 0,0024, hurrenez hurren) (3f irudia). Hala ere, ez genuen desberdintasun esanguratsurik aurkitu MFN1, MFN2 fusio-geneen edo DRP1 fisio-genearen adierazpenean 24 orduko PPA estrespean (3g-i irudia). Gainera, ikusi genuen lau fusio eta fisio proteinen (OPA1, MFN1, MFN2 eta DRP1) mailak ez zirela aldatu baldintza berdinetan (4a-d irudiak). Garrantzitsua da kontuan izatea datu hauek denbora-puntu bakarra islatzen dutela eta balitekeela ez islatzea proteinen adierazpenean edo jarduera-mailetan izandako aldaketak PPA estresaren hasierako faseetan. Hala ere, cMYC, NRF1, TFAM, STOML2 eta OPA1-en adierazpenean izandako murrizketa esanguratsuek mitokondrioen metabolismoaren, biogenesiaren eta dinamikaren transkripzio-deserregulazio nabarmena adierazten dute. Horrez gain, datu hauek irudi-tekniken erabilgarritasuna azpimarratzen dute mitokondrioen funtzioaren amaierako egoera-aldaketak zuzenean aztertzeko.
Fusio eta fisio faktore proteina mailak ez ziren aldatu azido propionikoaren (PPA) tratamenduaren ondoren. SH-SY5Y zelulak 3 eta 5 mM PPArekin tratatu ziren 24 orduz. Proteina mailak Western blot analisi bidez kuantifikatu ziren, eta espresio mailak proteina totalarekiko normalizatu ziren. Batez besteko proteinen espresioa eta proteina helburuaren eta totalaren Western bloten adierazgarriak ageri dira. a – OPA1, b – MFN1, c – MFN2, d – DRP1. Barrek batez bestekoa ± SEM adierazten dute, eta erakusten diren datuak n = 3 errepikapen biologikoren adierazgarriak dira. Konparazio anitzak (p < 0,05) bariantzaren analisi unidirekzionala eta Dunnett-en testa erabiliz egin ziren. Jatorrizko gela eta blot-a S1 irudian ageri dira.
Mitokondrioen disfuntzioa gaixotasun multisistemarekin lotuta dago, gaixotasun metaboliko, kardiobaskular eta muskularretatik hasi eta gaixotasun neurologikoetaraino1,10. Gaixotasun neurodegeneratibo eta neuroendekapenezko asko mitokondrioen disfuntzioarekin lotuta daude, eta horrek organulu hauen garrantzia azpimarratzen du garunaren bizitza osoan zehar. Gaixotasun horien artean daude Parkinson gaixotasuna, Alzheimer gaixotasuna eta ASD3,4,18. Hala ere, zaila da garuneko ehunera iristea gaixotasun hauek aztertzeko, batez ere maila mekanistikoan, eta horrek zelula ereduen sistemak beharrezko alternatiba bihurtzen ditu. Ikerketa honetan, PPAz tratatutako SH-SY5Y zelulak erabiltzen dituen zelula ereduen sistema bat erabiltzen dugu gaixotasun neuronaletan, batez ere autismoaren espektroaren nahasmenduetan, behatutako mitokondrioen disfuntzioa laburbiltzeko. PPA eredu hau neuronen mitokondrioen dinamika aztertzeko erabiltzeak ASDren etiologiari buruzko informazioa eman dezake.
TEM erabiltzeko aukera aztertu genuen mitokondrioen morfologian izandako aldaketak ikusteko. Garrantzitsua da kontuan izatea TEM behar bezala erabili behar dela bere eraginkortasuna maximizatzeko. Krio-laginen prestaketak neurona-egiturak hobeto kontserbatzea ahalbidetzen du, aldi berean zelula-osagaiak finkatuz eta artefaktuen eraketa murriztuz34. Honekin bat etorriz, ikusi genuen neurona-itxurako SH-SY5Y zelulek azpizelula-organulu osoak eta mitokondrio luzangak zituztela (1a irudia). Horrek nabarmentzen du prestaketa kriogenikoko tekniken erabilgarritasuna neurona-zelulen ereduetan mitokondrioen morfologia aztertzeko. Neurketa kuantitatiboak funtsezkoak diren arren TEM datuen analisi objektiboa egiteko, oraindik ez dago adostasunik mitokondrioen aldaketa morfologikoak berresteko zein parametro espezifiko neurtu behar diren. Mitokondrioen morfologia kuantitatiboki aztertu duten ikerketa ugarietan oinarrituta17,31,32, zortzi parametro morfologiko neurtzen dituen mitokondrioen irudien analisi-hodi automatizatu bat garatu genuen, hots: azalera, azalera2, alderdi-erlazioa, perimetroa, zirkulartasuna, maila, Feret diametroa eta biribiltasuna.
