Artikulua "Lekaleen erresistentzia hobetzea patogeno eta izurriteen aurrean" ikerketa-gaiaren parte da, ikusi 5 artikulu guztiak
Sclerotinia sclerotiorum (Lib.) de Bary onddoaren landareen nekrosiaren agente kausalak estrategia mailakatua erabiltzen du ostalari-landare desberdinak infektatzeko. Ikerketa honek diamina L-ornitina erabiltzea proposatzen du, beste aminoazido esentzial batzuen sintesia estimulatzen duen aminoazido ez-proteiko bat, Phaseolus vulgaris L.-k Pseudomonas sclerotiorum-ek eragindako lizun zuriaren aurrean dituen erantzun molekular, fisiologiko eta biokimikoak hobetzeko kudeaketa-estrategia alternatibo gisa. In vitro esperimentuek erakutsi zuten L-ornitinak nabarmen inhibitzen zuela S. pyrenoidosaren mizelio-hazkuntza, dosiaren araberako moduan. Gainera, nabarmen murriztu zezakeen lizun zuriaren larritasuna negutegi-baldintzetan. Gainera, L-ornitinak tratatutako landareen hazkuntza estimulatu zuen, eta horrek adierazten du probatutako L-ornitinaren kontzentrazioak ez zirela fitotoxikoak tratatutako landareentzat. Horrez gain, L-ornitinak antioxidatzaile ez-entzimatikoen (fenoliko eta flavonoide disolbagarri totalak) eta antioxidatzaile entzimatikoen (katalasa (CAT), peroxidasa (POX) eta polifenol oxidasa (PPO)) adierazpena areagotu zuen, eta antioxidatzaileekin lotutako hiru geneen adierazpena handitu zuen (PvCAT1, PvSOD eta PvGR). Gainera, in silico analisiak ustezko oxaloazetato azetilhidrolasa (SsOAH) proteina baten presentzia agerian utzi zuen S. sclerotiorum genoman, eta hau oso antzekoa zen Aspergillus fijiensis (AfOAH) eta Penicillium sp. (PlOAH) proteinen oxaloazetato azetilhidrolasa (SsOAH) proteinen analisi funtzionalari, domeinu kontserbatuei eta topologiari dagokienez. Interesgarria da, L-ornitina patata-dextrosa salda (PDB) medioari gehitzeak SsOAH genearen adierazpena nabarmen murriztu zuela S. sclerotiorum mizelioetan. Era berean, L-ornitinaren aplikazio exogenoak nabarmen murriztu zuen SsOAH genearen adierazpena tratatutako landareetatik bildutako onddoen mizelioetan. Azkenik, L-ornitinaren aplikazioak nabarmen murriztu zuen azido oxalikoaren jariapena bai PDB ingurunean bai kutsatutako hostoetan. Ondorioz, L-ornitinak funtsezko zeregina du erredox egoera mantentzeko, baita kutsatutako landareen defentsa-erantzuna hobetzeko ere. Ikerketa honen emaitzek lagun dezakete lizun zuria kontrolatzeko eta babarrun-ekoizpenean eta beste labore batzuetan duen eragina arintzeko metodo berritzaile eta ingurumena errespetatzen dutenak garatzen.
Lizun zuria, Sclerotinia sclerotiorum (Lib.) de Bary onddo nekrotrofoak eragindakoa, gaixotasun suntsitzailea da, uzta murrizten duena, eta mehatxu larria dakar babarrunaren (Phaseolus vulgaris L.) ekoizpen globalarentzat (Bolton et al., 2006). Sclerotinia sclerotiorum lurzoruan transmititzen diren onddoen landare-patogeno zailenetako bat da kontrolatzeko, 600 landare-espezie baino gehiagoko ostalari-sorta zabala baitu eta ostalari-ehunak modu ez-espezifikoan azkar beratzeko gaitasuna baitu (Liang eta Rollins, 2018). Baldintza desegokietan, bere bizi-zikloaren fase kritiko bat jasaten du, denbora luzez lozorroan 'esklerozio' izeneko egitura beltz, gogor eta hazi-itxurako gisa edo landare infektatuen mizelioan edo zurtoin-muinean hazkuntza zuri eta leun gisa (Schwartz et al., 2005). S. sclerotiorum gai da esklerozioak sortzeko, eta horrek aukera ematen dio denbora luzez bizirauteko infektatutako soroetan eta gaixotasunaren garaian ere irauteko (Schwartz et al., 2005). Esklerozioak mantenugaietan aberatsak dira, lurzoruan denbora luzez iraun dezakete eta ondorengo infekzioetarako inokulu nagusi gisa balio dute (Schwartz et al., 2005). Baldintza onetan, esklerozioak ernetu eta landarearen gaineko atal guztiak infektatu ditzaketen aireko esporak sortzen dituzte, loreak, zurtoinak edo lekak barne, baina ez horietara mugatuta (Schwartz et al., 2005).
Sclerotinia sclerotiorum-ek estrategia mailakatua erabiltzen du bere ostalari-landareak infektatzeko, hainbat gertaera koordinatu barne hartzen dituena esklerotialen ernetzetik hasi eta sintomen garapenera arte. Hasieran, S. sclerotiorum-ek espora esekiak (askospora deiturikoak) sortzen ditu apotezio izeneko perretxiko itxurako egituretatik, eta hauek airean bihurtzen dira eta esklerozio ez-mugikor bihurtzen dira kutsatutako landare-hondakinetan (Bolton et al., 2006). Ondoren, onddoak azido oxalikoa jariatzen du, birulentzia faktore bat, landare-zelulen hormaren pHa kontrolatzeko, degradazio entzimatikoa eta ehunen inbasioa sustatzeko (Hegedus eta Rimmer, 2005) eta ostalari-landarearen eztanda oxidatiboa murrizteko. Azidotze-prozesu honek landare-zelulen horma ahultzen du, onddoen zelula-horma degradatzen duten entzimen (CWDE) funtzionamendu normal eta eraginkorrerako ingurune egokia eskainiz, patogenoari hesi fisikoa gainditzeko eta ostalari-ehunetan sartzeko aukera emanez (Marciano et al., 1983). Behin zeharkatuta, S. sclerotiorum-ek hainbat CWDE jariatzen ditu, hala nola poligalakturonasa eta zelulasa, eta horiek errazten dute infektatutako ehunetan zabaltzea eta ehunen nekrosia eragiten dute. Lesioen eta hifen makilen progresioak lizun zuriaren sintoma bereizgarriak eragiten ditu (Hegedus eta Rimmer, 2005). Bitartean, ostalari landareek patogenoekin lotutako eredu molekularrak (PAMP) ezagutzen dituzte ereduen ezagutza hartzaileen (PRR) bidez, eta horrek seinaleztapen gertaera sorta bat abiarazten du, eta horiek azkenean defentsa erantzunak aktibatzen dituzte.
Hamarkadetan zehar gaixotasunak kontrolatzeko ahaleginak egin arren, babarrunetan, beste labore komertzial batzuetan bezala, germen-plasma erresistente egokiaren gabezia dago oraindik, patogenoaren erresistentzia, biziraupena eta egokitzapen-gaitasuna direla eta. Beraz, gaixotasunen kudeaketa oso erronka handia da eta estrategia integratu eta anitzekoa behar du, praktika kulturalak, kontrol biologikoa eta fungizida kimikoak konbinatzen dituena (O'Sullivan et al., 2021). Molde zuriaren kontrol kimikoa da eraginkorrena, fungizidek, behar bezala eta une egokian aplikatzen direnean, gaixotasunaren hedapena eraginkortasunez kontrolatu, infekzioaren larritasuna murriztu eta uzta-galerak minimizatu ditzaketelako. Hala ere, fungiziden gehiegizko erabilerak eta gehiegizko mendekotasunak S. sclerotiorum-en andui erresistenteak agertzea ekar dezake eta helburu ez diren organismoetan, lurzoruaren osasunean eta uraren kalitatean eragin negatiboa izan dezake (Le Cointe et al., 2016; Ceresini et al., 2024). Beraz, ingurumena errespetatzen duten alternatibak aurkitzea lehentasun nagusia bihurtu da.
