Eskerrik asko nature.com bisitatzeagatik. Erabiltzen ari zaren arakatzailearen bertsioak CSS laguntza mugatua du. Esperientzia onena lortzeko, arakatzailearen azken bertsioa erabiltzea gomendatzen dizugu (edo Internet Explorer-en bateragarritasun modua desaktibatzea). Gainera, laguntza jarraitua bermatzeko, gune honek ez ditu estiloak edo JavaScript-ak izango.
Hauts-ekaitzak mehatxu larria dira mundu osoko herrialde askorentzat, nekazaritzan, giza osasunean, garraio-sareetan eta azpiegituretan duten eragin suntsitzaileagatik. Ondorioz, haize-higadura arazo globaltzat hartzen da. Haize-higadura mugatzeko ingurumena errespetatzen duten ikuspegietako bat mikrobioek eragindako karbonato-prezipitazioaren (MICP) erabilera da. Hala ere, urea-degradazioan oinarritutako MICP-aren azpiproduktuak, hala nola amoniakoa, ez dira idealak kantitate handitan ekoizten direnean. Ikerketa honek kaltzio formiato bakterioen bi formulazio aurkezten ditu MICP degradatzeko urea sortu gabe eta haien errendimendua amoniarik sortzen ez duten kaltzio azetato bakterioen bi formulaziorekin alderatzen du. Kontuan hartutako bakterioak Bacillus subtilis eta Bacillus amyloliquefaciens dira. Lehenik eta behin, CaCO3 eraketa kontrolatzen duten faktoreen balio optimizatuak zehaztu ziren. Ondoren, haize-tuneleko probak egin ziren formulazio optimizatuekin tratatutako hareazko dunen laginetan, eta haize-higaduraren erresistentzia, erauzketa-atalasearen abiadura eta harea-bonbardaketaren erresistentzia neurtu ziren. Kaltzio karbonatoaren (CaCO3) alomorfoak mikroskopia optikoa, eskaneatze mikroskopia elektronikoa (SEM) eta X izpien difrakzio analisia erabiliz ebaluatu ziren. Kaltzio formiatoan oinarritutako formulazioek azetatoan oinarritutako formulazioek baino emaitza askoz hobeak eman zituzten kaltzio karbonatoaren eraketari dagokionez. Gainera, B. subtilis-ek kaltzio karbonato gehiago sortu zuen B. amyloliquefaciens-ek baino. SEM mikrografiek argi erakutsi zuten sedimentazioak eragindako bakterio aktibo eta inaktiboen lotura eta inprimaketa kaltzio karbonatoan. Formulazio guztiek nabarmen murriztu zuten haizearen higadura.
Haizearen higadura aspalditik aitortu da eskualde idor eta erdi-idorrei aurre egiten dien arazo nagusitzat, hala nola Estatu Batuetako hego-mendebaldea, Txinako mendebaldea, Sahara Afrikan eta Ekialde Hurbileko zati handi batean1. Klima idor eta hiperidorretako euri gutxik eskualde horietako zati handi bat basamortu, hareazko dunak eta lur landugabe bihurtu ditu. Haizearen higadura jarraituak ingurumen-mehatxuak dakartza azpiegiturentzat, hala nola garraio-sareentzat, nekazaritza-lurretan eta industria-lurretan, eta horrek bizi-baldintza eskasak eta hiri-garapenaren kostu handiak eragiten ditu eskualde horietan2,3,4. Garrantzitsua da, haizearen higadurak ez duela eragiten bakarrik gertatzen den kokapenean, baizik eta osasun- eta ekonomia-arazoak ere sortzen dituela urruneko komunitateetan, haizearen bidez partikulak iturritik urrun dauden eremuetara garraiatzen baititu5,6.