Horien artean, PPAk nabarmen murriztu zituen 2. azalera, azalera, perimetroa eta Feret diametroa (1b-e irudiak). Horrek erakutsi zuen mitokondrioak txikiagoak eta biribilduagoak bihurtu zirela, eta hori bat dator aurreko ikerketekin, zeinek PPA30-k eragindako mitokondrio-estresaren 72 orduren ondoren mitokondrio-eremuaren jaitsiera erakusten zuten. Ezaugarri morfologiko hauek mitokondrioen fisioa adieraz dezakete, mitokondrio-saretik kaltetutako osagaiak bahitzeko beharrezko prozesua, mitofagiaren bidez haien degradazioa sustatzeko35,36,37. Bestalde, mitokondrioen batez besteko tamainaren jaitsiera biogenesiaren igoerarekin lotuta egon daiteke, eta horrek mitokondrio txiki jaioberrien eraketa dakar. Fisio edo biogenesiaren igoera mitosia mitokondrioen estresaren aurkako mitosi mantentzeko erantzun konpentsatorio bat da. Hala ere, ezin dira baztertu mitokondrioen hazkundearen jaitsiera, fusio narriatua edo beste baldintza batzuk.
TEM bidez sortutako bereizmen handiko irudiek mitokondrio bakoitzaren mailan ezaugarri morfologikoak zehaztea ahalbidetzen duten arren, metodo honek bi dimentsioko argazkiak sortzen ditu denbora-puntu bakarrean. Estres metabolikoarekiko erantzun dinamikoak aztertzeko, mitokondrioak TMRErekin tindatu genituen eta denbora-tarteko mikroskopia erabili genuen MEL analisiarekin, eta horrek mitokondrio-sarearen aldaketen 3D bistaratzea ahalbidetzen du denboran zehar33,38. PPA estrespean mitokondrioen dinamikan aldaketa sotilak baina esanguratsuak ikusi genituen (2. irudia). 3 mM-tan, fisio-gertaeren kopurua nabarmen handitu zen, fusio-gertaerak kontrol-taldean berdin mantendu ziren bitartean. Fisio- eta fusio-gertaeren kopuruaren igoera ikusi zen 5 mM-ko PPA-tan, baina aldaketa hauek gutxi gorabehera proportzionalak izan ziren, eta horrek iradokitzen du fisio- eta fusio-zinetikak orekara iristen direla kontzentrazio handiagoetan (2b irudia). Batez besteko mitokondrio-bolumena aldatu gabe mantendu zen 3 eta 5 mM-ko PPA-tan, eta horrek adierazten du mitokondrio-sarearen osotasuna mantendu zela (2d irudia). Honek islatzen du sare mitokondrial dinamikoek estres metaboliko arinari erantzuteko duten gaitasuna, sarearen zatikatzea eragin gabe homeostasia eraginkortasunez mantentzeko. 3 mM PPA-tan, fisioaren igoera nahikoa da oreka berri baterako trantsizioa sustatzeko, baina birmoldaketa zinetiko sakonagoa behar da PPAren kontzentrazio handiagoek eragindako estresari erantzuteko.
Mitokondrioen kopurua handitu egin zen bi PPA estres kontzentrazioetan, baina batez besteko mitokondrioen bolumena ez zen nabarmen aldatu (2c irudia). Hori biogenesiaren edo zatiketaren igoeraren ondorioz izan daiteke; hala ere, batez besteko mitokondrioen bolumenaren jaitsiera nabarmenik ezean, litekeena da biosintesia handitzea. Hala ere, 2. irudiko datuek bi konpentsazio-mekanismo daudela baieztatzen dute: fisio-gertaeren kopuruaren igoera, mitokondrioen fisioaren goranzko erregulazioarekin bat datorrena, eta gertaeren kopuruaren igoera, mitokondrioen biogenesiarekin bat datorrena. Azken finean, estres arinarekiko konpentsazio dinamikoa fisioa, fusioa, biogenesia eta mitofagia inplikatzen dituzten prozesu aldiberekoez osatuta egon daiteke. Aurreko egileek erakutsi duten arren PPAk mitosia30,39 eta mitofagia29 hobetzen dituela, guk PPAri erantzunez mitokondrioen fisio eta fusio dinamikaren birmoldaketaren frogak eskaintzen ditugu. Datu hauek TEM bidez ikusitako aldaketa morfologikoak berresten dituzte eta PPAk eragindako mitokondrioen disfuntzioarekin lotutako mekanismoei buruzko informazio gehiago ematen dute.