Poliaminek (PAk), hala nola putreszina, espermidina, esperma eta kadaverina, lurzoruan dauden landare-patogenoen aurkako alternatiba itxaropentsuak izan daitezke, eta horrela, fungizida kimiko arriskutsuen erabilera guztiz edo partzialki murriztu (Nehela et al., 2024; Yi et al., 2024). Goi-mailako landareetan, PAk prozesu fisiologiko askotan parte hartzen dute, besteak beste, zelulen zatiketan, bereizketan eta estres abiotiko eta biotikoei erantzutean (Killiny eta Nehela, 2020). Antioxidatzaile gisa jardun dezakete, oxigeno erreaktiboen espezieak (ROS) kentzen lagun dezakete, erredox homeostasia mantentzen dute (Nehela eta Killiny, 2023), defentsa-geneak eragiten dituzte (Romero et al., 2018), hainbat bide metaboliko erregulatzen dituzte (Nehela eta Killiny, 2023), fitohormona endogenoak modulatzen dituzte (Nehela eta Killiny, 2019), erresistentzia sistemiko eskuratua (SAR) ezartzen dute eta landare-patogeno elkarrekintzak erregulatzen dituzte (Nehela eta Killiny, 2020; Asija et al., 2022; Czerwoniec, 2022). Aipatzekoa da PA-en mekanismo eta eginkizun espezifikoak landare-espezieen, patogenoen eta ingurumen-baldintzen arabera aldatzen direla. Landareetan PA ugariena L-ornitina poliamina esentzialetik biosintetizatzen da (Killiny eta Nehela, 2020).
L-ornitinak hainbat rol jokatzen ditu landareen hazkuntzan eta garapenean. Adibidez, aurreko ikerketek erakutsi dute arrozean (Oryza sativa) ornitina nitrogenoaren birziklapenarekin (Liu et al., 2018), arrozaren errendimenduarekin, kalitatearekin eta usainarekin (Lu et al., 2020) eta uraren estresaren erantzunarekin (Yang et al., 2000) lotuta egon daitekeela. Gainera, L-ornitinaren aplikazio exogenoak nabarmen hobetu zuen lehortearekiko tolerantzia erremolatxa azukre-landarean (Beta vulgaris) (Hussein et al., 2019) eta gatz-estresa arindu zuen tipula-landareetan (Allium Cepa) (Çavuşoǧlu eta Çavuşoǧlu, 2021) eta anakardo-landareetan (Anacardium occidentale) (da Rocha et al., 2012). L-ornitinak estres abiotikoaren aurkako defentsan izan dezakeen rol potentziala tratatutako landareetan prolina metatzean duen parte-hartzeagatik izan daiteke. Adibidez, prolinaren metabolismoarekin lotutako geneak, hala nola ornitina delta aminotransferasa (delta-OAT) eta prolina deshidrogenasa (ProDH1 eta ProDH2) geneak, Nicotiana benthamiana eta Arabidopsis thaliana-ren defentsan parte hartzen dutela jakinarazi da lehenago, Pseudomonas syringae ez-ostalarien anduien aurka (Senthil-Kumar eta Mysore, 2012). Bestalde, onddoen ornitina deskarboxilasa (ODC) beharrezkoa da patogenoen hazkuntzarako (Singh et al., 2020). Fusarium oxysporum f. sp. lycopersici-ren ODC-a ostalariak eragindako geneen isiltzearen (HIGS) bidez bideratzeak tomate landareen Fusarium zimeltzearen aurkako erresistentzia nabarmen handitu zuen (Singh et al., 2020). Hala ere, ornitina exogenoaren aplikazioak fitopatogenoen moduko estres biotikoen aurka izan dezakeen balizko eginkizuna ez da ondo aztertu. Garrantzitsuagoa dena, ornitinaren efektuak gaixotasunekiko erresistentzian eta harekin lotutako fenomeno biokimiko eta fisiologikoetan oraindik ere ez dira aztertu.
Lekaleen S. sclerotiorum infekzioaren konplexutasuna ulertzea garrantzitsua da kontrol-estrategia eraginkorrak garatzeko. Ikerketa honetan, diamina L-ornitina landareen defentsa-mekanismoak eta erresistentzia Sclerotinia sclerotiorum infekzioarekiko hobetzeko faktore gako gisa duen eginkizun potentziala identifikatzea izan dugu helburu. Hipotesi gisa, landare infektatuen defentsa-erantzunak hobetzeaz gain, L-ornitinak erredox egoera mantentzeko ere funtsezko zeregina betetzen duela proposatzen dugu. Proposatzen dugu L-ornitinaren efektu potentzialak defentsa-mekanismo antioxidatzaile entzimatiko eta ez-entzimatikoen erregulazioarekin eta onddoen patogenotasun/birulentzia faktoreekin eta lotutako proteinekin interferentziarekin lotuta daudela. L-ornitinaren funtzionalitate bikoitz honek hautagai itxaropentsua bihurtzen du lizun zuriaren eragina arintzeko eta lekale-labore arrunten erresistentzia hobetzeko onddo-patogeno indartsu honen aurrean estrategia iraunkor baterako. Ikerketa honen emaitzek lizun zuria kontrolatzeko eta lekaleen ekoizpenean duen eragina arintzeko metodo berritzaile eta ingurumena errespetatzen dutenak garatzen lagun dezakete.
Ikerketa honetan, Giza 3 (Phaseolus vulgaris L. cv. Giza 3) babarrun arruntaren barietate komertzial sentikor bat erabili zen material esperimental gisa. Lekaleen Ikerketa Sailak, Eremu Laborantzien Ikerketa Institutuak (FCRI), Nekazaritza Ikerketa Zentroak (ARC), Egipto, eman zituen hazi osasuntsuak. Bost hazi erein ziren plastikozko ontzietan (35 cm-ko barne diametroa, 50 cm-ko sakonera), S. sclerotiorum-ez infektatutako lurzoruz beteta, negutegi-baldintzetan (25 ± 2 °C, hezetasun erlatiboa % 75 ± 1, 8 ordu argi/16 ordu iluntasun). Erein eta 7-10 egunera (DPS), landareak mehetu ziren, hazkuntza uniformea ​​zuten bi landare eta hiru hosto guztiz zabaldu uzteko ontzi bakoitzean. Lorontzietako landare guztiak bi astean behin ureztatu ziren eta hilero ongarritu ziren barietate bakoitzerako gomendatutako tasan.
500 mg/L-ko L-ornitinadiamina kontzentrazioa prestatzeko (+)-(S)-2,5-diaminopentanoiko azido gisa ere ezaguna; Sigma-Aldrich, Darmstadt, Alemania), 50 mg lehenik 100 mL ur destilatu esterilean disolbatu ziren. Ondoren, stock soluzioa diluitu eta ondorengo esperimentuetan erabili zen. Laburbilduz, L-ornitina kontzentrazioen sei serie (12,5, 25, 50, 75, 100 eta 125 mg/L) in vitro probatu ziren. Horrez gain, ur destilatu esterila erabili zen kontrol negatibo gisa (Mock) eta "Rizolex-T" fungizida komertziala % 50eko hauts bustigarria (toklofos-metilo % 20 + tiramo % 30; KZ-Kafr El Zayat Pesticides and Chemicals Company, Kafr El Zayat, Gharbia gobernazioa, Egipto) kontrol positibo gisa. “Rizolex-T” fungizida komertziala in vitro bost kontzentraziotan probatu zen (2, 4, 6, 8 eta 10 mg/L).
Lizun zuriaren sintoma tipikoak erakusten zituzten babarrun zurtoin eta leka arrunten laginak (infestazio-tasa: % 10-30) bildu ziren merkataritza-ustiategietatik. Kutsatutako landare-material gehienak espezie/barietateka identifikatu ziren arren (Giza 3 merkataritza-barietate sentikorra), beste batzuk, batez ere tokiko merkatuetatik lortutakoak, espezie ezezagunetakoak ziren. Bildutako kutsatutako materialak lehenik % 0,5eko sodio hipoklorito disoluzioarekin desinfektatu ziren gainazalean 3 minutuz, ondoren hainbat aldiz garbitu ziren ur destilatu esterilarekin eta iragazki-paper esterilarekin lehortu ziren gehiegizko ura kentzeko. Ondoren, kutsatutako organoak erdiko ehunetik zati txikitan moztu ziren (ehun osasuntsuen eta infektatutakoen artean), patata-dextrosa agarrean (PDA) landu eta 25 ± 2 °C-tan inkubatu ziren 12 orduko argi/12 orduko iluntasun ziklo batekin 5 egunez esklerozioen eraketa suspertzeko. Mizelio-puntaren metodoa ere erabili zen kultura misto edo kutsatuetatik onddo-isolatuak arazteko. Purifikatutako onddo-isolatua lehenik bere ezaugarri morfologiko kulturalen arabera identifikatu zen eta gero S. sclerotiorum zela baieztatu zen ezaugarri mikroskopikoen arabera. Azkenik, isolatu purifikatu guztiak Giza 3 babarrun barietate sentikorrean patogenizitatea aztertu ziren Koch-en postulatuak betetzeko.