Haizearen higaduraren kontrola arazo globala izaten jarraitzen du. Lurzorua egonkortzeko hainbat metodo erabiltzen dira haizearen higadura kontrolatzeko. Metodo horien artean daude ura aplikatzea7, olio-mulch-ak8, biopolimeroak5, mikrobioek eragindako karbonato-prezipitazioa (MICP)9,10,11,12 eta entzimek eragindako karbonato-prezipitazioa (EICP)1. Lurzorua bustitzea hautsa kentzeko metodo estandarra da eremuan. Hala ere, lurruntze azkarrak metodo hau eraginkortasun mugatukoa bihurtzen du eskualde idor eta erdi-idorretan1. Olio-mulch konposatuen aplikazioak harea-kohesioa eta partikulen arteko marruskadura handitzen ditu. Haien kohesio-propietateak harea-aleak lotzen ditu elkarrekin; hala ere, olio-mulch-ek beste arazo batzuk ere sortzen dituzte; haien kolore ilunak beroaren xurgapena handitzen du eta landareen eta mikroorganismoen heriotza eragiten du. Haien usainak eta lurrunek arnasketa-arazoak sor ditzakete, eta, batez ere, haien kostu handia beste oztopo bat da. Biopolimeroak haizearen higadura arintzeko azkenaldian proposatutako metodo ekologikoetako bat dira; landareetatik, animalietatik eta bakterioetatik ateratzen dira. Xantano goma, guar goma, kitosanoa eta gellan goma dira ingeniaritza-aplikazioetan gehien erabiltzen diren biopolimeroak5. Hala ere, uretan disolbagarriak diren biopolimeroek erresistentzia galdu eta lurzorutik lixibiatu dezakete urarekin kontaktuan jartzen direnean13,14. EICP hautsa kentzeko metodo eraginkorra dela frogatu da hainbat aplikaziotarako, besteak beste, asfaltatu gabeko errepideetan, hondakin-putzuetan eta eraikuntza-guneetan. Emaitzak itxaropentsuak diren arren, zenbait eragozpen potentzial kontuan hartu behar dira, hala nola kostua eta nukleazio-guneen falta (CaCO3 kristalen eraketa eta prezipitazioa bizkortzen duena15,16).
MICP lehen aldiz XIX. mendearen amaieran deskribatu zuten Murray eta Irwinek (1890) eta Steinmannek (1901), itsas mikroorganismoek urearen degradazioari buruzko ikerketan17. MICP prozesu biologiko natural bat da, hainbat jarduera mikrobiano eta prozesu kimiko barne hartzen dituena, non kaltzio karbonatoa prezipitatzen den metabolito mikrobianoetatik datozen karbonato ioien eta inguruneko kaltzio ioien arteko erreakzioaren bidez18,19. Urea degradatzen duen nitrogeno zikloa (urea degradatzen duen MICP) inplikatzen duen MICP da mikrobioek eragindako karbonato prezipitazio mota ohikoena, non bakterioek sortutako ureasak urearen hidrolisia katalizatzen duen20,21,22,23,24,25,26,27 honela:
MICP-an, gatz organikoaren oxidazioaren karbono zikloa barne hartzen duena (urea degradaziorik gabeko MICP mota), bakterio heterotrofoek gatz organikoak erabiltzen dituzte, hala nola azetatoa, laktatoa, zitratoa, sukzinatoa, oxalatoa, malatoa eta glioxilatoa, karbonato mineralak ekoizteko energia iturri gisa28. Kaltzio laktatoa karbono iturri gisa eta kaltzio ioien presentzian, kaltzio karbonatoaren eraketaren erreakzio kimikoa (5) ekuazioan ageri da.