Ez TEM ez MEL analisiak ez zutenez ebidentzia zuzenik eman behatutako aldaketa morfologikoen oinarrian dauden geneen erregulazio-mekanismoen inguruan, mitokondrioen metabolismoan, biogenesian eta dinamikan parte hartzen duten geneen RNA adierazpena aztertu genuen. cMYC proto-onkogenea mitokondrioen, glukolisian, aminoazidoen eta gantz-azidoen metabolismoaren erregulazioan parte hartzen duen transkripzio-faktore bat da40. Horrez gain, cMYCk mitokondrioen transkripzioan, itzulpenean eta konplexuen muntaketan parte hartzen duten ia 600 mitokondrio-geneen adierazpena erregulatzen duela ezagutzen da, NRF1 eta TFAM41 barne. NRF1 eta TFAM mitosiaren bi erregulatzaile zentral dira, PGC-1α-ren ondoren jarduten dutenak mtDNAren erreplikazioa aktibatzeko. Bide hau cAMP eta AMPK seinaleztapenaren bidez aktibatzen da eta energia-gastuarekiko eta estres metabolikoarekiko sentikorra da. NFE2L2 ere aztertu genuen, mitokondrioen biogenesiaren erredox erregulatzaile bat, PPAren efektuak estres oxidatiboak bitartekatu ditzakeen zehazteko.
NFE2L2 espresioa aldatu gabe mantendu bazen ere, cMYC, NRF1 eta TFAM espresioan dosi-menpeko jaitsiera koherentea aurkitu genuen 3 mM eta 5 mM PPArekin 24 orduko tratamenduaren ondoren (3a-c irudiak). Aurretik jakinarazi da cMYC espresioaren beherakada mitokondrialaren estresaren erantzun gisa42, eta alderantziz, cMYC espresioaren beherakadak mitokondrioen disfuntzioa eragin dezake mitokondrioen metabolismoa, sareko konektibitatea eta mintzaren polarizazioa birmoldatuz43. Interesgarria da, cMYC mitokondrioen fisio eta fusioaren erregulazioan ere parte hartzen duela42,43 eta ezagutzen da DRP1 fosforilazioa eta mitokondrioen lokalizazioa handitzen dituela zelula-zatiketa zehar44, baita neurona-zelulen ama-zeluletan mitokondrioen birmoldaketa morfologikoa bitartekatzen duela ere45. Izan ere, cMYC gabezia duten fibroblastoek mitokondrioen tamaina murriztua erakusten dute, PPA43 estresak eragindako aldaketekin bat etorriz. Datu hauek cMYC eta mitokondrioen dinamikaren arteko erlazio interesgarri bat erakusten dute, baina oraindik argi ez dagoena, eta PPA estresak eragindako birmoldaketaren etorkizuneko ikerketetarako helburu interesgarria eskaintzen dute.
NRF1 eta TFAM-en murrizketa bat dator cMYC-k transkripzio-aktibatzaile garrantzitsu gisa duen eginkizunarekin. Datu hauek bat datoz gizakien koloneko minbizi-zeluletan egindako aurreko ikerketekin ere, zeinek erakusten baitute PPAk NRF1 mRNA-ren adierazpena murriztu zuela 22 ordutan, eta hori ATP agortzearekin eta ROS46 handitzearekin lotuta zegoen. Egile hauek ere jakinarazi zuten TFAM-en adierazpena 8,5 ordutan handitu zela, baina oinarrizko mailetara itzuli zela 22 ordutan. Aitzitik, Kim et al.-ek (2019) erakutsi zuten TFAM mRNA-ren adierazpena nabarmen murriztu zela SH-SY5Y zeluletan PPA estresaren 4 orduren ondoren; hala ere, 72 ordu igaro ondoren, TFAM proteinen adierazpena nabarmen handitu zen eta mtDNA kopia kopurua nabarmen handitu zen. Beraz, 24 ordu igaro ondoren ikusi dugun mitokondrioen biogenesi-geneen kopuruaren jaitsierak ez du baztertzen mitokondrioen kopuruaren igoera biogenesiaren aktibazioaren aurreko uneetan lotuta egotearen aukera. Aurreko ikerketek erakutsi dute PPAk PGC-1α mRNA eta proteina nabarmen erregulatzen dituela SH-SY5Y zeluletan 4 ordu eta 30 minututan, azido propionikoak, berriz, txahal hepatozitoetan mitokondrioen biogenesia hobetzen duen bitartean PGC-1α bidez 12 ordu eta 39 minututan. Interesgarria da, PGC-1α ez dela NRF1 eta TFAM-en transkripzio-erregulatzaile zuzena bakarrik, baizik eta MFN2 eta DRP1-en jarduera erregulatzen duela ere frogatu da fisioa eta fusioa erregulatuz47. Oro har, honek PPAk eragindako mitokondrioen konpentsazio-erantzunak erregulatzen dituzten mekanismoen arteko lotura estua nabarmentzen du. Gainera, gure datuek PPA estrespean biogenesiaren eta metabolismoaren transkripzio-erregulazioaren desregulazio nabarmena islatzen dute.
