Eskerrik asko Nature.com webgunea bisitatzeagatik. Erabiltzen ari zaren arakatzailearen bertsioak CSSrako laguntza mugatua du. Esperientzia onena lortzeko, arakatzaile eguneratua erabiltzea gomendatzen dizugu (edo Internet Explorer-en bateragarritasun modua desaktibatzea). Bitartean, laguntza jarraitua bermatzeko, gunea estilorik eta JavaScriptik gabe erakutsiko dugu.
Karga-eduki handiko intsulina nanopartikulek (NP) aplikazio desberdinak aurkitu dituzte dosi-forma desberdinetan. Lan honen helburua izozte-lehortze eta ihinztadura-lehortze prozesuek intsulinaz kargatutako kitosano nanopartikulen egituran duten eragina ebaluatzea da, manitol kriobabesle gisa erabiliz edo gabe. Nanopartikula hauen kalitatea ere ebaluatu dugu berriro disolbatuz. Deshidratatu aurretik, kitosano/sodio tripolifosfato/intsulina gurutzatutako nanopartikulen partikula-tamaina 318 nm-koa izateko optimizatu zen, PDI 0,18koa zen, kapsulatze-eraginkortasuna % 99,4koa zen eta karga % 25,01ekoa. Berreraiki ondoren, nanopartikula guztiek, manitolik erabili gabe izozte-lehortze metodo baten bidez ekoitzitakoek izan ezik, partikula-egitura esferikoa mantendu zuten. Ihinztadura bidez deshidratatutako manitoldun nanopartikulekin alderatuta, manitol gabeko ihinztadura-lehortze bidezko nanopartikulek ere erakutsi zuten batez besteko partikula-tamaina txikiena (376 nm) eta karga-eduki handiena. (% 25,02) kapsulazio-tasa (% 98,7) eta PDI (0,20) antzekoekin lehortze edo izozte-lehortze tekniken bidez. Manitol gabe ihinztadura bidez lehortutako nanopartikulak intsulinaren askapen azkarrena eta zelulen xurgapenaren eraginkortasun handiena ere lortu zuten. Lan honek erakusten du ihinztadura bidezko lehortzeak intsulina nanopartikulak deshidratatu ditzakeela kriobabesleen beharrik gabe, izozte-lehortze metodo konbentzionalekin alderatuta, karga-ahalmen handiagoa, gehigarri-behar txikiagoak eta funtzionamendu-kostuen abantaila nabarmena sortuz.
1922an aurkitu zutenetik1,2,3, intsulinak eta bere prestakin farmazeutikoek 1 motako diabetesa (T1DM) eta 2 motako diabetesa (T1DM) duten pazienteen bizitzak salbatu dituzte. Hala ere, pisu molekular handiko proteina gisa dituen propietateei esker, intsulina erraz agregatzen da, entzima proteolitikoek deskonposatzen dute eta lehen igarotze efektuaren bidez ezabatzen da. 1 motako diabetesa diagnostikatuta duten pertsonek intsulina injekzioak behar dituzte bizitza osorako. Hasieran 2 motako diabetesa diagnostikatuta duten paziente askok epe luzeko intsulina injekzioak ere behar dituzte. Eguneroko intsulina injekzioak eguneroko min eta ondoeza iturri larria dira pertsona horientzat, eta ondorio negatiboak dituzte osasun mentalean. Ondorioz, ondoeza gutxiago eragiten duten beste intsulina administrazio mota batzuk, hala nola ahozko intsulina administrazioa, sakonki aztertzen ari dira5, mundu osoan diabetesa duten 5.000 milioi pertsona ingururen bizi-kalitatea leheneratzeko ahalmena baitute.
Nanopartikula teknologiak aurrerapen nabarmena eman du ahozko intsulina hartzeko saiakeretan4,6,7. Intsulina modu eraginkorrean kapsulatzen eta degradaziotik babesten duena, gorputzeko gune espezifikoetara bideratuta emateko. Hala ere, nanopartikula formulazioen erabilerak hainbat muga ditu, batez ere partikulen esekiduren egonkortasun arazoengatik. Biltegiratzean agregazio batzuk gerta daitezke, eta horrek intsulinaz kargatutako nanopartikulen bioerabilgarritasuna murrizten du8. Horrez gain, nanopartikulen eta intsulinaren polimero matrizearen egonkortasun kimikoa ere kontuan hartu behar da intsulina nanopartikulen (NP) egonkortasuna bermatzeko. Gaur egun, izozte-lehortze teknologia da NP egonkorrak sortzeko urrezko estandarra, biltegiratzean nahi ez diren aldaketak saihestuz9.
Hala ere, izozte-lehortzeak kriobabesleak gehitzea eskatzen du NP-en egitura esferikoa izotz kristalen tentsio mekanikoak eragin ez dezan. Horrek nabarmen murrizten du intsulina nanopartikulen karga liofilizazioaren ondoren, kriobabesleak pisu-erlazioaren zatirik handiena hartzen baitu. Beraz, ekoitzitako intsulina NP-ak askotan ez dira egokiak hauts lehorreko formulazioak fabrikatzeko, hala nola ahozko tabletak eta ahozko filmak, intsulinaren leiho terapeutikoa lortzeko nanopartikula lehor kopuru handiak behar direlako.
Ihinztadura-lehorketa prozesu industrial ezagun eta merkea da hauts lehorrak fase likidoetatik ekoizteko industria farmazeutikoan10,11. Partikula-eraketa prozesuaren kontrolak hainbat konposatu bioaktibo behar bezala kapsulatzea ahalbidetzen du 12, 13. Gainera, teknika eraginkorra bihurtu da ahozko administraziorako proteina kapsulatuak prestatzeko. Ihinztadura-lehorketan, ura oso azkar lurruntzen da, eta horrek partikularen nukleoaren tenperatura baxua mantentzen laguntzen du11,14, eta horrek beroarekiko sentikorrak diren osagaiak kapsulatzeko aplikazioa ahalbidetzen du. Ihinztadura-lehorketa baino lehen, estaldura-materiala ondo homogeneizatu behar da kapsulatutako osagaiak dituen disoluzioarekin11,14. Izozte-lehorketa ez bezala, ihinztadura-lehorketan kapsulatu aurretik homogeneizatzeak kapsulazioaren eraginkortasuna hobetzen du deshidratazioan zehar. Ihinztadura-lehorketa kapsulatzeko prozesuak ez duenez kriobabeslerik behar, ihinztadura-lehorketa erabil daiteke karga-eduki handiko NP lehorrak ekoizteko.