MICP prozesuan, zelula bakterianoek kaltzio karbonatoaren prezipitaziorako bereziki garrantzitsuak diren nukleazio guneak eskaintzen dituzte; zelula bakterianoaren gainazala negatiboki kargatuta dago eta katioi dibalenteen, hala nola kaltzio ioien, adsorbatzaile gisa joka dezake. Kaltzio ioiak zelula bakterianoetan adsorbatzean, karbonato ioien kontzentrazioa nahikoa denean, kaltzio katioiek eta karbonato anioiek erreakzionatzen dute eta kaltzio karbonatoa bakterioaren gainazalean prezipitatzen da29,30. Prozesua honela laburbil daiteke31,32:
Biosortutako kaltzio karbonato kristalak hiru motatan bana daitezke: kaltzita, vaterita eta aragonita. Horien artean, kaltzita eta vaterita dira bakterioek eragindako kaltzio karbonato alomorfo ohikoenak33,34. Kaltzita da termodinamikoki egonkorrena den kaltzio karbonato alomorfoa35. Vaterita metaegonkorra dela jakinarazi den arren, azkenean kaltzita bihurtzen da36,37. Vaterita da kristal horien artean dentsoena. Kristal hexagonala da, eta beste kaltzio karbonato kristalek baino poroak betetzeko gaitasun hobea du, tamaina handiagoa duelako38. Ureaz degradatutako eta ureaz degradatu gabeko MICP-ak vateritaren prezipitazioa eragin dezake13,39,40,41.
MICP-k lurzoru problematikoak eta haize-higaduraren aurrean sentikorrak diren lurzoruak egonkortzeko potentzial itxaropentsua erakutsi badu ere42,43,44,45,46,47,48, urea hidrolisiaren azpiproduktuetako bat amoniakoa da, eta osasun arazo arinak edo larriak sor ditzake esposizio-mailaren arabera49. Bigarren mailako efektu honek teknologia honen erabilera eztabaidagarria bihurtzen du, batez ere eremu handiak tratatu behar direnean, hala nola hautsa kentzeko. Gainera, amoniakoaren usaina jasanezina da prozesua aplikazio-tasa altuetan eta bolumen handietan egiten denean, eta horrek bere aplikagarritasun praktikoa eragin dezake. Azken ikerketek erakutsi duten arren amonio ioiak murriztu daitezkeela estrubita bezalako beste produktu batzuetan bihurtuz, metodo hauek ez dituzte amonio ioiak guztiz kentzen50. Beraz, oraindik ere beharrezkoa da amonio ioirik sortzen ez duten irtenbide alternatiboak aztertzea. MICP-rako urea ez diren degradazio-bideen erabilerak haize-higadura arintzearen testuinguruan gutxi aztertu den irtenbide potentziala eman dezake. Fattahi et al. Urea gabeko MICP degradazioa ikertu zuen kaltzio azetatoa eta Bacillus megaterium41 erabiliz, eta Mohebbi et al.-ek, berriz, kaltzio azetatoa eta Bacillus amyloliquefaciens9 erabili zituzten. Hala ere, haien ikerketa ez zen beste kaltzio iturri eta bakterio heterotrofo batzuekin alderatu, azken finean haizearen higaduraren erresistentzia hobetu zezaketenekin. Halaber, ez dago literaturarik urea gabeko degradazio-bideak urea degradazio-bideekin alderatzen dituenik haizearen higadura arintzean.
Gainera, haizearen higadura eta hautsaren kontrol ikerketa gehienak gainazal lauak dituzten lurzoru laginetan egin dira.1,51,52,53 Hala ere, gainazal lauak ez dira hain ohikoak naturan muinoak eta sakonuneak baino. Horregatik, hareazko dunak dira basamortu eskualdeetako paisaia-elementu ohikoena.
Aipatutako gabeziak gainditzeko, ikerketa honek amonia sortzen ez duten bakterio-agente multzo berri bat aurkeztea izan zuen helburu. Horretarako, urea degradatzen ez duten MICP bideak kontuan hartu genituen. Bi kaltzio-iturriren (kaltzio-formiatoa eta kaltzio-azetatoa) eraginkortasuna ikertu zen. Egileen jakintza onenaren arabera, bi kaltzio-iturri eta bakterioen konbinazio erabiliz karbonato-prezipitazioa (hau da, kaltzio-formiatoa-Bacillus subtilis eta kaltzio-formiatoa-Bacillus amyloliquefaciens) ez da aurreko ikerketetan ikertu. Bakterio hauen aukeraketa kaltzio-formiatoaren eta kaltzio-azetatoaren oxidazioa katalizatzen duten sortzen dituzten entzimetan oinarritu zen, karbonato mikrobianoaren prezipitazioa sortzeko. Ikerketa esperimental sakon bat diseinatu genuen faktore optimoak aurkitzeko, hala nola pHa, bakterio motak eta kaltzio-iturriak eta haien kontzentrazioak, bakterioen eta kaltzio-iturri-soluzioaren arteko erlazioa eta sendatze-denbora. Azkenik, bakterio-agente multzo honen eraginkortasuna ikertu zen haize-higadura kaltzio karbonatoaren prezipitazio bidez murrizteko, haize-tuneleko proba sorta bat eginez hareazko dunetan, haize-higaduraren magnitudea, atalase-haustura-abiadura eta haize-bonbardaketaren erresistentzia zehazteko, eta penetrometro bidezko neurketak eta mikroegitura-azterketak ere egin ziren (adibidez, X izpien difrakzio-analisia (XRD) eta eskaneatze-mikroskopia elektronikoa (SEM)).