STOML2, OPA1, MFN1, MFN2 eta DRP1 geneak mitokondrioen fisio, fusio eta dinamikaren erregulatzaile zentralenetakoak dira37,48,49. Mitokondrioen dinamikan parte hartzen duten beste gene asko daude, baina STOML2, OPA1 eta MFN2 lehenago ASD kohorteetan metilazio desberdina dutela ikusi da,16 eta hainbat ikerketa independentek transkripzio-faktore hauetan izandako aldaketak jakinarazi dituzte mitokondrioen estresari erantzunez50,51. 52. OPA1 eta STOML2ren adierazpena nabarmen murriztu zen 3 mM eta 5 mM PPA tratamenduarekin (3e, f irudiak). OPA1 mitokondrioen fusioaren erregulatzaile klasikoetako bat da MFN1 eta 2rekin zuzeneko elkarreraginaren bidez eta kristalen birmoldaketan eta mitokondrioen morfologian zeregina du53. STOML2ren zeregin zehatza mitokondrioen dinamikan ez dago argi oraindik, baina ebidentziak iradokitzen du mitokondrioen fusioan, biogenesian eta mitofagian zeregina duela.
STOML2 mitokondrioen arnasketa akoplamendua mantentzean eta arnas kate konplexuen eraketan parte hartzen du54,55 eta minbizi-zelulen ezaugarri metabolikoak sakonki aldatzen dituela frogatu da56. Ikerketek erakutsi dute STOML2-k mitokondrioen mintz potentziala eta biogenesia sustatzen dituela BAN eta kardiolipinarekin elkarreraginez 55, 57, 58. Horrez gain, ikerketa independenteek erakutsi dute STOML2 eta PINK1 arteko elkarrekintzak mitofagia erregulatzen duela59,60. Aipagarria da STOML2-k MFN2-rekin zuzenean elkarreragiten duela eta egonkortzen duela eta OPA1 isoforma luzeak egonkortzeko ere paper garrantzitsua betetzen duela, OPA1 degradazioaren arduradun den proteasa inhibitzen duelako53,61,62. PPA erreakzioetan ikusten den STOML2 espresioaren murrizketak fusio-proteina hauek ubikitina eta proteasoma menpeko bideen bidez degradazioarekiko sentikorragoak bihur ditzake48. STOML2 eta OPA1-en zeregin zehatza PPA-rekiko erantzun dinamikoan argi ez dagoen arren, fusio-gene hauen adierazpena gutxitzeak (3. irudia) fisioaren eta fusioaren arteko oreka eten dezake eta mitokondrioen tamaina txikitzea eragin dezake (3. irudia). 1).
Bestalde, OPA1 proteinen adierazpena aldatu gabe mantendu zen 24 ordu igaro ondoren, MFN1, MFN2 edo DRP1-en mRNA eta proteina mailak ez ziren nabarmen aldatu PPA tratamenduaren ondoren (3g-i irudia, 4. irudia). Horrek adieraz dezake ez dagoela aldaketarik mitokondrioen fusioan eta fisioan parte hartzen duten faktore hauen erregulazioan. Hala ere, kontuan izan behar da lau gene horietako bakoitza proteinen jarduera kontrolatzen duten transkripzio osteko aldaketa (PTM) bidez ere erregulatzen dela. OPA1-ek zortzi splicing aldaera alternatibo ditu, mitokondrioetan proteolitikoki ebakitzen direnak bi isoforma desberdin sortzeko 63. Isoforma luzeen eta laburren arteko orekak zehazten du, azken finean, OPA1-en eginkizuna mitokondrioen fusioan eta mitokondrioen sarearen mantentzean64. DRP1 jarduera kaltzio/kalmodulina-menpeko proteina kinasa II (CaMKII) fosforilazioak erregulatzen du, eta DRP1 degradazioa ubikitinazioak eta SUMOilazioak erregulatzen dute65. Azkenik, bai DRP1 bai MFN1/2 GTPasak dira, beraz, jarduera mitokondrioetan GTP ekoizpen-tasak eragin dezake 66. Beraz, proteina hauen adierazpena konstante mantentzen den arren, baliteke horrek ez islatzea proteinen jarduera edo lokalizazio aldatu gabea 67,68. Izan ere, dauden PTM proteinen errepertorioak askotan estres-erantzun akutuak bitartekatzeaz arduratzen diren lehen defentsa-lerro gisa balio dute. Gure ereduan estres metaboliko moderatua dagoenean, litekeena da PTMk fusio- eta fisio-proteinen jarduera handitzea sustatzea mitokondrioen osotasuna behar bezala berreskuratzeko, gene horien mRNA edo proteina mailan aktibazio gehigarririk behar izan gabe.