Ikerketa honek intsulinaz kargatutako NPen ekoizpenaren berri ematen du, kitosanoaren eta sodio tripolifosfatoaren arteko lotura gurutzatuaren bidez, ioi-gel metodo bat erabiliz. Ioi-gelatzioa nanopartikulak ekoiztea ahalbidetzen duen prestaketa-metodo bat da, bi espezie ioniko edo gehiagoren arteko elkarrekintza elektrostatikoen bidez, baldintza jakin batzuetan. Izozte-lehortze teknikak eta ihinztadura-lehortze teknikak erabili ziren kitosano/sodio tripolifosfato/intsulina gurutzatutako nanopartikula optimizatuak deshidratatzeko. Deshidratazioaren ondoren, haien morfologia SEM bidez aztertu zen. Haien birkonbinazio-gaitasuna ebaluatu zen haien tamaina-banaketa, gainazaleko karga, PDI, kapsulatze-eraginkortasuna eta karga-edukia neurtuz. Deshidratazio-metodo desberdinek sortutako birdisolbatutako nanopartikulen kalitatea ere ebaluatu zen haien intsulinaren babesa, askapen-portaera eta zelulen xurgapen-eraginkortasuna alderatuz.
Nahastutako disoluzioaren pHa eta kitosanoaren eta intsulinaren arteko erlazioa azken NP-en partikulen tamainan eta kapsulazio-eraginkortasunean (EE) eragiten duten bi faktore gako dira, gelifikazio ionotropikoaren prozesuan zuzenean eragiten baitute. Nahastutako disoluzioaren pHa partikulen tamainarekin eta kapsulazio-eraginkortasunarekin oso korrelazionatuta dagoela frogatu da (1a irudia). 1a irudian erakusten den bezala, pHa 4,0tik 6,0ra igotzean, batez besteko partikulen tamaina (nm) jaitsi egin zen eta EE nabarmen handitu zen, pHa 6,5era igotzean, batez besteko partikulen tamaina handitzen hasi zen eta EE aldatu gabe mantendu zen. Kitosanoaren eta intsulinaren arteko erlazioa handitzen den heinean, batez besteko partikulen tamaina ere handitzen da. Gainera, ez zen EE-an aldaketarik ikusi nanopartikulak 2,5:1 (w/w) baino handiagoa zen kitosano/intsulina masa-erlazioan prestatu zirenean (1b irudia). Beraz, ikerketa honetako prestaketa-baldintza optimoak (pH 6,0, kitosano/intsulina 2,5:1 masa-erlazioa) erabili ziren. intsulinaz kargatutako nanopartikulak prestatzeko ikerketa gehiago egiteko. Prestaketa-baldintza honetan, intsulina nanopartikulen batez besteko partikula-tamaina 318 nm-koa izateko optimizatu zen (1c irudia), PDI 0,18 izan zen, txertatze-eraginkortasuna % 99,4 izan zen, zeta potentziala 9,8 mv izan zen eta intsulina-karga % 25,01 izan zen (m/m). Transmisio-mikroskopia elektronikoaren (TEM) emaitzetan oinarrituta, optimizatutako nanopartikulak gutxi gorabehera esferikoak eta diskretuak ziren, tamaina nahiko uniformearekin (1d irudia).
Intsulina nanopartikulen parametroen optimizazioa: (a) pH-aren eragina intsulina nanopartikulen batez besteko diametroan eta kapsulazio-eraginkortasunean (EE) (kitosanoaren eta intsulinaren 5:1eko masa-erlazioan prestatuak); (b) kitosanoa eta intsulinaren masa-erlazioaren eragina intsulina NP-en batez besteko diametroan eta kapsulazio-eraginkortasunean (EE) (pH 6an prestatuak); (c) optimizatutako intsulina nanopartikulen partikula-tamainaren banaketa; (d) optimizatutako intsulina NP-en TEM mikrografia.
Jakina da kitosanoa polielektrolito ahula dela, 6,5eko pKa duena. Karga positiboa du ingurune azidoetan, bere amino talde nagusia hidrogeno ioiek protonatuta dagoelako15. Hori dela eta, askotan eramaile gisa erabiltzen da makromolekulak karga negatiboan kapsulatzeko. Ikerketa honetan, kitosanoa erabili da 5,3ko puntu isoelektrikoa duen intsulina kapsulatzeko. Kitosanoa estaldura-material gisa erabiltzen denez, bere proportzioa handitzen den heinean, nanopartikulen kanpoko geruzaren lodiera ere handitzen da dagokion moduan, eta ondorioz, partikula-tamaina handiagoa da batez beste. Gainera, kitosano maila altuagoek intsulina gehiago kapsulatu dezakete. Gure kasuan, EE altuena izan zen kitosanoaren eta intsulinaren arteko erlazioa 2,5:1era iritsi zenean, eta ez zen aldaketa esanguratsurik egon EE-n erlazioa handitzen jarraitu zuenean.