Kaltzio karbonatoa ekoizteko kaltzio ioiak eta karbonato ioiak behar dira. Kaltzio ioiak hainbat kaltzio iturritatik lor daitezke, hala nola kaltzio klorurotik, kaltzio hidroxidotik eta esne gaingabetu hautsetik54,55. Karbonato ioiak hainbat metodo mikrobianoren bidez ekoiz daitezke, hala nola urea hidrolisitik eta materia organikoaren oxidazio aerobiko edo anaerobiotik56. Ikerketa honetan, karbonato ioiak formiatoaren eta azetatoaren oxidazio erreakziotik lortu ziren. Horrez gain, formiatoaren eta azetatoaren kaltzio gatzak erabili genituen kaltzio karbonato purua ekoizteko, beraz, CO2 eta H2O bakarrik lortu ziren azpiproduktu gisa. Prozesu honetan, substantzia bakarrak balio du kaltzio iturri eta karbonato iturri gisa, eta ez da amoniakorik sortzen. Ezaugarri hauek oso itxaropentsu bihurtzen dute guk uste genuen kaltzio iturria eta karbonatoa ekoizteko metodoa.
Kaltzio formiatoaren eta kaltzio azetatoaren kaltzio karbonatoa sortzeko erreakzio dagokienak (7)-(14) formuletan ageri dira. (7)-(11) formulek erakusten dute kaltzio formiatoa uretan disolbatzen dela azido formikoa edo formiatoa sortzeko. Beraz, disoluzioa kaltzio eta hidroxido ioi askeen iturria da (8 eta 9 formulak). Azido formikoaren oxidazioaren ondorioz, azido formikoko karbono atomoak karbono dioxido bihurtzen dira (10 formula). Azkenean kaltzio karbonatoa sortzen da (11 eta 12 formulak).
Era berean, kaltzio karbonatoa kaltzio azetatotik sortzen da (13-15 ekuazioak), azido formikoaren ordez azido azetikoa edo azetatoa sortzen dela izan ezik.
Entzimarik gabe, azetatoa eta formiatoa ezin dira oxidatu giro-tenperaturan. FDH-k (formiato deshidrogenasa) eta CoA-k (A koentzima) formiatoaren eta azetatoaren oxidazioa katalizatzen dute karbono dioxidoa sortzeko, hurrenez hurren (16, 17 ekuazioak) 57, 58, 59. Hainbat bakteriok gai dira entzima hauek ekoizteko, eta bakterio heterotrofoak, hain zuzen ere, Bacillus subtilis (PTCC #1204 (Persian Type Culture Collection), NCIMB #13061 (International Collection of Bacteria, Yeast, Phage, Plasmids, Plant Seeds and Plant Cell Tissue Cultures) bezala ere ezaguna) eta Bacillus amyloliquefaciens (PTCC #1732, NCIMB #12077), erabili ziren ikerketa honetan. Bakterio hauek haragi-peptona (5 g/L) eta haragi-estraktua (3 g/L) zituen ingurune batean landu ziren, salda nutritiboa (NBR) (105443 Merck) deiturikoa.