Goiko datuek, oro har, mitokondrioen morfologiaren erregulazio konplexua eta denboraren araberakoa nabarmentzen dute, baita mekanismo horiek argitzearen erronkak ere. Geneen adierazpena aztertzeko, lehenik eta behin, bide bereko gene espezifikoak identifikatu behar dira. Hala ere, gure datuek erakusten dute bide bereko geneek ez dutela modu berean erantzuten estres berari. Izan ere, aurreko ikerketek erakutsi dute bide bereko gene desberdinek denborazko erantzun-profil desberdinak erakuts ditzaketela30,46. Horrez gain, transkripzioaren eta geneen funtzioaren arteko erlazioa eten egiten duten transkripzio osteko mekanismo konplexuak daude. Proteomika-ikerketek PTMen eta proteinen funtzioaren eraginari buruzko informazioa eman dezakete, baina erronkak ere badituzte, besteak beste, errendimendu baxuko metodoak, seinale-zarata erlazio altuak eta bereizmen eskasa.
Testuinguru honetan, TEM eta MEL erabiliz mitokondrioen morfologia aztertzeak potentzial handia du mitokondrioen dinamikaren eta funtzioaren arteko harremanari eta horrek gaixotasunean duen eraginari buruzko oinarrizko galderak konpontzeko. Garrantzitsuena, TEMek mitokondrioen morfologia neurtzeko metodo zuzena eskaintzen du, mitokondrioen disfuntzioaren eta dinamikaren amaiera konbergente gisa51. MELek fisio eta fusio gertaerak hiru dimentsioko zelula-ingurune batean bistaratzeko metodo zuzena ere eskaintzen du, mitokondrioen birmoldaketa dinamikoa kuantifikatzea ahalbidetuz, geneen adierazpenean aldaketak ez egon arren33. Hemen mitokondrioen irudi-tekniken erabilgarritasuna azpimarratzen dugu bigarren mailako mitokondrioen gaixotasunetan. Gaixotasun hauek normalean estres metaboliko arin kroniko batek ezaugarritzen ditu, mitokondrioen kalte akutua baino mitokondrio-sareen birmoldaketa sotilak. Hala ere, estres kronikoaren pean mitosia mantentzeko beharrezkoa den mitokondrioen konpentsazioa ondorio funtzional sakonak ditu. Neurozientziaren testuinguruan, konpentsazio-mekanismo horien ulermen hobeago batek informazio garrantzitsua eman dezake mitokondrioen disfuntzioarekin lotutako neuropatologia pleiotropikoari buruz.
Azken finean, gure datuek irudi-tekniken erabilgarritasuna azpimarratzen dute geneen adierazpenaren, proteinen aldaketen eta proteinen jardueraren arteko elkarrekintza konplexuen ondorio funtzionalak ulertzeko, zeinak neurona-mitokondrioen dinamika kontrolatzen duten. PPA erabili genuen mitokondrioen disfuntzioa modelatzeko neurona-zelula eredu batean, ASDren mitokondrioen osagaiari buruzko informazioa lortzeko. PPArekin tratatutako SH-SY5Y zelulek mitokondrioen morfologian aldaketak erakutsi zituzten: mitokondrioak txiki eta biribil bihurtu ziren, eta kristalak gaizki definitu ziren TEM bidez behatu zirenean. MEL analisiak erakusten du aldaketa hauek fisio eta fusio gertaeren igoerarekin batera gertatzen direla, mitokondrioen sarea mantentzeko estres metaboliko arinaren aurrean. Gainera, PPAk nabarmen eten egiten du mitokondrioen metabolismoaren eta homeostasiaren transkripzio-erregulazioa. cMYC, NRF1, TFAM, STOML2 eta OPA1 identifikatu genituen PPAren estresak eten dituen mitokondrioen erregulatzaile nagusi gisa, eta zeregina izan dezakete mitokondrioen morfologian eta funtzioan PPAk eragindako aldaketak bitartekatzen. Etorkizuneko ikerketak behar dira PPAk eragindako geneen adierazpenean eta proteinen jardueran, lokalizazioan eta translazio osteko aldaketetan denbora-aldaketak hobeto karakterizatzeko. Gure datuek mitokondrioen estres-erantzuna bitartekatzen duten mekanismo erregulatzaileen konplexutasuna eta elkarren menpekotasuna azpimarratzen dituzte, eta TEM eta beste irudi-teknika batzuen erabilgarritasuna erakusten dute mekanistiko-azterketa zehatzagoetarako.