Kitosanoaren eta intsulinaren arteko erlazioaz gain, pH-ak ere funtsezko zeregina izan zuen NP-en prestaketan. Gan et al. 17-k pH-ak kitosano nanopartikulen partikula-tamainan duen eragina aztertu zuten. Partikula-tamainaren etengabeko jaitsiera aurkitu zuten pH-a 6,0ra iritsi arte, eta partikula-tamainaren igoera nabarmena ikusi zen pH> 6,0-an, gure behaketekin bat datorrena. Fenomeno hau pH-a handitzean intsulina molekulak gainazaleko karga negatiboa hartzen duelako gertatzen da, eta horrela, kitosano/sodio tripolifosfato (TPP) konplexuarekin elkarreragin elektrostatikoak faboratzen dira, partikula-tamaina txikia eta EE altua sortuz. Hala ere, pH-a 6,5era egokitu zenean, kitosanoaren amino taldeak desprotonatu egin ziren, eta horrek kitosanoaren tolestura eragin zuen. Horrela, pH altuak amino ioien esposizio txikiagoa dakar TPP eta intsulinarekiko, eta horrek gurutzaketa txikiagoa, batez besteko partikula-tamaina handiagoa eta EE txikiagoa eragiten ditu.
NP izoztu-lehortuen eta ihinztadura bidez lehortuen propietate morfologikoen analisiak deshidratazio eta hauts eraketa teknika hobeak hautatzeko gida dezake. Hobetsitako metodoak sendagaien egonkortasuna, partikula forma uniformea, sendagai karga handia eta jatorrizko disoluzioan disolbagarritasun ona eman behar ditu. Ikerketa honetan, bi teknikak hobeto alderatzeko, % 1eko manitolarekin edo gabe intsulina NP-ak erabili ziren deshidratazioan zehar. Manitola bolumen-agente edo kriobabesle gisa erabiltzen da hauts lehorreko hainbat formulaziotan izoztu-lehortzeko eta ihinztadura bidez lehortzeko. Manitol gabeko intsulina nanopartikula liofilizatuentzat, 2a irudian erakusten den bezala, gainazal handiak, irregularrak eta zakarrak zituen hauts-egitura oso porotsu bat ikusi zen eskaneatze-mikroskopia elektronikoaren (SEM) pean. Partikula diskretu gutxi batzuk detektatu ziren hautsean deshidratazioaren ondoren (2e irudia). Emaitza hauek adierazi zuten NP gehienak deskonposatu zirela izoztu-lehortzean zehar, kriobabeslerik gabe. % 1eko manitola duten intsulina nanopartikula izoztu-lehortuen eta ihinztadura bidez lehortuen kasuan, gainazal leunak zituzten nanopartikula esferikoak ikusi ziren (2e irudia). 2b,d,f,h). Manitol gabe ihinztatze bidez lehortutako intsulina nanopartikulak esferikoak izaten jarraitu zuten, baina gainazalean zimurrak zituzten (2c irudia). Gainazal esferiko eta zimurtuak gehiago aztertzen dira beheko askapen-portaera eta zelulen xurgapen-probetan. Lehortutako NP-en itxura ikusgaian oinarrituta, manitol gabe ihinztatze bidez lehortutako NP-ek eta manitolarekin izoztu eta ihinztatze bidez lehortutako NP-ek NP hauts finak eman zituzten (2f,g,h irudia). Partikulen gainazalen arteko azalera zenbat eta handiagoa izan, orduan eta disolbagarritasun handiagoa eta, beraz, askapen-tasa handiagoa.
Deshidratatutako intsulina NP desberdinen morfologia: (a) Manitol gabeko intsulina NP liofilizatuen SEM irudia; (b) Manitolarekin intsulina NP liofilizatuen SEM irudia; (c) Manitol gabe ihinztadura bidez lehortutako intsulina NPak; honen SEM irudia; (d) Manitolarekin ihinztadura bidez lehortutako intsulina NPen SEM irudia; (e) Manitol gabeko intsulina NP hauts liofilizatuen irudia; (f) Manitolarekin intsulina NP liofilizatuen irudia; (g) Manitol gabeko intsulina NP hauts ihinztadura bidez lehortutako irudia; (h) Manitolarekin ihinztadura bidez lehortutako intsulina NP hautsaren irudia.
Liofilizazio-lehortzean, manitolak kriobabesle gisa jokatzen du, NPak forma amorfoan mantenduz eta izotz kristalek eragindako kalteak saihestuz19. Aitzitik, ez dago izozte-urratsik ihinztadura-lehortzean. Beraz, ez da manitola beharrezkoa metodo honetan. Izan ere, manitol gabeko ihinztadura-lehortutako NPek NP finagoak eman zituzten, aurretik deskribatu bezala. Hala ere, manitolak betegarri gisa joka dezake ihinztadura-lehortze prozesuan, NPei egitura esferikoagoa emateko20 (2d irudia), eta horrek NP kapsulatu horien askapen-portaera uniformea ​​lortzen laguntzen du. Gainera, argi dago partikula handi batzuk detektatu daitezkeela manitola duten intsulina NP izoztu eta ihinztadura-lehortuetan (2b eta d irudiak), eta hori manitola partikularen nukleoan kapsulatutako intsulinarekin batera metatzeagatik izan daiteke. Kitosano geruza. Azpimarratzekoa da ikerketa honetan, deshidratazioaren ondoren egitura esferikoa osorik mantentzen dela ziurtatzeko, manitolaren eta kitosanoaren arteko erlazioa 5:1ean mantentzen dela, betegarri kantitate handi batek NP lehortuen partikula tamaina handitu dezan.
Fourier transformatuaren bidezko infragorri ahuldutako islapen osoaren (FTIR-ATR) espektroskopiak intsulina askearen, kitosanoaren, kitosanoaren, TPParen eta intsulinaren nahasketa fisikoa karakterizatu zuen. NP deshidratatu guztiak FTIR-ATR espektroskopia erabiliz karakterizatu ziren. Aipagarria da 1641, 1543 eta 1412 cm-1-ko banda-intentsitateak ikusi zirela manitolarekin izoztu-lehortutako NP kapsulatuetan eta manitolarekin eta gabe ihinztadura-lehortutako NPetan (3. irudia). Aurretik jakinarazi bezala, indar-igoera hauek kitosanoaren, TPParen eta intsulinaren arteko lotura gurutzatuarekin lotuta zeuden. Kitosanoaren eta intsulinaren arteko elkarrekintzaren ikerketak erakutsi zuen intsulinaz kargatutako kitosano nanopartikulen FTIR espektroetan, kitosanoaren banda intsulinarenarekin gainjartzen zela, karbonilo-intentsitatea (1641 cm-1) eta amina-gerrikoa (1543 cm-1) handituz. TPParen tripolifosfato taldeak kitosanoko amonio-taldeekin lotuta daude, 1412 cm-1-tan banda bat eratuz.