Horrela, lau formulazio prestatu ziren kaltzio karbonatoaren prezipitazioa eragiteko, bi kaltzio iturri eta bi bakterio erabiliz: kaltzio formiatoa eta Bacillus subtilis (FS), kaltzio formiatoa eta Bacillus amyloliquefaciens (FA), kaltzio azetatoa eta Bacillus subtilis (AS), eta kaltzio azetatoa eta Bacillus amyloliquefaciens (AA).
Diseinu esperimentalaren lehen zatian, probak egin ziren kaltzio karbonatoaren ekoizpen maximoa lortzeko konbinazio optimoa zehazteko. Lurzoruko laginek kaltzio karbonatoa zutenez, aurretiazko ebaluazio-proba multzo bat diseinatu zen konbinazio ezberdinek sortutako CaCO3 zehatz-mehatz neurtzeko, eta hazkuntza-ingurunearen eta kaltzio-iturri-soluzioen nahasketak ebaluatu ziren. Goian definitutako kaltzio-iturriaren eta bakterio-soluzioaren konbinazio bakoitzerako (FS, FA, AS eta AA), optimizazio-faktoreak (kaltzio-iturriaren kontzentrazioa, sendatze-denbora, disoluzioaren dentsitate optikoaren (OD) bidez neurtutako bakterio-soluzioaren kontzentrazioa, kaltzio-iturriaren eta bakterio-soluzioaren arteko erlazioa eta pH-a) eratorri eta ondorengo ataletan deskribatzen diren hareazko dunen tratamenduko haize-tunelaren probetan erabili ziren.
Konbinazio bakoitzerako, 150 esperimentu egin ziren CaCO3 prezipitazioaren eragina aztertzeko eta hainbat faktore ebaluatzeko, hots, kaltzio iturriaren kontzentrazioa, sendatze denbora, bakterioen OD balioa, kaltzio iturriaren eta bakterioen disoluzioaren arteko erlazioa eta materia organikoaren oxidazio aerobikoan zeharreko pHa (1. taula). Prozesu optimizaturako pH tartea Bacillus subtilis eta Bacillus amyloliquefaciens-en hazkunde kurbetan oinarrituta hautatu zen, hazkunde azkarragoa lortzeko. Hau xehetasun gehiagorekin azaltzen da Emaitzen atalean.
Laginak optimizazio faserako prestatzeko urrats hauek jarraitu ziren. MICP disoluzioa lehenik hazkuntza-ingurunearen hasierako pHa doituz prestatu zen eta ondoren autoklabean sartu zen 121 °C-tan 15 minutuz. Ondoren, anduia aire-fluxu laminar batean txertatu zen eta astinduzko inkubagailu batean mantendu zen 30 °C-tan eta 180 rpm-tan. Bakterioen OD-ak nahi den maila lortu zuenean, kaltzio-iturri disoluzioarekin nahastu zen nahi den proportzioan (1a irudia). MICP disoluzioa erreakzionatzen eta solidotzen utzi zen astinduzko inkubagailu batean 220 rpm-tan eta 30 °C-tan, helburu-balioa lortu arte. Prezipitatutako CaCO3-a bereizi egin zen 6000 g-tan 5 minutuz zentrifugatu ondoren eta ondoren 40 °C-tan lehortu zen laginak kaltzimetro-probarako prestatzeko (1b irudia). Ondoren, CaCO3-aren prezipitazioa Bernard kaltzimetro bat erabiliz neurtu zen, non CaCO3 hautsak 1.0 N HCl-rekin (ASTM-D4373-02) erreakzionatzen duen CO2 sortzeko, eta gas honen bolumena CaCO3 edukiaren neurria den (1c irudia). CO2-aren bolumena CaCO3 eduki bihurtzeko, kalibrazio-kurba bat sortu zen CaCO3 hauts purua 1 N HCl-rekin garbituz eta asmatutako CO2-aren aurka irudikatuz. Prezipitatutako CaCO3 hautsaren morfologia eta purutasuna SEM irudigintza eta XRD analisia erabiliz ikertu ziren. 1000ko handitze-mikroskopio optiko bat erabili zen bakterioen inguruan kaltzio karbonatoaren eraketa, sortutako kaltzio karbonatoaren fasea eta bakterioen jarduera aztertzeko.