Gainera, S. sclerotiorum isolatu inbaditzaileena (3. isolatua) barneko transkribatutako espazioratzailearen (ITS) sekuentziazioan oinarrituta baieztatu zen, White et al., 1990; Baturo-Ciesniewska et al., 2017-k deskribatutako moduan. Laburbilduz, isolatuak patata-dextrosa saldan (PDB) landu eta 25 ± 2 °C-tan inkubatu ziren 5-7 egunez. Ondoren, onddoen mizelioa bildu, gaza-oihal batetik iragazi, bi aldiz ur esterilarekin garbitu eta iragazki-paper esterilarekin lehortu zen. DNA genomikoa Quick-DNA™ Fungal/Bacterial Miniprep Kit erabiliz isolatu zen (Kuramae-Izioka, 1997; Atallah et al., 2022, 2024). ITS rDNA eskualdea ITS1/ITS4 primer bikote espezifikoa erabiliz anplifikatu zen (TCCGTAGGTGAACCTGCGG TCCTCCGCTTATTGATATGC; espero zen tamaina: 540 bp) (Baturo-Ciesniewska et al., 2017). PCR produktu purifikatuak sekuentziaziorako bidali ziren (Beijing Aoke Dingsheng Biotechnology Co., Ltd.). ITS rDNA sekuentziak bi norabidetan sekuentziatu ziren Sanger sekuentziazio metodoa erabiliz. Ondoren, bildutako kontsulta-sekuentziak GenBank-eko eta Bioteknologia Informazio Zentro Nazionaleko (NCBI, http://www.ncbi.nlm.nih.gov/gene/) azken datuekin alderatu ziren BLASTn softwarea erabiliz. Kontsulta-sekuentzia NCBI GenBank-eko azken datuetatik berreskuratutako beste 20 S. sclerotiorum andui/isolaturekin alderatu zen (S1 taula osagarria), ClustalW erabiliz Molecular Evolutionary Genetics Analysis Package-n (MEGA-11; 11. bertsioa) (Kumar et al., 2024). Bilakaera-analisia probabilitate maximoaren metodoa eta denboran alderantzikagarria den nukleotidoen ordezkapen-eredu orokorra (Nei eta Kumar, 2000) erabiliz egin zen. Log-likelihood handiena duen zuhaitza erakusten da. Bilaketa heuristikoaren hasierako zuhaitza hautatzen da neighbor-joining (NJ) zuhaitzaren (Kumar et al., 2024) eta parsimonia maximoaren (MP) zuhaitzaren artean log-likelihood handiena duen zuhaitza aukeratuz. NJ zuhaitza denboran alderantzikagarria den eredu orokorra (Nei eta Kumar, 2000) erabiliz kalkulatutako bikoteka distantzia-matrize bat erabiliz eraiki zen.
L-ornitinaren eta "Rizolex-T" bakterizidaren jarduera antibakterianoa in vitro zehaztu zen agar difusio metodoaren bidez. Metodoa: Hartu L-ornitinaren stock disoluzioaren kantitate egokia (500 mg/L) eta nahastu ondo PDA nutriente medioaren 10 ml-rekin, hurrenez hurren 12,5, 25, 50, 75, 100 eta 125 mg/L-ko kontzentrazio finalak dituzten disoluzioak prestatzeko. "Rizolex-T" fungizidaren bost kontzentrazio (2, 4, 6, 8 eta 10 mg/L) eta ur destilatu esterila erabili ziren kontrol gisa. Medioa solidotu ondoren, Sclerotinia sclerotiorum kulturaren mizelio-tapoi fresko bat, 4 mm-ko diametrokoa, Petri plakaren erdira eraman eta 25±2°C-tan landu zen, mizelioak kontrol Petri plaka osoa estali arte, eta ondoren onddoen hazkundea erregistratu zen. Kalkulatu S. sclerotiorum-en hazkunde erradialaren inhibizio ehunekoa 1. ekuazioa erabiliz:
Esperimentua bi aldiz errepikatu zen, sei errepikapen biologiko kontrol/esperimentu talde bakoitzeko eta bost lorontzi (bi landare lorontzi bakoitzeko) errepikapen biologiko bakoitzeko. Erreplika biologiko bakoitza bi aldiz aztertu zen (bi errepikapen tekniko) emaitza esperimentalen zehaztasuna, fidagarritasuna eta erreproduzigarritasuna bermatzeko. Horrez gain, probit erregresio analisia erabili zen inhibizio kontzentrazio erdi-maximoa (IC50) eta IC99 kalkulatzeko (Prentice, 1976).
L-ornitinaren potentziala berotegi-baldintzetan ebaluatzeko, bi esperimentu jarraian egin ziren lorontzietan. Laburbilduz, ontziak buztin-hareazko lur esterilizatuarekin bete ziren (3:1) eta S. sclerotiorum-en kultura fresko batekin txertatu ziren. Lehenik, S. sclerotiorum-en isolatu inbaditzaileena (3. isolatua) landu zen esklerozio bat erditik moztuz, PDA baten gainean aurpegia behera jarriz eta 25 °C-tan iluntasun konstantean (24 ordu) 4 egunez inkubatuz mizelioaren hazkuntza estimulatzeko. Ondoren, 5 mm-ko diametroko lau agar-tapoi hartu ziren ertz nagusitik eta gari eta arroz-zahiaren 100 g nahasketa esterilarekin (1:1, v/v) txertatu ziren eta matraze guztiak 25 ± 2 °C-tan inkubatu ziren 12 orduko argi/12 orduko iluntasun ziklo batean 5 egunez esklerozioen eraketa estimulatzeko. Matraze guztien edukia ondo nahastu zen homogeneotasuna bermatzeko lurra gehitu aurretik. Ondoren, 100 g kolonizatzaile zahi nahasketa gehitu zitzaien pote bakoitzari, patogenoen kontzentrazio konstantea bermatzeko. Txertatutako poteak ureztatu ziren onddoen hazkundea aktibatzeko eta negutegi-baldintzetan jarri ziren 7 egunez.
Giza 3 barietatearen bost hazi erein ziren ondoren lorontzi bakoitzean. L-ornitinarekin eta Rizolex-T fungizidarekin tratatutako lorontzietan, esterilizatutako haziak lehenik bi orduz beratzen jarri ziren bi konposatuen ur-disoluzio batean, 250 mg/L eta 50 mg/L inguruko IC99 kontzentrazioarekin, hurrenez hurren, eta ondoren ordubetez airean lehortu ziren erein aurretik. Bestalde, haziak ur destilatu esterilean beratzen jarri ziren kontrol negatibo gisa. 10 egun igaro ondoren, lehenengo ureztatzea baino lehen, landareak mehetu ziren, bi landare garbi bakarrik utziz lorontzi bakoitzean. Gainera, S. sclerotiorum-ekin infekzioa ziurtatzeko, garapen-fase berean (10 egun) zeuden babarrun landareen zurtoinak moztu ziren bi leku desberdinetan, bisturi esterilizatu bat erabiliz, eta kolonizatzaile zahi-nahasketaren 0,5 g inguru jarri ziren zauri bakoitzean, eta ondoren hezetasun handia mantendu zen inokulatutako landare guztietan infekzioa eta gaixotasunaren garapena suspertzeko. Kontrol-landareak antzera zauritu ziren eta zauri-nahasketa esteril eta kolonizatu gabe kantitate berdina (0,5 g) jarri zen zaurian eta hezetasun handian mantendu zen gaixotasuna garatzeko ingurunea simulatzeko eta tratamendu-taldeen arteko koherentzia bermatzeko.