Intsulina askearen, kitosanoaren, kitosano/TPP/intsulinaren nahasketa fisikoen eta metodo ezberdinen bidez deshidratatutako NP-en FTIR-ATR espektroak.
Gainera, emaitza hauek SEM-ean erakutsitakoekin bat datoz, zeinak erakutsi baitzuen kapsulatutako NP-ak osorik mantendu zirela manitolarekin ihinztatu eta izoztu egin zirenean, baina manitolik ezean, ihinztadura-lehorketak bakarrik sortu zituen kapsulatutako partikulak. Aldiz, manitolik gabe izoztu-lehortutako NP-en FTIR-ATR espektro-emaitzak oso antzekoak izan ziren kitosano, TPP eta intsulinaren nahasketa fisikoarekin. Emaitza honek adierazten du kitosano, TPP eta intsulinaren arteko lotura gurutzatuak ez daudela jada manitolik gabe izoztu-lehortutako NP-etan. NP-en egitura suntsitu zen kriobabeslerik gabeko izoztu-lehortzean, SEM emaitzetan ikus daitekeen bezala (2a irudia). Deshidratatutako intsulina NP-en morfologian eta FTIR emaitzetan oinarrituta, liofilizatutako, ihinztadura-lehortutako eta manitol gabeko NP-ak bakarrik erabili ziren berreraikuntza-esperimentuetarako eta manitol gabeko NP-ak, deshidratazioan zehar manitol gabeko NP-en deskonposizioagatik. eztabaidatu.
Deshidratazioa epe luzerako biltegiratzeko eta beste formulazio batzuetan berriro prozesatzeko erabiltzen da. NP lehorrek biltegiratze ondoren berreraikitzeko duten gaitasuna funtsezkoa da tabletetan eta filmetan bezalako formulazio desberdinetan erabiltzeko. Ohartu ginen manitol gabe ihinztadura bidez lehortutako intsulina NP-en batez besteko partikula-tamaina apur bat baino ez zela handitu berreraiki ondoren. Bestalde, manitolarekin ihinztadura bidez lehortutako eta izoztu-lehortutako intsulina nanopartikulen partikula-tamaina nabarmen handitu zen (1. taula). PDI eta EE ez ziren nabarmen aldatu (p > 0,05) ikerketa honetako NP guztiak birkonbinatu ondoren (1. taula). Emaitza honek adierazten du partikula gehienak osorik mantendu zirela berriro disolbatu ondoren. Hala ere, manitolaren gehiketak liofilizatutako eta ihinztadura bidez lehortutako manitol nanopartikulen intsulina-karga asko murriztu zuen (1. taula). Aldiz, manitol gabe ihinztadura bidez lehortutako NP-en intsulina-karga-edukia lehen bezalakoa izan zen (1. taula).
Jakina da nanopartikulen karga kritikoa dela sendagaiak emateko erabiltzen direnean. Karga txikiko NP-entzat, material kantitate handiak behar dira atalase terapeutikoa lortzeko. Hala ere, NP kontzentrazio altu horien biskositate handiak eragozpenak eta zailtasunak sortzen ditu ahozko administrazioan eta injektagarri diren formulazioetan, hurrenez hurren 22. Horrez gain, intsulina NP-ak tabletak eta biofilm likatsuak egiteko ere erabil daitezke23, 24, eta horrek NP kantitate handiak erabiltzea eskatzen du karga-maila baxuetan, eta horrek tableta handiak eta biofilm lodiak sortzen ditu, ahozko aplikazioetarako egokiak ez direnak. Beraz, intsulina karga handiko NP deshidratatuak oso desiragarriak dira. Gure emaitzek iradokitzen dute manitol gabeko ihinztadura bidez lehortutako NP-en intsulina karga handiak abantaila erakargarri asko eskain ditzakeela administrazio-metodo alternatibo hauetarako.
NP deshidratatu guztiak hiru hilabetez hozkailuan gorde ziren. SEM emaitzek erakutsi zuten NP deshidratatu guztien morfologia ez zela nabarmen aldatu hiru hilabeteko biltegiratzean (4. irudia). Uretan berreraiki ondoren, NP guztiek EE apur bat jaitsi zuten eta intsulina kantitate txiki bat (~% 5) askatu zuten hiru hilabeteko biltegiratze-aldian (2. taula). Hala ere, nanopartikula guztien batez besteko partikula-tamaina handitu egin zen. Manitol gabe ihinztatutako NP-en partikula-tamaina 525 nm-ra igo zen, eta manitolarekin ihinztatutako eta izoztu-lehortutako NP-ena, berriz, 872 eta 921 nm-ra igo zen, hurrenez hurren (2. taula).
Hiru hilabetez gordetako intsulina NP deshidratatu desberdinen morfologia: (a) Manitolarekin liofilizatutako intsulina NP-en SEM irudia; (b) Manitolik gabeko ihinztadura bidez lehortutako intsulina nanopartikulen SEM irudia; (c) Manitolik gabeko ihinztadura bidez lehortutako intsulina NP-en SEM irudiak.
Gainera, prezipitatuak ikusi ziren manitolarekin ihinztatutako eta izoztu-lehortutako intsulina nanopartikula birkonposatuetan (S2 irudia). Hori uretan behar bezala esekita ez egoteagatik izan daiteke. Goiko emaitza guztiek erakusten dute ihinztatze bidezko lehortze teknikak intsulina nanopartikulak deshidrataziotik babestu ditzakeela eta intsulina nanopartikula karga handiak lor daitezkeela betegarririk edo kriobabeslerik gabe.