SH-SY5Y zelula-lerroa (ECACC, 94030304-1VL) Sigma-Aldrich-etik erosi zen. SH-SY5Y zelulak Dulbecco-ren Eagle-ren ingurune aldatua/F-12 mantenugai nahasketan (DMEM/F-12) eta L-glutaminan (SC09411, ScienCell) hazi ziren 25 cm2-ko matrazeetan, % 20ko behi-fetuaren serumarekin (FBS) (10493106, ThermoFisher Scientific) eta % 1eko penizilina-estreptomizinarekin (P4333-20ML, Sigma-Aldrich) osatuta, 37 °C-tan eta % 5eko CO2-tan. Zelulak % 80ko konfluentziara azpikultibatu ziren % 0,05eko tripsina-EDTA (15400054, ThermoFisher Scientific) erabiliz, 300 g-tan zentrifugatu eta gutxi gorabehera 7 × 105 zelula/ml-ko dentsitatearekin landatzeko. Esperimentu guztiak SH-SY5Y zelula bereizgabeetan egin ziren 19-22 pasarteen artean. PPA NaP gisa administratzen da. Disolbatu NaP hautsa (CAS zk. 137-40-6, C3H5NaO2 formula kimikoa, P5436-100G, Sigma-Aldrich) MilliQ ur epeletan 1 M-ko kontzentraziora iritsi arte eta gorde 4 °C-tan. Tratamendu egunean, diluitu disoluzio hau 1 M PPArekin 3 mM-ra iritsi arte eta 5 mM PPA serumik gabeko ingurunean (DMEM/F-12 L-glutaminarekin). Esperimentu guztietako tratamendu-kontzentrazioak hauek izan ziren: PPArik gabe (0 mM, kontrola), 3 mM eta 5 mM PPA. Esperimentuak gutxienez hiru errepikapen biologikotan egin ziren.
SH-SY5Y zelulak 25 cm5-ko matrazeetan erein ziren 5,5 × 105 zelula/ml-ko abiaduran eta 24 orduz hazi ziren. PPA tratamendua matrazean gehitu zen inkubazio-prozesua 24 ordu igaro baino lehen. Bildu zelula-pellet-ak ugaztunen ehunen azpikultura-protokolo arruntak jarraituz (goian deskribatuak). Berriz eseki zelula-pelleta 100 µl % 2,5eko glutaraldehidoan, 1× PBS-tan eta gorde 4 °C-tan prozesatu arte. SH-SY5Y zelulak laburki zentrifugatu ziren zelulak pelletatzeko eta % 2,5eko glutaraldehidoa, 1× PBS disoluzioa kentzeko. Berriz eseki sedimentua ur destilatuan prestatutako % 4ko agarosa-gel batean (agarosaren eta sedimentuaren bolumenaren arteko erlazioa 1:1 da). Agarosa zatiak plaka lauen gaineko sareta-sareetan jarri eta 1-hexadezenoz estali ziren presio altuan izoztu aurretik. Laginak % 100eko azetona lehorrean izoztu ziren -90 °C-tan 24 orduz. Ondoren, tenperatura -80 °C-ra igo zen eta % 1eko osmio tetroxidoaren eta % 0,1eko glutaraldehidoaren disoluzio bat gehitu zen. Laginak -80 °C-tan gorde ziren 24 orduz. Ondoren, tenperatura pixkanaka igo zen giro-tenperaturara hainbat egunez: – 80 °C-tik – 50 °C-ra 24 orduz, – 30 °C-ra 24 orduz, – 10 °C-ra 24 orduz eta azkenik giro-tenperaturara.
Prestaketa kriogenikoaren ondoren, laginak erretxinaz inpregnatu ziren eta sekzio ultrameheak (∼100 nm) egin ziren Leica Reichert UltracutS ultramikrotomo bat (Leica Microsystems) erabiliz. Sekzioak % 2ko uranil azetatoarekin eta berun zitratoarekin tindatu ziren. Laginak 200 kV-tan funtzionatzen duen FEI Tecnai 20 transmisio-mikroskopio elektroniko bat (ThermoFisher (lehen FEI), Eindhoven, Herbehereak) eta Tridiem energia-iragazki batekin hornitutako Gatan CCD kamera bat (Gatan, Erresuma Batua) erabiliz behatu ziren.
Erreplika tekniko bakoitzean, gutxienez 24 zelula bakarreko irudi eskuratu ziren, guztira 266 irudi. Irudi guztiak Interes Eskualdearen (ROI) makroa eta Mitokondrio makroa erabiliz aztertu ziren. Mitokondrio makroa argitaratutako metodoetan oinarritzen da17,31,32 eta Fiji/ImageJ69-n TEM irudien prozesamendu erdi-automatikoa ahalbidetzen du. Laburbilduz: irudia alderantzikatu eta alderantzikatu egiten da bola birakariaren atzeko planoaren kenketa (60 pixeleko erradioa) eta FFT banda-iragazki bat (60 eta 8 pixeleko goiko eta beheko mugak erabiliz, hurrenez hurren) eta lerro bertikalaren ezabapena % 5eko orientazio-tolerantziarekin. Prozesatutako irudia automatikoki atalaseatzen da entropia maximoaren algoritmo bat erabiliz eta maskara bitar bat sortzen da. TEM irudi gordinetan eskuz hautatutako ROIekin lotutako irudi-eskualdeak erauzi ziren, mitokondrioak karakterizatuz eta plasma-mintza eta beste kontraste handiko eskualde batzuk baztertuz. Ateratako ROI bakoitzerako, 600 pixel baino handiagoak diren partikula bitarrak aztertu ziren, eta partikulen azalera, perimetroa, ardatz nagusi eta txikiak, Feret diametroa, biribiltasuna eta zirkulartasuna neurtu ziren Fiji/ImageJ-ren neurketa-funtzio integratuak erabiliz. Merrill, Flippo eta Strack (2017) jarraituz, 2. azalera, partikulen alderdi-erlazioa (ardatz nagusiaren eta txikiaren arteko erlazioa) eta forma-faktorea (FF) kalkulatu ziren datu horietatik, non FF = 2/4pi perimetroa x azalera den. Formula parametrikoaren definizioa Merrill, Flippo eta Strack (2017) lanean aurki daiteke. Aipatutako makroak GitHub-en daude eskuragarri (ikus Datuen Eskuragarritasun Adierazpena). Batez beste, 5.600 partikula inguru aztertu ziren PPA tratamendu bakoitzeko, guztira 17.000 partikula inguru (datuak ez dira erakusten).