Tratamendu metodoa: Babarrun landareak L-ornitina ur-disoluzio batekin (250 mg/l) edo Rizolex-T fungizidarekin (50 mg/l) ureztatu ziren lurra ureztatuz, eta ondoren tratamendua hiru aldiz errepikatu zen 10 eguneko tartearekin. Plazeboa hartu zuten kontrol-taldeak 500 ml ur destilatu esterilarekin ureztatu ziren. Tratamendu guztiak negutegi-baldintzetan egin ziren (25 ± 2 °C, % 75 ± 1 hezetasun erlatiboa eta 8 ordu argi/16 ordu iluntasun fotoperiodoa). Loreontzi guztiak bi astean behin ureztatu ziren eta hilero NPK ongarri orekatu batekin (20-20-20, % 3,6 sufre eta TE mikroelementuekin; Zain Seeds, Egipto) tratatu ziren 3-4 g/l-ko kontzentrazioan hosto-ihinztadura bidez, barietate espezifikorako gomendioen eta fabrikatzailearen argibideen arabera. Bestelakorik adierazi ezean, guztiz hedatutako hosto helduak (goitik 2. eta 3. hostoak) erreplika biologiko bakoitzetik bildu ziren tratamenduaren ondorengo 72 ordutan (hpt), homogeneizatu, batu eta -80 °C-tan gorde ziren analisi gehiago egiteko, besteak beste, estres oxidatiboaren adierazleen in situ lokalizazio histokimikoa, lipidoen peroxidazioa, antioxidatzaile entzimatikoak eta ez-entzimatikoak eta geneen adierazpena.
Molde zuriaren infekzioaren intentsitatea astero ebaluatu zen txertoa egin eta 21 egunera (dpi), 1etik 9ra bitarteko eskala bat erabiliz (S2 taula osagarria), Teran et al.-ek (2006) aldatutako Petzoldt eta Dicksonen (1996) eskalan oinarrituta. Laburbilduz, babarrun landareen zurtoinak eta adarrak aztertu ziren txerto puntutik hasita, lesioen progresioa internodoetan eta nodoetan zehar jarraitzeko. Ondoren, txerto puntutik zurtoinaren edo adarraren punturik urrunenera arteko lesioaren distantzia neurtu zen, eta 1etik 9ra bitarteko puntuazioa esleitu zitzaion lesioaren kokapenaren arabera, non (1)-k txerto puntutik gertu infekzio ikusgairik ez zegoela adierazten zuen eta (2-9)-k lesioaren tamaina pixkanaka handitzen zela eta nodoetan/internodoetan zehar progresioa adierazten zuen (S2 taula osagarria). Molde zuriaren infekzioaren intentsitatea ehuneko bihurtu zen 2. formula erabiliz:
Horrez gain, gaixotasunaren progresio-kurbaren azpiko azalera (AUDPC) kalkulatu zen formula hau erabiliz (Shaner eta Finney, 1977), eta formula hori duela gutxi egokitu da babarrun arruntaren usteldura zurirako (Chauhan et al., 2020) 3. ekuazioa erabiliz:
Non Yi = gaixotasunaren larritasuna ti unean, Yi+1 = gaixotasunaren larritasuna hurrengo ti+1 unean, ti = lehen neurketaren ordua (egunetan), ti+1 = hurrengo neurketaren ordua (egunetan), n = denbora-puntu edo behaketa-puntu kopuru osoa. Babarrun landarearen hazkuntza-parametroak, besteak beste, landarearen altuera (cm), landare bakoitzeko adar kopurua eta landare bakoitzeko hosto kopurua, astero erregistratu ziren 21 egunez erreplika biologiko guztietan.
Erreplika biologiko bakoitzean, hosto laginak (goitik aurrerako bigarren eta hirugarren hosto guztiz garatuak) tratamenduaren ondorengo 45. egunean bildu ziren (azken tratamenduaren ondorengo 15 egunetan). Erreplika biologiko bakoitzak bost lorontzi zituen (bi landare lorontzi bakoitzeko). Birrindutako ehunaren 500 mg inguru erabili ziren pigmentu fotosintetikoak (a klorofila, b klorofila eta karotenoideak) ateratzeko, % 80ko azetona erabiliz, 4 °C-tan eta iluntasunean. 24 ordu igaro ondoren, laginak zentrifugatu eta gainnadantea bildu zen a klorofila, b klorofila eta karotenoideen edukia kolorimetrikoki zehazteko, UV-160A espektrofotometro bat (Shimadzu Corporation, Japonia) erabiliz (Lichtenthaler, 1987) metodoaren arabera, hiru uhin-luzera desberdinetan xurgapena neurtuz (A470, A646 eta A663 nm). Azkenik, pigmentu fotosintetikoen edukia kalkulatu zen, Lichtenthaler-ek (1987) deskribatutako 4-6 formula hauek erabiliz.
Tratamenduaren ondorengo 72 orduetan (hpt), hostoak (goitik aurrerako bigarren eta hirugarren hosto guztiz garatuak) bildu ziren erreplika biologiko bakoitzetik hidrogeno peroxidoaren (H2O2) eta superoxido anioiaren (O2•−) in situ lokalizazio histokimikorako. Erreplika biologiko bakoitzak bost lorontzi zituen (bi landare lorontzi bakoitzeko). Erreplika biologiko bakoitza bikoiztuta aztertu zen (bi erreplika tekniko) metodoaren zehaztasuna, fidagarritasuna eta erreproduzigarritasuna bermatzeko. H2O2 eta O2•− % 0,1eko 3,3′-diaminobentzidina (DAB; Sigma-Aldrich, Darmstadt, Alemania) edo nitroblue tetrazolium (NBT; Sigma-Aldrich, Darmstadt, Alemania) erabiliz zehaztu ziren, hurrenez hurren, Romero-Puertas et al. (2004) eta Adam et al. (1989) egileek deskribatutako metodoak jarraituz, aldaketa txiki batzuekin. H2O2-ren in situ lokalizazio histokimikorako, liburuxkak % 0,1 DAB-rekin hutsean infiltratu ziren 10 mM Tris bufferrean (pH 7,8) eta ondoren giro-tenperaturan argitan inkubatu ziren 60 minutuz. Liburuxkak % 0,15 (v/v) TCA-rekin zuritu ziren 4:1 (v/v) etanol:kloroformoan (Al-Gomhoria Pharmaceuticals and Medical Supplies, Kairo, Egipto) eta ondoren argitan jarri ziren ilundu arte. Era berean, balbulak 10 mM potasio fosfato bufferrean (pH 7,8) hutsean infiltratu ziren, % 0,1 w/v HBT zuela, O2•−-ren in situ lokalizazio histokimikorako. Liburuxkak 20 minutuz inkubatu ziren giro-tenperaturan argitan, ondoren goian bezala zuritu ziren, eta gero urdin ilun/more orbanak agertu arte argiztatu ziren. Emaitza kolore marroiaren (H2O2 adierazle gisa) edo urdin-bioleta (O2•− adierazle gisa) intentsitatea ImageJ irudiak prozesatzeko paketearen Fiji bertsioa erabiliz ebaluatu zen (http://fiji.sc; 2024ko martxoaren 7an kontsultatua).
Malondialdehidoa (MDA; lipidoen peroxidazioaren markatzaile gisa) Du eta Bramlage-ren (1992) metodoaren arabera zehaztu zen, aldaketa txiki batzuekin. Erreplika biologiko bakoitzeko hostoak (goitik aurrerako bigarren eta hirugarren hosto guztiz garatuak) tratamenduaren ondorengo 72 orduetan bildu ziren (hpt). Erreplika biologiko bakoitzak bost lorontzi zituen (bi landare lorontzi bakoitzeko). Erreplika biologiko bakoitza bikoiztuta aztertu zen (bi erreplika tekniko) metodoaren zehaztasuna, fidagarritasuna eta erreproduzigarritasuna bermatzeko. Laburbilduz, 0,5 g hosto-ehun xehatu erabili ziren MDA erauzketarako % 20ko azido trikloroazetikoarekin (TCA; MilliporeSigma, Burlington, MA, AEB), % 0,01eko butil hidroxitoluenoa (BHT; Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, AEB) duena. Gainnadanteko MDA edukia kolorimetrikoki zehaztu zen, UV-160A espektrofotometro bat erabiliz (Shimadzu Corporation, Japonia) 532 eta 600 nm-tan xurgapena neurtuz, eta ondoren nmol g−1 FW gisa adierazi zen.
Antioxidatzaile ez-entzimatikoak eta entzimatikoak ebaluatzeko, hostoak (goitik aurrerako bigarren eta hirugarren hosto guztiz garatuak) erreplika biologiko bakoitzetik bildu ziren tratamenduaren ondorengo 72 ordutan (hpt). Erreplika biologiko bakoitzak bost lorontzi zituen (bi landare lorontzi bakoitzeko). Lagin biologiko bakoitza bikoiztuta aztertu zen (bi lagin tekniko). Bi hosto nitrogeno likidoarekin eho eta zuzenean erabili ziren antioxidatzaile entzimatikoak eta ez-entzimatikoak, aminoazido totalak, prolina edukia, geneen adierazpena eta oxalatoaren kuantifikazioa zehazteko.