Intsulinaren atxikipena pH = 2,5eko ingurune batean probatu zen pepsinarekin, tripsinarekin eta α-kimotripsinarekin, NP-ek deshidratazioaren ondoren digestio entzimatikoaren aurka duten babes-gaitasuna frogatzeko. NP deshidratatuen intsulinaren atxikipena NP fresko prestatutakoekin alderatu zen, eta intsulina librea erabili zen kontrol negatibo gisa. Ikerketa honetan, intsulina libreak intsulinaren ezabatze azkarra erakutsi zuen 4 orduko epean hiru tratamendu entzimatikoetan (5a-c irudiak). Aitzitik, manitolarekin izoztu-lehortutako NP-en eta manitolarekin edo gabe ihinztadura-lehortutako NP-en intsulinaren ezabatze-probek NP hauen babes nabarmen handiagoa erakutsi zuten digestio entzimatikoaren aurka, intsulina NP fresko prestatutakoen antzekoa izanik (1. irudia). 5a-c). Pepsinaren, tripsinaren eta α-kimotripsinaren nanopartikulen laguntzarekin, intsulinaren % 50, % 60 eta % 75 baino gehiago babestu ahal izan zen 4 orduko epean, hurrenez hurren (5a-c irudiak). Intsulinaren aurkako babes-ahalmen honek... gaitasunak intsulinaren xurgapen handiagoa izateko aukera handitu dezake odolean25. Emaitza hauek iradokitzen dute manitolarekin edo manitolarekin lehortzeak eta izozte-lehortzeak NP-en intsulinaren aurkako babes-gaitasuna mantendu dezaketela deshidratazioaren ondoren.
Intsulina NP deshidratatuen babesa eta askapen-portaera: (a) intsulinaren babesa pepsina-disoluzioan; (b) intsulinaren babesa tripsina-disoluzioan; (c) α-kimotripsina-disoluzioak intsulinaren babesa; (d) NP deshidratatuen askapen-portaera pH = 2,5eko disoluzioan; (e) NP deshidratatuen askapen-portaera pH = 6,6ko disoluzioan; (f) NP deshidratatuen askapen-portaera pH = 7,0ko disoluzioan.
Intsulina nanopartikula lehor fresko prestatu eta berreraikiak hainbat bufferretan (pH = 2,5, 6,6, 7,0) inkubatu ziren 37 °C-tan, urdailaren, duodenoaren eta goiko heste meharraren pH ingurunea simulatuz, intsulinak intsulinarekiko erresistentzian duen eragina aztertzeko. Askapen-portaera ingurune desberdinetan. Digestio-aparatuaren zatia. pH = 2,5ean, intsulinaz kargatutako NP-ek eta birdisolbatutako intsulina lehorreko NP-ek hasierako askapen leherketa bat erakutsi zuten lehenengo ordubetean, eta ondoren askapen motela hurrengo 5 orduetan (5d irudia). Hasierako askapen azkar hau ziurrenik partikularen barne-egituran guztiz immobilizatuta ez dauden proteina molekulen gainazaleko desortzio azkarraren ondorioa da. pH = 6,5ean, intsulinaz kargatutako NP-ek eta birkonposatutako intsulina lehorreko NP-ek askapen leun eta motela erakutsi zuten 6 ordutan zehar, proba-disoluzioaren pHa NP-ekin prestatutako disoluzioaren antzekoa baitzen (5e irudia). pH = 7an, NP-ak ezegonkorrak ziren eta ia erabat deskonposatu ziren lehenengo bi orduetan (5f irudia). Hau da, kitosanoaren desprotonazioa pH altuagoetan gertatzen delako, eta horrek polimero-sare trinkoagoa eta kargatutako intsulinaren askapena eragiten du.
Gainera, manitol gabe ihinztadura bidez lehortutako intsulina NP-ek askapen-profil azkarragoa erakutsi zuten beste NP deshidratatuek baino (5d-f irudiak). Aurretik deskribatu bezala, manitol gabe lehortutako intsulina NP berreraikiek partikula-tamaina txikiena erakutsi zuten. Partikula txikiek azalera handiagoa ematen dute, beraz, dagokion sendagai gehiena partikularen gainazalean edo inguruan egongo da, eta horrek sendagaiaren askapen azkarra eragingo du26.
NP-en zitotoxikotasuna MTT analisi bidez ikertu zen. S4 irudian erakusten den bezala, NP deshidratatu guztiek ez zuten eragin nabarmenik zelulen bideragarritasunean 50-500 μg/ml-ko kontzentrazioetan, eta horrek iradokitzen du NP deshidratatu guztiak segurtasunez erabil daitezkeela leiho terapeutikoa lortzeko.
Gibela da intsulinak bere funtzio fisiologikoak betetzen dituen organo nagusia. HepG2 zelulak in vitro hepatozitoen xurgapen-eredu gisa erabili ohi diren gizakien hepatoma zelula-lerro bat dira. Hemen, HepG2 zelulak erabili ziren NP deshidratatuen zelulen xurgapena ebaluatzeko, izozte-lehortze eta ihinztadura-lehortze metodoak erabiliz. Zelulen xurgapena laser eskaneatzea konfokal bidez, fluxu-zitometria eta ikusmena erabiliz, FITC intsulina librearekin 25 μg/mL-ko kontzentrazioan, FITC intsulinaz kargatutako NP freskoekin eta FITC intsulinaz kargatutako NP deshidratatuekin intsulina-kontzentrazio berdinetan inkubazio ordu batzuk egin ondoren. Mikroskopia kuantitatiboaren (CLSM) behaketak egin ziren. Manitol gabeko NP liofilizatuak deshidratazioan suntsitu ziren eta ez ziren proba honetan ebaluatu. Intsulinaz kargatutako NP fresko prestatuen, manitolarekin liofilizatutako NPen eta manitolarekin eta gabe ihinztadura-lehortutako NPen (6a irudia) zelula barneko fluoreszentzia intentsitateak 4,3, 2,6, 2,4 izan ziren. eta 4,1 aldiz handiagoak askeak baino.FITC-intsulina taldea, hurrenez hurren (6b irudia).Emaitza hauek iradokitzen dute kapsulatutako intsulina intsulina askea baino indartsuagoa dela zelulen xurgapenean, batez ere ikerketan sortutako intsulinaz kargatutako nanopartikulen tamaina txikiagoa dela eta.