SH-SH5Y zelulak 8 ganberako kultura-plaketan (ThermoFisher, #155411) jarri ziren gau osoan itsaspena bermatzeko, eta ondoren TMRE 1:1000 (ThermoFisher, #T669) eta Hoechst 33342 1:200 (Sigma-Aldrich, H6024) inkubatu ziren. tindaketa. Irudiak 405 nm eta 561 nm-ko laserrak erabiliz eskuratu ziren 10 minutuko ingurunean, eta irudi gordinak z-pila gisa eskuratu ziren, 10 irudi-mikrografia zituztenak, 0,2 μm-ko az urratsarekin irudi-fotogramen artean, 12 denbora-puntu jarraian. Irudiak Carl Zeiss LSM780 ELYRA PS.1 super-bereizmen plataforma bat erabiliz bildu ziren (Carl Zeiss, Oberkochen, Alemania), LCI Plan Apochromate 100x/1.4 Oil DIC M27 lente bat erabiliz. Irudiak ImageJ-n aztertu ziren, aurretik deskribatutako pipeline bat eta ImageJ plugina erabiliz, fusio eta fisio gertaerak, mitokondrio-egituren batez besteko kopurua eta zelula bakoitzeko mitokondrioen batez besteko bolumena neurtzeko33. MEL makroak GitHub-en daude eskuragarri (ikus Datuen Eskuragarritasun Adierazpena).
SH-SY5Y zelulak sei putzuko plaketan hazi ziren 0,3 × 106 zelula/mL-ko dentsitatean tratamendua baino 24 ordu lehenago. RNA Quick-RNA™ Miniprep protokoloa erabiliz erauzi zen (ZR R1055, Zymo Research) aldaketa txiki batzuekin: gehitu 300 μl RNA lisis bufferrean putzu bakoitzera kendu aurretik eta lisatu lagin bakoitza azken urrats gisa 30 μl DNase/RNase eluzioarekin. -gabeko urarekin. Lagin guztien kantitatea eta kalitatea egiaztatu ziren NanoDrop ND-1000 UV-Vis espektrofotometro bat erabiliz. Zelula lisatuetatik lortutako proteina osoa 200 μl RIPA lisis bufferrean lortu zen, eta proteina kontzentrazioa Bradford proteina analisia erabiliz kuantifikatu zen70.
ADNc-aren sintesia Tetro™ ADNc Sintesi Kit-a (BIO-65043, Meridian Bioscience) erabiliz egin zen, fabrikatzailearen argibideen arabera, aldaketa batzuekin. ADNc 20 μl-ko erreakzioetan sintetizatu zen, 0,7 eta 1 μg RNA total erabiliz. Primerrak aurretik argitaratutako artikuluetatik hautatu ziren 42, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78 (S1 taula) eta zundak Integrated DNA Technologies-en PrimerQuest tresna erabiliz diseinatu ziren. Intereseko gene guztiak B2M gene nuklearrarekin normalizatu ziren. STOML2, NRF1, NFE2L2, TFAM, cMYC eta OPA1 geneen adierazpena RT-qPCR bidez neurtu zen. Nahasketa nagusiak LUNA Taq polimerasa (M3003L, New England Biolabs), 10 μM-ko aurreranzko eta alderantzizko primerrak, ADNc eta PCR mailako ura zituen, erreakzio bakoitzerako 10 μL-ko azken bolumena lortzeko. Zatiketa eta fisio geneen adierazpena (DRP1, MFN1/2) TaqMan multiplex analisiak erabiliz neurtu zen. Luna Universal Probe qPCR Master Mix (M3004S, New England Biolabs) fabrikatzailearen argibideen arabera erabili zen, aldaketa txiki batzuekin. RT-qPCR nahasketa nagusiak 1X LUNA Taq polimerasa, 10 μM-ko aurreranzko eta alderantzizko primerrak, 10 μM-ko zunda, ADNc eta PCR mailako ura ditu, eta ondorioz, erreakzio bakoitzerako 20 μL-ko azken bolumena lortu zen. RT-qPCR Rotor-Gene Q 6-plex (QIAGEN RG—serie zenbakia: R0618110) erabiliz egin zen. Ziklo-baldintzak S1 taulan ageri dira. ADNc lagin guztiak hirukoiztuta anplifikatu ziren eta kurba estandar bat sortu zen hamar aldizko diluzio-serie bat erabiliz. Hirukoiztutako laginetan ziklo-atalaseko desbideratze estandarra (Ct) >0,5 zuten outlierrak kendu ziren analisietatik datuen erreproduzigarritasuna bermatzeko30,72. Geneen adierazpen erlatiboa 2-ΔΔCt79 metodoa erabiliz kalkulatu zen.