Fenoliko disolbagarri totalak Folin-Ciocalteu erreaktiboa (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, AEB) erabiliz zehaztu ziren, Kahkonen et al.-ek (1999) deskribatutako metodoaren aldaketa txikiekin. Laburbilduz, gutxi gorabehera 0,1 g hosto-ehun homogeneizatu erauzi ziren 20 ml % 80ko metanolarekin iluntasunean 24 orduz, eta gainnadantea zentrifugatu ondoren bildu zen. Lagin-estraktuaren 0,1 ml 0,5 ml Folin-Ciocalteu erreaktiboarekin (% 10) nahastu ziren, 30 segundoz astindu eta 5 minutuz iluntasunean utzi ziren. Ondoren, 0,5 ml % 20ko sodio karbonato disoluzio (Na2CO3; Al-Gomhoria Pharmaceuticals and Medical Supplies Company, Kairo, Egipto) gehitu zitzaizkion hodi bakoitzari, ondo nahastu eta giro-tenperaturan inkubatu ziren iluntasunean ordubetez. Inkubazioaren ondoren, erreakzio-nahastearen xurgapena 765 nm-tan neurtu zen UV-160A espektrofotometro bat erabiliz (Shimadzu Corporation, Japonia). Lagin-estraktuetan dauden fenol disolbagarri guztien kontzentrazioa azido galikoaren kalibrazio-kurba bat erabiliz zehaztu zen (Fisher Scientific, Hampton, NH, AEB) eta pisu freskoaren gramoko azido galikoaren baliokide diren miligramo gisa adierazi zen (mg GAE g-1 pisu freskoa).
Flavonoide disolbagarrien eduki osoa Djeridane et al.-en (2006) metodoaren arabera zehaztu zen, aldaketa txiki batzuekin. Laburbilduz, aipatutako metanol-estraktuaren 0,3 ml % 5eko aluminio kloruro disoluzioarekin (AlCl3; Fisher Scientific, Hampton, NH, AEB) nahastu zen, indarrez nahastu eta gero giro-tenperaturan 5 minutuz inkubatu zen, ondoren % 10eko potasio azetato disoluzioarekin 0,3 ml gehitu zen (Al-Gomhoria Pharmaceuticals and Medical Supplies, Kairo, Egipto), ondo nahastu eta giro-tenperaturan 30 minutuz iluntasunean inkubatu zen. Inkubazioaren ondoren, erreakzio-nahastearen xurgapena 430 nm-tan neurtu zen UV-160A espektrofotometro bat erabiliz (Shimadzu Corporation, Japonia). Lagin-estraktuetan dauden flavonoide disolbagarri guztien kontzentrazioa rutina kalibrazio-kurba bat erabiliz zehaztu zen (TCI America, Portland, OR, AEB) eta gero pisu freskoaren gramoko rutina baliokideko miligramo gisa adierazi zen (mg RE g-1 pisu freskoa).
Babarrun hostoen aminoazido libreen edukia ninhidrina erreaktibo aldatu bat erabiliz zehaztu zen (Thermo Scientific Chemicals, Waltham, MA, AEB), Yokoyama eta Hiramatsu-k (2003) proposatutako eta Sun et al.-ek (2006) aldatutako metodoan oinarrituta. Laburbilduz, 0,1 g ehun xehatu pH 5,4ko bufferrean erauzi ziren, eta gainnadantearen 200 μL 200 μL ninhidrinarekin (% 2) eta 200 μL piridinarekin (% 10; Spectrum Chemical, New Brunswick, NJ, AEB) erreakzionatu ziren, ur irakinetan 30 minutuz inkubatu ziren, ondoren hoztu eta 580 nm-tan neurtu ziren UV-160A espektrofotometro bat erabiliz (Shimadzu Corporation, Japonia). Bestalde, prolina Bates metodoaren bidez zehaztu zen (Bates et al., 1973). Prolina % 3ko azido sulfosalizilikoarekin erauzi zen (Thermo Scientific Chemicals, Waltham, MA, AEB) eta zentrifugatu ondoren, gainnadantearen 0,5 ml 1 ml azido azetiko glazialarekin (Fisher Scientific, Hampton, NH, AEB) eta ninhidrina erreaktiboarekin nahastu zen, 90 °C-tan inkubatu zen 45 minutuz, hoztu eta 520 nm-tan neurtu zen goian aipatutako espektrofotometro bera erabiliz. Hosto-estraktuetako aminoazido libre totalak eta prolina glizina eta prolina kalibrazio-kurbak erabiliz zehaztu ziren (Sigma-Aldrich, St Louis, MO, AEB), hurrenez hurren, eta mg/g pisu fresko gisa adierazi ziren.
Antioxidatzaileen entzima-jarduera zehazteko, gutxi gorabehera 500 mg ehun homogeneizatu erauzi ziren 3 ml 50 mM Tris bufferrean (pH 7,8), 1 mM EDTA-Na2 (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, AEB) eta % 7,5 polibinilpirrolidona (PVP; Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, AEB) zituena, 10.000 × g-tan zentrifugatu zen 20 minutuz hozkailuan (4 °C), eta gainnadantea (entzima-estraktu gordina) bildu zen (El-Nagar et al., 2023; Osman et al., 2023). Katalasa (CAT) 2 ml 0,1 M sodio fosfato bufferraren (pH 6,5; Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, AEB) eta 100 μl 269 mM H2O2 disoluzioaren artean erreakzionatu zen bere jarduera entzimatikoa zehazteko, Aebi-ren (1984) metodoaren arabera, aldaketa txiki batzuekin (El-Nagar et al., 2023; Osman et al., 2023). Guaiakol-menpeko peroxidasaren (POX) jarduera entzimatikoa Harrach et al.-en (2009) metodoa erabiliz zehaztu zen. (2008) aldaketa txikiekin (El-Nagar et al., 2023; Osman et al., 2023) eta polifenol oxidasaren (PPO) jarduera entzimatikoa zehaztu zen 2,2 ml 100 mM sodio fosfato bufferraren (pH 6,0), 100 μl guaiakolaren (TCI chemicals, Portland, OR, AEB) eta 100 μl 12 mM H2O2-ren erreakzioaren ondoren. Metodoa apur bat aldatu zen (El-Nagar et al., 2023; Osman et al., 2023) metodotik. Saiakuntza 3 ml katekol disoluzioren (Thermo Scientific Chemicals, Waltham, MA, AEB) (0,01 M) erreakzioaren ondoren egin zen, 0,1 M fosfato bufferrean (pH 6,0) prestatu berrian. CAT jarduera H2O2-ren deskonposizioa 240 nm-tan monitorizatuz neurtu zen (A240), POX jarduera 436 nm-tan xurgapenaren igoera monitorizatuz neurtu zen (A436), eta PPO jarduera UV-160A espektrofotometro bat (Shimadzu, Japonia) erabiliz 495 nm-tan (A495) xurgapen-gorabeherak 30 segundoro 3 minutuz erregistratuz neurtu zen.
Denbora errealeko RT-PCR erabili zen hiru antioxidatzailerekin lotutako geneen transkripzio-mailak detektatzeko, besteak beste, peroxisoma-katalasa (PvCAT1; GenBank Accession No. KF033307.1), superoxido dismutasa (PvSOD; GenBank Accession No. XM_068639556.1) eta glutation erreduktasa (PvGR; GenBank Accession No. KY195009.1), babarrun-hostoetan (goitik aurrerako bigarren eta hirugarren hosto guztiz garatuetan), azken tratamendua egin eta 72 ordura. Laburbilduz, RNA isolatu zen Simply P Total RNA Extraction Kit (Cat. No. BSC52S1; BioFlux, Biori Technology, Txina) erabiliz, fabrikatzailearen protokoloaren arabera. Ondoren, cDNA sintetizatu zen TOP script™ cDNA Synthesis Kit erabiliz, fabrikatzailearen argibideen arabera. Goiko hiru geneen primer-sekuentziak S3 taula osagarrian zerrendatzen dira. PvActin-3 (GenBank-eko sarbide-zenbakia: XM_068616709.1) erabili zen etxeko gene gisa eta geneen adierazpen erlatiboa 2-ΔΔCT metodoa erabiliz kalkulatu zen (Livak eta Schmittgen, 2001). Aktinaren egonkortasuna frogatu zen estres biotikoaren pean (lekadun arrunten eta Colletotrichum lindemuthianum antraknosi onddoaren arteko elkarrekintza bateraezina) eta estres abiotikoaren pean (lehortea, gazitasuna, tenperatura baxua) (Borges et al., 2012).