HepG2 zelulen xurgapena NP freskoekin eta NP deshidratatuekin 4 orduko inkubazioaren ondoren: (a) HepG2 zelulek FITC-intsulinaren xurgapenaren banaketa. (b) Fluxu-zitometria bidez aztertutako fluoreszentzia intentsitateen batez besteko geometrikoa (n = 3), *P < 0,05 intsulina librearekin alderatuta.
Era berean, CLSM irudiek erakutsi zuten FITC intsulinaz kargatutako NP freskoen eta FITC intsulinaz kargatutako ihinztadura-lehortutako NP-en (manitol gabe) FITC fluoreszentzia intentsitateak beste laginenak baino askoz indartsuagoak zirela (6a irudia). Gainera, manitola gehituta, disoluzioaren biskositate handiagoak zelulen xurgapenarekiko erresistentzia handitu zuen, eta ondorioz intsulinaren ugalketa gutxitu zen. Emaitza hauek iradokitzen dute manitol gabeko ihinztadura-lehortutako NP-ek zelulen xurgapen-eraginkortasun handiena erakutsi zutela, haien partikula-tamaina izoztu-lehortutako NP-ena baino txikiagoa zelako berriro disolbatu ondoren.
Kitosanoa (batez besteko pisu molekularra 100 KDa, % 75-85 desazetilatua) Sigma-Aldrich-etik erosi zen (Oakville, Ontario, Kanada). Sodio tripolifosfatoa (TPP) VWR-tik erosi zen (Radnor, Pennsylvania, AEB). Ikerketa honetan erabilitako giza intsulina birkonbinatua Fisher Scientific-etik (Waltham, MA, AEB) etorri zen. Fluoreszeina isotiozianatoarekin (FITC) markatutako giza intsulina eta 4′,6-diamidino-2-fenilindol dihidrokloruroa (DAPI) Sigma-Aldrich-etik erosi ziren (Oakville, Ontario, Kanada). HepG2 zelula-lerroa ATCC-tik lortu zen (Manassas, Virginia, AEB). Gainerako erreaktibo guztiak analitikoak edo kromatografikoak ziren.
Prestatu 1 mg/ml-ko CS disoluzio bat ur destilatu bikoitzean (DD ura) disolbatuz, % 0,1eko azido azetikoa duena. Prestatu TPP eta intsulinaren 1 mg/ml-ko disoluzioak, DD uretan eta % 0,1eko azido azetikoan disolbatuz, hurrenez hurren. Aurre-emultsioa polytron PCU-2-110 abiadura handiko homogeneizatzaile batekin prestatu zen (Brinkmann Ind. Westbury, NY, AEB). Prestaketa prozesua honako hau da: lehenik, 2 ml TPP disoluzio gehitzen zaizkio 4 ml intsulina disoluziori, eta nahastea 30 minutuz irabiatu eta guztiz nahastu da. Ondoren, nahastutako disoluzioa tantaka gehitu zitzaion CS disoluzioari xiringa baten bidez abiadura handian irabiatzen (10.000 rpm). Nahasteak abiadura handian irabiatzen mantendu ziren (15.000 rpm) izotz-bainu batean 30 minutuz, eta pH jakin batera egokitu ziren intsulina NP gurutzatuak lortzeko. Intsulina NP-en partikula-tamaina gehiago homogeneizatzeko eta murrizteko, sonikatu ziren... beste 30 minutu izotz-bainu batean zunda motako sonikagailu bat erabiliz (UP 200ST, Hielscher Ultrasonics, Teltow, Alemania).
Intsulina NPSak Z batez besteko diametroa, polidispertsio indizea (PDI) eta zeta potentziala aztertu ziren Litesizer 500 bat (Anton Paar, Graz, Austria) erabiliz argiaren sakabanaketa dinamikoaren (DLS) neurketak erabiliz, 25 °C-tan DD uretan diluituz. Morfologia eta tamaina banaketa Hitachi H7600 transmisio mikroskopio elektroniko (TEM) batekin (Hitachi, Tokio, Japonia) karakterizatu ziren, eta irudiak ondoren Hitachi irudi softwarea erabiliz aztertu ziren (Hitachi, Tokio, Japonia). Intsulina NP-en kapsulazio eraginkortasuna (EE) eta kargatzeko gaitasuna (LC) ebaluatzeko, NP-ak 100 kDa-ko pisu molekularreko muga duten ultrafiltrazio hodietan pipetatu eta 500 xg-tan zentrifugatu ziren 30 minutuz. Iragazkian kapsulatu gabeko intsulina Agilent 1100 Series HPLC sistema bat erabiliz kuantifikatu zen (Agilent, Santa Clara, Kalifornia, AEB), ponpa kuaternario bat, autolagingailu bat, zutabe berogailu bat eta beste hainbat unitatez osatua. eta DAD detektagailua.Intsulina C18 zutabe batekin aztertu zen (Zorbax, 3,5 μm, 4,6 mm × 150 mm, Agilent, AEB) eta 214 nm-tan detektatu zen.Fase mugikorra azetonitriloa eta ura izan ziren, % 0,1 TFA zuena, 10/90etik 100/0ra bitarteko gradiente-erlazioekin, eta 10 minutuz exekutatu zen.Fase mugikorra 1,0 ml/min-ko emari-abiaduran ponpatu zen.Zutabearen tenperatura 20 °C-tan ezarri zen.Kalkulatu EE eta LC ehunekoak (1) eta (2) ekuazioak erabiliz.