Proteina laginak (60 μg) Laemmli kargatzeko bufferrean nahastu ziren 2:1 proportzioan eta % 12ko proteina gel kolorge batean (Bio-Rad #1610184) exekutatu ziren. Proteinak PVDF (polibinilideno fluoruroa) mintz batera (#170-84156, Bio-Rad) transferitu ziren Trans-Blot Turbo sistema (#170-4155, Bio-Rad) erabiliz. Mintza blokeatu eta lehen mailako antigorputz egokiekin (OPA1, MFN1, MFN2 eta DRP1) (1:1000 diluituta) inkubatu zen 48 orduz, eta ondoren bigarren mailako antigorputzekin (1:10.000) inkubatu zen ordubetez. Ondoren, mintzen irudiak Clarity Western ECL substratua (#170-5061, Bio-Rad) erabiliz hartu ziren eta Bio-Rad ChemiDoc MP sistema bat erabiliz grabatu ziren. ImageLab 6.1 bertsioa erabili zen Western blot analisietarako. Jatorrizko gela eta blot-a S1 irudian ageri dira. Antigorputzen informazioa S2 taulan ematen da.
Datu-multzoak gutxienez hiru lagin independenteren batez besteko eta batez bestekoaren errore estandar (SEM) gisa aurkezten dira. Datu-multzoak normaltasunerako Shapiro-Wilks testa erabiliz probatu ziren (bestelakorik adierazi ezean), banaketa gaussiarra eta desbideratze estandar berdinak suposatu eta analisiekin jarraitu aurretik. Datu-multzoak Fisher-en MEL LSD (p < 0,05), ANOVA norabide bakarrekoa (tratamendua vs. kontrol batez bestekoa) eta Dunnett-en konparazio anitzeko testa erabiliz aztertu ziren, esangura zehazteko (p < 0,05). P balio esanguratsuak grafikoan honela erakusten dira: *p < 0,05, **p < 0,01, ***p < 0,001, ****p < 0,0001. Analisi estatistiko eta grafiko guztiak GraphPad Prism 9.4.0 erabiliz egin eta sortu ziren.
TEM irudien analisietarako Fiji/ImageJ makroak publikoki eskuragarri daude GitHub-en: https://github.com/caaja/TEMMitoMacro. Mitochondrial Event Locator (MEL) makroa publikoki eskuragarri dago GitHub-en: https://github.com/rensutheart/MEL-Fiji-Plugin.
Meiliana A., Devi NM eta Vijaya A. Mitokondrioak: metabolismoaren, homeostasiaren, estresaren, zahartzearen eta epigenetikaren erregulatzaile nagusiak. Indonesian. Zientzia Biomedikoa. J. 13, 221–241 (2021).
Ben-Shachar, D. Mitokondrioen disfuntzio anitzekoa eskizofrenian, I. konplexua helburu patologiko posible gisa. Eskizofrenia. baliabidea. 187, 3–10 (2017).
Bose, A. eta Beal, MF Mitokondrioen disfuntzioa Parkinson gaixotasunean. J. Neurochemistry. 139, 216–231 (2016).
Sharma VK, Singh TG eta Mehta V. Estresatuta dauden mitokondrioak: Alzheimer gaixotasunean inbasioaren jomugak. Mitochondria 59, 48–57 (2021).
Belenguer P., Duarte JMN, Shook PF eta Ferreira GK Mitokondrioak eta garuna: bioenergetika eta gehiago. Neurotoxinak. baliabidea. 36, 219–238 (2019).
Rangaraju, V. et al. Mitokondrio pleiotropikoak: mitokondrioen eragina neuronen garapenean eta gaixotasunean. J. Neuroscience. 39, 8200–8208 (2019).
Cardaño-Ramos, C. eta Morais, VA Neuronen mitokondrioen biogenesia: nola eta non. Nazioartekotasuna. J. Mohr. Zientzia. 22, 13059 (2021).
Yu, R., Lendahl, U., Nister, M. eta Zhao, J. Ugaztunen mitokondrioen dinamikaren erregulazioa: aukerak eta erronkak. front. endokrinoa. (Lausanne) 11, 374 (2020).
Khacho, M. eta Slack, RS Mitokondrioen dinamika neurogenesiaren erregulazioan: garapen-garaiko garunetik helduarora. garapena. dinamika. 247, 47–53 (2018).