Hasieran, S. sclerotiorum-eko oxaloazetato azetilhidrolasa (OAH) proteinen genoma osoko in silico analisi bat egin genuen proteina-proteina BLAST tresna (BLASTp 2.15.0+) erabiliz (Altschul et al., 1997, 2005). Laburbilduz, Aspergillus fijiensis CBS 313.89-tik (AfOAH; taxide: 1191702; GenBank sarbide zenbakia XP_040799428.1; 342 aminoazido) eta Penicillium lagena-tik (PlOAH; taxide: 94218; GenBank sarbide zenbakia XP_056833920.1; 316 aminoazido) lortutako OAH erabili genituen kontsulta-sekuentzia gisa S. sclerotiorum-eko proteina homologoa (taxide: 5180) mapatzeko. BLASTp azterketa Bioteknologia Informaziorako Zentro Nazionalaren (NCBI) webguneko GenBank-en eskuragarri dauden S. sclerotiorum genomaren datu berrienekin egin zen: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/gene/.
Horrez gain, S. sclerotiorum-etik aurreikusitako OAH genea (SsOAH) eta A. fijiensis CBS 313.89-tik eta P. lagena-tik lortutako PlOAH-ren eboluzio-analisia eta zuhaitz filogenetikoa ondorioztatu ziren MEGA11-en gehienezko probabilitate-metodoa (Tamura et al., 2021) eta JTT matrizean oinarritutako eredua (Jones et al., 1992) erabiliz. Zuhaitz filogenetikoa S. sclerotiorum-etik aurreikusitako OAH gene guztien (SsOAH) proteina-sekuentzien lerrokatze anizkoitzaren analisiarekin eta kontsulta-sekuentziarekin konbinatu zen, Murrizketen Oinarritutako Lerrokatze Tresna (COBALT; https://www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/cobalt/re_cobalt.cgi) erabiliz (Papadopoulos eta Agarwala, 2007). Horrez gain, S. sclerotiorum-eko SsOAH-ren aminoazido-sekuentziarik onenak kontsulta-sekuentziekin (AfOAH eta PlOAH) (Larkin et al., 2007) lerrokatu ziren ClustalW erabiliz (http://www.genome.jp/tools-bin/clustalw), eta lerrokadurako eskualde kontserbatuak ESPript tresna erabiliz bistaratu ziren (3.0 bertsioa; https://espript.ibcp.fr/ESPript/ESPript/index.php).
Gainera, S. sclerotiorum SsOAH-ren aurreikusitako domeinu funtzional adierazgarriak eta gune kontserbatuak modu interaktiboan sailkatu ziren familia desberdinetan InterPro tresna erabiliz (https://www.ebi.ac.uk/interpro/) (Blum et al., 2021). Azkenik, aurreikusitako S. sclerotiorum SsOAH-ren hiru dimentsioko (3D) egitura-modelizazioa egin zen Protein Homology/Analogy Recognition Engine (Phyre2 zerbitzariaren 2.0 bertsioa; http://www.sbg.bio.ic.ac.uk/~phyre2/html/page.cgi?id=index) (Kelley et al., 2015) eta SWISS-MODEL zerbitzaria erabiliz balioztatu zen (https://swissmodel.expasy.org/) (Biasini et al., 2014). Aurreikusitako hiru dimentsioko egiturak (PDB formatua) modu interaktiboan bistaratu ziren UCSF-Chimera paketea erabiliz (1.15 bertsioa; https://www.cgl.ucsf.edu/chimera/) (Pettersen et al., 2004).
PCR fluoreszente kuantitatiboa denbora errealean erabili zen oxaloazetato azetilhidrolasaren (SsOAH; GenBank sarbide zenbakia: XM_001590428.1) transkripzio maila zehazteko Sclerotinia sclerotiorum-en mizelioetan. Laburbilduz, S. sclerotiorum PDB zuen matraze batean txertatu zen eta astintzen ari zen inkubagailu batean jarri zen (modeloa: I2400, New Brunswick Scientific Co., Edison, NJ, AEB) 25 ± 2 °C-tan 24 orduz 150 rpm-tan eta etengabeko iluntasunean (24 ordu) mizelioaren hazkuntza estimulatzeko. Ondoren, zelulak L-ornitinarekin eta Rizolex-T fungizidarekin tratatu ziren IC50 kontzentrazio finalean (gutxi gorabehera 40 eta 3,2 mg/L, hurrenez hurren) eta ondoren beste 24 orduz landu ziren baldintza berdinetan. Inkubazioaren ondoren, kulturak 2500 rpm-tan zentrifugatu ziren 5 minutuz eta gainnatzailea (onddoen mizelioa) bildu zen geneen espresioaren analisia egiteko. Era berean, onddoen mizelioa bildu zen infekzioaren ondorengo 0, 24, 48, 72, 96 eta 120 ordutan, ehun infektatuen gainazalean lizun zuria eta kotoizko mizelioa sortu zuten infektatutako landareetatik. RNA erauzi zen onddoen mizeliotik eta ondoren cDNA sintetizatu zen goian deskribatutako moduan. SsOAH-ren primer sekuentziak S3 taula osagarrian zerrendatzen dira. SsActin (GenBank sarbide zenbakia: XM_001589919.1) erabili zen etxeko gene gisa, eta geneen espresio erlatiboa 2-ΔΔCT metodoa erabiliz kalkulatu zen (Livak eta Schmittgen, 2001).
Azido oxalikoa patata-dextrosa saldan (PDB) eta Sclerotinia sclerotiorum onddo patogenoa duten landare-laginetan zehaztu zen Xu eta Zhang-en (2000) metodoaren arabera, aldaketa txiki batzuekin. Laburbilduz, S. sclerotiorum isolatuak PDB zuten matrazeetan txertatu ziren eta ondoren astinaldi bidezko inkubagailu batean (I2400 modeloa, New Brunswick Scientific Co., Edison, NJ, AEB) landu ziren 150 rpm-tan 25 ± 2 °C-tan 3-5 egunez iluntasun konstantean (24 h) mizelioaren hazkuntza estimulatzeko. Inkubazioaren ondoren, onddoen kultura lehenik Whatman #1 iragazki-paperaren bidez iragazi zen eta gero 2500 rpm-tan zentrifugatu zen 5 minutuz hondar-mizelioa kentzeko. Gainnatzailea bildu eta 4 °C-tan gorde zen oxalatoaren determinazio kuantitatibo gehiago egiteko. Landare-laginak prestatzeko, gutxi gorabehera 0,1 g landare-ehun zati hiru aldiz erauzi ziren ur destilatuarekin (2 ml aldi bakoitzean). Ondoren, laginak 2500 rpm-tan zentrifugatu ziren 5 minutuz, gainnadantea Whatman 1 zenbakiko iragazki-paperaren bidez iragazi zen lehorrean eta analisi gehiago egiteko bildu zen.
Azido oxalikoaren analisi kuantitatiborako, erreakzio-nahasketa beirazko tapoidun hodi batean prestatu zen, hurrenkera honetan: 0,2 ml lagin (edo PDB kultura-iragazkia edo azido oxalikoaren disoluzio estandarra), 0,11 ml bromofenol urdin (BPB, 1 mM; Fisher Chemical, Pittsburgh, PA, AEB), 0,198 ml 1 M azido sulfuriko (H2SO4; Al-Gomhoria Pharmaceuticals and Medical Supplies, Kairo, Egipto) eta 0,176 ml 100 mM potasio dikromato (K2Cr2O7; TCI chemicals, Portland, OR, AEB), eta ondoren, disoluzioa 4,8 ml-ra diluitu zen ur destilatuarekin, indarrez nahastu eta berehala 60 °C-ko ur-bainu batean jarri zen. 10 minutu igaro ondoren, erreakzioa gelditu zen 0,5 ml sodio hidroxido disoluzio (NaOH; 0,75 M) gehituz. Erreakzio-nahastearen xurgapena (A600) 600 nm-tan neurtu zen UV-160 espektrofotometro bat erabiliz (Shimadzu Corporation, Japonia). PDB eta ur destilatua erabili ziren kontrol gisa kultura-iragazkien eta landare-laginen kuantifikaziorako, hurrenez hurren. Kultura-iragazkietan azido oxalikoaren kontzentrazioak, PDB medioko mililitroko azido oxaliko mikrogramo gisa adierazita (μg.mL−1), eta hosto-estraktuetan, pisu freskoko gramoko azido oxaliko mikrogramo gisa adierazita (μg.g−1 FW), azido oxalikoaren kalibrazio-kurba bat erabiliz zehaztu ziren (Thermo Fisher Scientific Chemicals, Waltham, MA, AEB).