2,0tik 4,0ra bitarteko CS/intsulina erlazio desberdinak probatu ziren intsulina NP optimizatzeko. CS disoluzio kantitate desberdinak gehitu ziren prestaketan zehar, intsulina/TPP nahastea konstante mantenduz. Intsulina NPak 4,0tik 6,5era bitarteko pH tartean prestatu ziren, nahastearen pHa arretaz kontrolatuz disoluzio guztiak (intsulina, TPP eta CS) gehitu ondoren. Intsulina nanopartikulen EE eta partikula tamaina pH balio eta CS/intsulina masa erlazio desberdinetan ebaluatu ziren intsulina NPen eraketa optimizatzeko.
Intsulina NP optimizatuak aluminiozko ontzi batean jarri eta zinta itsasgarri batekin estali ziren. Ondoren, torlojututako ontziak Labconco FreeZone izozte-lehorgailu batean jarri ziren (Labconco, Kansas City, MO, AEB), erretilu-lehorgailu batekin hornituta. Tenperatura eta hutsune-presioa -10 °C-tan eta 0,350 Torr-tan ezarri ziren lehenengo 2 orduetan, eta 0 °C-tan eta 0,120 Torr-tan 24 orduko gainerako 22 orduetan, intsulina NP lehorrak lortzeko.
Buchi Mini Spray Dryer B-290 (BÜCHI, Flawil, Suitza) erabili zen intsulina kapsulatua sortzeko. Hautatutako lehortze-parametroak hauek izan ziren: tenperatura 100 °C, elikatze-emaria 3 L/min eta gas-emaria 4 L/min.
Intsulina nanopartikulak deshidratazioaren aurretik eta ondoren FTIR-ATR espektroskopia erabiliz karakterizatu ziren. Nanopartikula deshidratatuak, baita intsulina eta kitosano askeak ere, Spectrum 100 FTIR espektrofotometro bat (PerkinElmer, Waltham, Massachusetts, AEB) erabiliz aztertu ziren, ATR laginketa osagarri unibertsal batekin (PerkinElmer, Waltham, Massachusetts, AEB) hornituta. Seinaleen batez bestekoak 16 eskaneoetatik lortu ziren, 4 cm2-ko bereizmenarekin, 4000-600 cm2-ko maiztasun-tartean.
Intsulina nanopartikula lehorren morfologia Helios NanoLab 650 Focused Ion Sorta Eskaneatze Mikroskopio Elektroniko (FIB-SEM) (FEI, Hillsboro, Oregon, AEB) batekin hartutako intsulina nanopartikulen SEM irudien bidez ebaluatu zen. Erabilitako parametro nagusia 5 keV-ko tentsioa eta 30 mA-ko korrontea izan ziren.
Deshidratatutako intsulina NP guztiak dd uretan berriro disolbatu ziren. Partikula tamaina, PDI, EE eta LC berriro probatu ziren, aurretik aipatutako metodo bera erabiliz, deshidratazioaren ondoren haien kalitatea ebaluatzeko. Anhidrointsulina NP-en egonkortasuna ere neurtu zen, NP-en propietateak denbora luzez biltegiratze baten ondoren probatuz. Ikerketa honetan, deshidratazioaren ondoren NP guztiak hozkailuan gorde ziren hiru hilabetez. Hiru hilabeteko biltegiratzearen ondoren, NP-ak partikula tamaina morfologikorako, PDI, EE eta LC probatu ziren.
Disolbatu 5 mL NP birkonposatu 45 mL-tan, urdaileko fluido simulatuan (pH 1.2, % 1 pepsina duena), hesteetako fluidoan (pH 6.8, % 1 tripsina duena) edo kimotripsina disoluzioan (100 g/mL, fosfato bufferrean, pH 7.8), deshidratazioaren ondoren NPak babesteko intsulinaren eraginkortasuna ebaluatzeko. 37 °C-tan inkubatu ziren, 100 rpm-ko irabiadura-abiadurarekin. Disoluzioaren 500 μL bildu ziren denbora-puntu desberdinetan eta intsulinaren kontzentrazioa HPLC bidez zehaztu zen.
Intsulina NP fresko eta deshidratatuen in vitro askapen-portaera dialisi-poltsaren metodoaren bidez probatu zen (pisu molekularraren muga 100 kDa, Spectra Por Inc.). Fresko prestatu eta berreraikitako NP lehorrak pH 2,5, pH 6,6 eta pH 7,0ko fluidoetan dializatu ziren (0,1 M fosfato-bufferdun gatz-soluzioa, PBS), urdailaren, duodenoaren eta goiko heste meharraren pH ingurunea simulatzeko, hurrenez hurren. Lagin guztiak 37 °C-tan inkubatu ziren, 200 rpm-ko astindu jarraituarekin. 5 mL-ko dialisi-poltsaren kanpoko fluidoa aspiratu denbora hauetan: 0,5, 1, 2, 3, 4 eta 6 ordu, eta berehala bete bolumena dializatu freskoarekin. Fluidoan intsulinaren kutsadura HPLC bidez aztertu zen, eta nanopartikuletatik intsulinaren askapen-tasa kalkulatu zen askatutako intsulina librearen eta nanopartikuletan kapsulatutako intsulina osoaren arteko erlaziotik (3. ekuazioa).
Gizakien hepatozelula-kartzinomaren zelula-lerro HepG2 zelulak 60 mm-ko diametroko plaketan hazi ziren Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM) erabiliz, % 10eko behi-fetuaren seruma, 100 IU/mL penizilina eta 100 μg/mL estreptomizina29 zituena. Kulturak 37 °C-tan, % 95eko hezetasun erlatiboan eta % 5eko CO2-an mantendu ziren. Xurgapen-analisietarako, HepG2 zelulak 1 × 105 zelula/ml-tan erein ziren 8 putzuko Nunc Lab-Tek ganbera-diapositiba-sistema batean (Thermo Fisher, NY, AEB). Zitotoxikotasun-analisietarako, 96 putzuko plaketan erein ziren (Corning, NY, AEB) 5 × 104 zelula/ml-ko dentsitatean.