Ikerketa osoan zehar, esperimentu guztiak diseinu guztiz ausazko batean (CRD) diseinatu ziren, tratamendu bakoitzeko sei errepikapen biologikorekin eta errepikapen biologiko bakoitzeko bost lorontzirekin (bi landare lorontzi bakoitzeko), bestelakorik adierazi ezean. Erreplika biologikoak bikoiztuta aztertu ziren (bi errepikapen tekniko). Erreplika teknikoak esperimentu beraren erreproduzigarritasuna egiaztatzeko erabili ziren, baina ez ziren analisi estatistikoan erabili errepikapen faltsuak saihesteko. Datuak estatistikoki aztertu ziren bariantzaren analisia (ANOVA) erabiliz, eta ondoren Tukey-Kramer diferentzia esanguratsuen (HSD) testa (p ≤ 0,05). In vitro esperimentuetarako, IC50 eta IC99 balioak probit eredua erabiliz kalkulatu ziren eta % 95eko konfiantza-tarteak kalkulatu ziren.
Guztira lau isolatu bildu ziren Egiptoko El Ghabiya gobernazioko soja-soro desberdinetatik. PDA medioan, isolatu guztiek krema-zuri koloreko mizelioa sortu zuten, azkar kotoi-zuri bihurtu zena (1A irudia) eta gero beix edo marroi esklerozio fasean. Esklerozioak normalean trinkoak, beltzak, esferikoak edo irregularrak dira, 5,2 eta 7,7 mm arteko luzera eta 3,4 eta 5,3 mm arteko diametroa (1B irudia). Lau isolatuk esklerozio-eredu marjinala garatu zuten hazkuntza-medioaren ertzean 25 ± 2 °C-tan 10-12 eguneko inkubazioaren ondoren (1A irudia), plaka bakoitzeko esklerozio kopurua nabarmen desberdina zen haien artean (P < 0,001), 3. isolatuak izanik esklerozio kopuru handiena (32,33 ± 1,53 esklerozio plaka bakoitzeko; 1C irudia). Era berean, 3. isolatuak beste isolatuek baino azido oxaliko gehiago sortu zuen PDBn (3,33 ± 0,49 μg.mL−1; 1D irudia). 3. isolatuak Sclerotinia sclerotiorum onddo fitopatogenoaren ezaugarri morfologiko eta mikroskopiko tipikoak erakutsi zituen. Adibidez, PDAn, 3. isolatuaren koloniak azkar hazi ziren, zuri krematsuak ziren (1A irudia), beix alderantziz edo izokin hori-marroi argiak, eta 6-7 egun behar izan zituzten 25 ± 2 °C-tan 9 cm-ko diametroko plaka baten gainazala guztiz estaltzeko. Goiko ezaugarri morfologiko eta mikroskopikoetan oinarrituta, 3. isolatua Sclerotinia sclerotiorum gisa identifikatu zen.
1. irudia. Lekale arrunten laboreetatik datozen S. sclerotiorum isolatuen ezaugarriak eta patogenizitatea. (A) Lau S. sclerotiorum isolaturen mizelio-hazkundea PDA medioan, (B) lau S. sclerotiorum isolaturen esklerozioak, (C) esklerozio kopurua (plaka bakoitzeko), (D) azido oxalikoaren jariapena PDB medioan (μg.mL−1), eta (E) lau S. sclerotiorum isolaturen gaixotasunaren larritasuna (%) Giza 3 lekale komertzial sentikorrean, negutegi-baldintzetan. Balioek bost errepikapen biologikoen batez bestekoa ± SD adierazten dute (n = 5). Letra desberdinek tratamenduen arteko desberdintasun estatistikoki esanguratsuak adierazten dituzte (p < 0,05). (F–H) Lizun zuriaren sintoma tipikoak lur gaineko zurtoinetan eta silikoetan agertu ziren, hurrenez hurren, 3. isolatuarekin txertatu eta 10 egunera (dpi). (I) S. sclerotiorum isolatuaren 3. zenbakiko barne transkribatutako tarteatzailearen (ITS) eskualdearen eboluzio-analisia gehieneko probabilitate-metodoa erabiliz egin zen eta National Center for Biotechnology Information (NCBI) datu-basetik (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/) lortutako 20 erreferentzia-isolatu/anduirekin alderatu zen. Multzokatze-lerroen gaineko zenbakiek eskualdearen estaldura (%) adierazten dute, eta multzokatze-lerroen azpiko zenbakiek adarren luzera.
Gainera, patogenizitatea berresteko, lortutako lau S. sclerotiorum isolatu erabili ziren Giza 3 babarrun barietate komertzial sentikorra inokulatzeko negutegi-baldintzetan, eta hori bat dator Koch-en postulatuekin (1E irudia). Lortutako onddo-isolatu guztiak patogenoak ziren eta babarrun berdea (Giza 3 barietatea) infektatu zezaketen arren, lizun zuriaren sintoma tipikoak eraginez lur gaineko atal guztietan (1F irudia), batez ere zurtoinetan (1G irudia) eta leketan (1H irudia) inokulazioaren ondorengo 10 egunetan (dpi), 3. isolatua izan zen isolatu erasokorrena bi esperimentu independenteetan. 3. isolatuak izan zuen gaixotasunaren larritasun handiena (%) babarrun landareetan (24,0 ± 4,0, 58,0 ± 2,0 eta 76,7 ± 3,1 infekzioaren ondorengo 7, 14 eta 21 egunetan, hurrenez hurren; 1F irudia).
S. sclerotiorum isolatu inbaditzaileenaren identifikazioa #3 barne transkribatutako espazioratzailearen (ITS) sekuentziazioan oinarrituta berretsi zen (1I irudia). #3 isolatuaren eta 20 erreferentzia isolatu/anduien arteko analisi filogenetikoak antzekotasun handia (% 99 baino gehiago) erakutsi zuen bien artean. Aipatzekoa da S. sclerotiorum isolatu #3ak (533 bp) antzekotasun handia duela ilar lehorreko hazietatik isolatutako LPM36 S. sclerotiorum isolatu amerikarrarekin (GenBank-en MK896659.1 sarbide zenbakia; 540 bp) eta YKY211 S. sclerotiorum isolatu txinatarrarekin (GenBank-en OR206374.1 sarbide zenbakia; 548 bp), zeinak Matthiola incana zurtoinaren usteldura eragiten duen, eta horiek guztiak dendrogramaren goialdean bereizita multzokatuta daude (1I irudia). Sekuentzia berria NCBI datu-basean sartu da eta “Sclerotinia sclerotiorum – isolate YN-25” izena jarri zaio (GenBank-en PV202792 sarbide-zenbakia). Ikus daiteke 3. isolatua dela isolaturik inbaditzaileena; beraz, isolatu hau aukeratu da ondorengo esperimentu guztietan aztertzeko.
L-ornitina diaminaren (Sigma-Aldrich, Darmstadt, Alemania) jarduera antibakterianoa in vitro ikertu zen, kontzentrazio desberdinetan (12,5, 25, 50, 75, 100 eta 125 mg/L) S. sclerotiorum isolatuaren 3. aurka. Aipagarria da L-ornitinak efektu antibakterianoa izan zuela eta pixkanaka S. sclerotiorum hifen hazkunde erradiala inhibitzen zuela dosiaren araberako moduan (2A, B irudia). Probatu zen kontzentraziorik altuenean (125 mg/L), L-ornitinak erakutsi zuen mizelioaren hazkundearen inhibizio-tasa altuena (% 99,62 ± 0,27; 2B irudia), eta hori Rizolex-T fungizida komertzialaren baliokidea izan zen (inhibizio-tasa % 99,45 ± 0,39; 2C irudia) probatu zen kontzentraziorik altuenean (10 mg/L), antzeko eraginkortasuna adieraziz.
2. irudia. L-ornitinaren in vitro jarduera antibakterianoa Sclerotinia sclerotiorum-en aurka. (A) L-ornitinaren kontzentrazio desberdinen jarduera antibakterianoaren konparaketa S. sclerotiorum-en aurka Rizolex-T (10 mg/L) fungizida komertziala erabiliz. (B, C) S. sclerotiorum-en mizelioaren hazkuntzaren inhibizio-tasa (%) L-ornitina (12,5, 25, 50, 75, 100 eta 125 mg/L) edo Rizolex-T (2, 4, 6, 8 eta 10 mg/L) kontzentrazio desberdinekin tratatu ondoren, hurrenez hurren. Balioek bost errepikapen biologikoren batez bestekoa ± SD adierazten dute (n = 5). Letra desberdinek tratamenduen arteko desberdintasun estatistikoak adierazten dituzte (p < 0,05). (D, E) L-ornitinaren eta Rizolex-T fungizida komertzialaren probit ereduaren erregresio-analisia, hurrenez hurren. Probit ereduaren erregresio-lerroa lerro urdin jarraitu gisa erakusten da, eta konfiantza-tartea (% 95) lerro gorri eten gisa.