MTT analisia erabili zen intsulina NP30 fresko prestatu eta deshidratatuen zitotoxikotasuna ebaluatzeko. HepG2 zelulak 96 putzuko plaketan erein ziren 5 × 104 zelula/mL-ko dentsitatean eta 7 egunez landu ziren probatu aurretik. Intsulina NPak kontzentrazio desberdinetan diluitu ziren (50 eta 500 μg/mL artean) hazkuntza-ingurunean eta gero zelulei eman zitzaizkien. 24 orduko inkubazioaren ondoren, zelulak 3 aldiz garbitu ziren PBS-rekin eta 0,5 mg/ml MTT zuen ingurunearekin inkubatu ziren beste 4 orduz. Zitotoxikotasuna ebaluatu zen tetrazolio MTT horiaren formazan morerako erredukzio entzimatikoa neurtuz 570 nm-tan Tecan infinite M200 pro espektrofotometro plaka irakurgailu bat erabiliz (Tecan, Männedorf, Suitza).
NP-en zelulen xurgapen-eraginkortasuna mikroskopia laser konfokal bidezko eskaneatze eta fluxu-zitometria bidezko analisi bidez probatu zen. Nunc Lab-Tek ganbera-diapositiba sistemaren putzu bakoitza FITC-intsulina librearekin, FITC-intsulinaz kargatutako NP-ekin tratatu zen, eta 25 μg/mL FITC-intsulina NP deshidratatuekin berreraiki ziren kontzentrazio berean eta 4 orduz inkubatu ziren. Zelulak 3 aldiz garbitu ziren PBS-rekin eta % 4ko paraformaldehidoarekin finkatu ziren. Nukleoak 4′,6-diamidino-2-fenilindolarekin (DAPI) tindatu ziren. Intsulinaren lokalizazioa Olympus FV1000 laser eskaneatze/bi fotoi mikroskopio konfokal bat erabiliz ikusi zen (Olympus, Shinjuku City, Tokio, Japonia). Fluxu-zitometria bidezko analisietarako, 10 μg/mL FITC-intsulina librearen, FITC-intsulinaz kargatutako NP-en eta birdisolbatutako FITC-intsulina NP deshidratatuen kontzentrazio berdinak gehitu ziren. 96 putzuko plakak HepG2 zelulekin ereindakoak eta 4 orduz inkubatu ziren. 4 orduko inkubazioaren ondoren, zelulak kendu eta 3 aldiz garbitu ziren FBS-rekin. Lagin bakoitzeko 5 × 104 zelula BD LSR II fluxu-zitometro batekin aztertu ziren (BD, Franklin Lakes, New Jersey, Ameriketako Estatu Batuak).
Balio guztiak batez besteko ± desbideratze estandar gisa adierazten dira. Talde guztien arteko konparaketak ANOVA norabide bakarreko edo IBM SPSS Statistics 26 for Mac-en (IBM, Endicott, New York, AEB) t-testa erabiliz ebaluatu ziren eta p < 0,05 estatistikoki esanguratsua kontsideratu zen.
Ikerketa honek erakusten du ihinztadura bidezko lehortzearen malgutasuna eta gaitasuna kitosano/TPP/intsulina nanopartikula gurutzatuak deshidratatzeko, birkonposizio hobea lortuz, agente bolumen-emaileak edo kriobabesleak erabiltzen dituzten izozte-lehortze metodo estandarrekin alderatuta, eta karga-ahalmen handiagoa dute. Intsulina nanopartikula optimizatuek 318 nm-ko batez besteko partikula-tamaina eta % 99,4ko kapsulazio-eraginkortasuna eman zituzten. SEM eta FTIR emaitzek, deshidratazioaren ondoren, erakutsi zuten egitura esferikoa manitolarekin eta manitolarekin liofilizatutako eta manitolarekin lehortutako NP-etan bakarrik mantentzen zela, baina manitolik gabeko NP liofilizatuak deskonposatu egin ziren deshidratazioan zehar. Birkonposizio-gaitasun proban, manitolik gabeko intsulina nanopartikula ihinztadura bidez lehortuek batez besteko partikula-tamaina txikiena eta karga handiena erakutsi zuten birkonposizioan. Deshidratatutako NP hauen guztien askapen-portaerak erakutsi zuen azkar askatzen zirela pH = 2,5 eta pH = 7ko disoluzioetan, eta oso egonkorrak zirela pH = 6,5eko disoluzioan. Beste NP deshidratatu birdisolbatu batzuekin alderatuta, NP-ak... Manitol gabe ihinztadura bidez lehortuak erakutsi zuen askapen azkarrena. Emaitza hau zelulen xurgapen-analisian ikusitakoarekin bat dator, manitol gabe ihinztadura bidez lehortutako NP-ek ia erabat mantendu baitzuten prestatutako NP freskoen zelulen xurgapen-eraginkortasuna. Emaitza hauek iradokitzen dute manitol gabe ihinztadura bidez lehortutako intsulina nanopartikula lehorrak egokienak direla beste dosi-forma anhidro batzuetan prozesatzeko, hala nola ahozko tabletetan edo film bioitsaskorretan.
Jabetza intelektualaren inguruko arazoak direla eta, egungo ikerketan zehar sortutako eta/edo aztertutako datu-multzoak ez daude publikoki eskuragarri, baina dagokien egileengandik eskuragarri daude arrazoizko eskaera eginez gero.
Kagan, A. 2 motako diabetesa: jatorri sozial eta zientifikoak, konplikazio medikoak eta ondorioak pazienteentzat eta besteentzat. (McFarlane, 2009).
Singh, AP, Guo, Y., Singh, A., Xie, W. eta Jiang, P. Intsulinaren kapsulazioaren garapena: posible al da ahozko administrazioa orain? J. Pharmacy.bio-pharmacy.reservoir.1, 74–92 (2019).
Wong, CY, Al-Salami, H. eta Dass, CR Aurrerapen berriak diabetesa tratatzeko intsulinaz kargatutako liposoma emateko sistemetan. Interpretazioa. J. Farmazia. 549, 201–217 (2018).