Horrez gain, probit erregresio-analisia egin zen eta dagokien grafikoak 1. taulan eta 2D eta E irudietan ageri dira. Laburbilduz, L-ornitinaren malda-balio onargarriak (y = 2,92x − 4,67) eta lotutako estatistika esanguratsuek (Cox & Snell R2 = 0,3709, Nagelkerke R2 = 0,4998 eta p < 0,0001; 2D irudia) S. sclerotiorum-en aurkako onddoen aurkako jarduera hobetua adierazi zuten Rizolex-T onddo-zida komertzialarekin alderatuta (y = 1,96x − 0,99, Cox & Snell R2 = 0,1242, Nagelkerke R2 = 0,1708 eta p < 0,0001) (1. taula).
1. taula. L-ornitinaren eta “Rizolex-T” fungizida komertzialaren erdi-gehieneko inhibitzaile-kontzentrazioaren (IC50) eta IC99 (mg/l) balioak S. sclerotiorum-en aurka.
Oro har, L-ornitinak (250 mg/L) nabarmen murriztu zuen lizun zuriaren garapena eta larritasuna tratatutako babarrun landare arruntetan, tratatu gabeko S. sclerotiorum-ekin infektatutako landareekin alderatuta (kontrola; 3A irudia). Laburbilduz, tratatu gabeko kontrol landare infektatuen gaixotasunaren larritasuna pixkanaka handitu bazen ere (% 52,67 ± 1,53, 83,21 ± 2,61 eta % 92,33 ± 3,06), L-ornitinak nabarmen murriztu zuen gaixotasunaren larritasuna (%) esperimentu osoan zehar (% 8,97 ± 0,15, 18,00 ± 1,00 eta 26,36 ± 3,07) tratamenduaren ondorengo 7, 14 eta 21 egunetan (dpt), hurrenez hurren (3A irudia). Era berean, S. sclerotiorum-ekin infektatutako babarrun landareak 250 mg/L L-ornitinarekin tratatu zirenean, gaixotasunaren progresio-kurbaren azpiko azalera (AUDPC) 1274,33 ± 33,13tik tratatu gabeko kontrol-taldean 281,03 ± 7,95era jaitsi zen, hau da, 50 mg/L Rizolex-T fungizidaren kontrol positiboaren balioa baino zertxobait txikiagoa (183,61 ± 7,71; 3B irudia). Joera bera ikusi zen bigarren esperimentuan.
3. irudia. L-ornitinaren aplikazio exogenoaren eragina Sclerotinia sclerotiorum-ek eragindako babarrun arruntaren ustel zuriaren garapenean, negutegi-baldintzetan. (A) Babarrun arruntaren lizun zuriaren gaixotasunaren progresio-kurba 250 mg/L L-ornitinarekin tratatu ondoren. (B) Babarrun arruntaren lizun zuriaren gaixotasunaren progresio-kurbaren azpiko azalera (AUDPC) L-ornitinarekin tratatu ondoren. Balioek bost errepikapen biologikoren batez bestekoa ± SD adierazten dute (n = 5). Letra desberdinek tratamenduen arteko desberdintasun estatistikoki esanguratsuak adierazten dituzte (p < 0,05).
250 mg/L L-ornitina exogenoki aplikatzeak landarearen altuera pixkanaka handitu zuen (4A irudia), landare bakoitzeko adar kopurua (4B irudia) eta landare bakoitzeko hosto kopurua (4C irudia) 42 egun igaro ondoren. Rizolex-T (50 mg/L) onddozida komertzialak aztertutako nutrizio-parametro guztietan eragin handiena izan zuen bitartean, 250 mg/L L-ornitina exogenoki aplikatzeak bigarren eragin handiena izan zuen tratatu gabeko kontrol-taldeekin alderatuta (4A-C irudiak). Bestalde, L-ornitinaren tratamenduak ez zuen eragin nabarmenik izan klorofila a (4D irudia) eta klorofila b (4E irudia) pigmentu fotosintetikoen edukian, baina karotenoideen eduki totala apur bat handitu zuen (0,56 ± 0,03 mg/g pisuan) kontrol negatiboarekin (0,44 ± 0,02 mg/g pisuan) eta kontrol positiboarekin (0,46 ± 0,02 mg/g pisuan; 4F irudia) alderatuta. Oro har, emaitza hauek adierazten dute L-ornitina ez dela fitotoxikoa tratatutako lekaleentzat eta baita haien hazkundea estimulatu ere egin dezakeela.
4. irudia. L-ornitina exogenoaren aplikazioaren eragina Sclerotinia sclerotiorum-ekin infektatutako babarrun hostoen hazkuntza-ezaugarrietan eta pigmentu fotosintetikoetan, negutegi-baldintzetan. (A) Landarearen altuera (cm), (B) Landare bakoitzeko adar kopurua, (C) Landare bakoitzeko hosto kopurua, (D) Klorofila a edukia (mg g-1 fr wt), (E) Klorofila b edukia (mg g-1 fr wt), (F) Karotenoideen edukia guztira (mg g-1 fr wt). Balioak bost errepikapen biologikoren batez bestekoa ± SD dira (n = 5). Letra desberdinek tratamenduen arteko desberdintasun estatistikoki esanguratsuak adierazten dituzte (p < 0,05).
Oxigeno erreaktibo espezieen (ROS; hidrogeno peroxido gisa [H2O2] adierazita) eta erradikal askeen (superoxido anioi gisa [O2•−] adierazita) in situ lokalizazio histokimikoak agerian utzi zuen L-ornitinaren aplikazio exogenoak (250 mg/L) H2O2 (96,05 ± 5,33 nmol.g−1 FW; 5A irudia) eta O2•− (32,69 ± 8,56 nmol.g−1 FW; 5B irudia) metaketa nabarmen murriztu zuela, bai tratatu gabeko landare infektatuen (173,31 ± 12,06 eta 149,35 ± 7,94 nmol.g−1 FW, hurrenez hurren) bai Rizolex-T fungizida komertzialaren 50 mg/L-rekin tratatutako landareen (170,12 ± 9,50 eta 157,00 ± 7,81 nmol.g−1 fr wt, hurrenez hurren) metaketarekin alderatuta, 72 ordutan. H2O2 eta O2•− maila altuak metatu ziren hpt-aren pean (5A, B irudiak). Era berean, TCA oinarritutako malondialdehido (MDA) analisiak erakutsi zuen S. sclerotiorum-ekin infektatutako babarrun landareek MDA maila altuagoak metatu zituztela (113,48 ± 10,02 nmol.g pisu fr) hostoetan (5C irudia). Hala ere, L-ornitina kanpoko aplikazioak nabarmen murriztu zuen lipidoen peroxidazioa, tratatutako landareetan MDA edukiaren jaitsierak erakusten duen bezala (33,08 ± 4,00 nmol.g pisu fr).
5. irudia. L-ornitina exogenoaren aplikazioaren eragina estres oxidatiboaren markatzaile nagusietan eta S. sclerotiorum-ekin infektatutako babarrun hostoetan, infekzioaren ondorengo 72 orduetan, negutegi-baldintzetan. (A) Hidrogeno peroxidoa (H2O2; nmol g−1 FW) 72 hpt-tan, (B) superoxido anioia (O2•−; nmol g−1 FW) 72 hpt-tan, (C) malondialdehidoa (MDA; nmol g−1 FW) 72 hpt-tan, (D) fenol disolbagarri totalak (mg GAE g−1 FW) 72 hpt-tan, (E) flavonoide disolbagarri totalak (mg RE g−1 FW) 72 hpt-tan, (F) aminoazido libre totalak (mg g−1 FW) 72 hpt-tan, eta (G) prolina edukia (mg g−1 FW) 72 hpt-tan. Balioek 5 errepikapen biologikoren batez bestekoa ± desbideratze estandarra (batez bestekoa ± SD) adierazten dute (n = 5). Letra desberdinek tratamenduen arteko desberdintasun estatistikoki esanguratsuak adierazten dituzte (p < 0,05).