Dejegh arroa Irango Fars probintziako hego-mendebaldean dagoen higadura handiko eskualde ezaguna da, eta ikertzaileek haizeak higatutako lurzoru laginak bildu zituzten bertan. Laginak lurzoruaren gainazaletik hartu ziren ikerketarako. Lurzoruaren laginen adierazle-probek erakutsi zuten lurzorua gaizki sailkatutako lur hareatsua zela, limoarekin, eta SP-SM gisa sailkatu zela Lurzoruaren Sailkapen Sistema Bateratuaren (USC) arabera (2a irudia). XRD analisiak erakutsi zuen Dejegh lurzorua batez ere kaltzitaz eta kuartzoz osatuta zegoela (2b irudia). Horrez gain, EDX analisiak erakutsi zuen Al, K eta Fe bezalako beste elementu batzuk ere proportzio txikiagoetan zeudela.
Laborategiko dunak haize-higaduraren probak egiteko prestatzeko, lurra 170 mm-ko altueratik xehatu zen 10 mm-ko diametroko inbutu batetik gainazal sendo bateraino, 60 mm-ko altuera eta 210 mm-ko diametroko duna tipiko bat lortuz. Naturan, dentsitate txikieneko hareazko dunak prozesu eolikoen bidez sortzen dira. Era berean, goiko prozedura erabiliz prestatutako laginak izan zuen dentsitate erlatibo txikiena, γ = 14,14 kN/m³, gainazal horizontal batean metatutako hareazko kono bat osatuz, gutxi gorabehera 29,7°-ko atseden-angeluarekin.
Aurreko atalean lortutako MICP soluzio optimoa duna-maldan ihinztatu zen 1, 2 eta 3 lm-2-ko aplikazio-tasetan, eta ondoren laginak inkubagailu batean gorde ziren 30 °C-tan (3. irudia) 9 egunez (hau da, sendatze-denbora optimoa) eta gero haize-tuneleko probak egiteko atera ziren.
Tratamendu bakoitzerako, lau lagin prestatu ziren, bat kaltzio karbonatoaren edukia eta gainazalaren erresistentzia neurtzeko penetrometro bat erabiliz, eta gainerako hiru laginak hiru abiadura ezberdinetan higadura-probetarako erabili ziren. Haize-tuneleko probetan, higaduraren kopurua haize-abiadura desberdinetan zehaztu zen, eta ondoren, tratamendu-lagin bakoitzerako atalase-haustura-abiadura zehaztu zen higadura-kopurua haize-abiaduraren araberako grafiko bat erabiliz. Haize-higadura-probez gain, tratatutako laginak harea-bonbardaketaren menpe jarri ziren (hau da, jauzi-esperimentuak). Horretarako, beste bi lagin prestatu ziren 2 eta 3 L m−2-ko aplikazio-tasetan. Harea-bonbardaketa-probak 15 minutu iraun zuen 120 gm−1-ko fluxuarekin, aurreko ikerketetan hautatutako balioen tartean dagoena60,61,62. Urratzailearen toberaren eta duna-oinarriaren arteko distantzia horizontala 800 mm-koa zen, tunelaren hondotik 100 mm-ra kokatuta. Posizio hau ezarri zen jauzi-harea-partikula ia guztiak dunaren gainean erortzeko.
Haize-tunelaren proba 8 m-ko luzera, 0,4 m-ko zabalera eta 1 m-ko altuera zuen haize-tunel ireki batean egin zen (4a irudia). Haize-tunela altzairu galbanizatuzko xaflez egina dago eta 25 m/s-ko haize-abiadura sor dezake. Horrez gain, maiztasun-bihurgailu bat erabiltzen da haizagailuaren maiztasuna doitzeko eta maiztasuna pixkanaka handitzeko, haize-abiadura helburu lortzeko. 4b irudiak haizeak higatutako hareazko dunen diagrama eskematikoa eta haize-tunelean neurtutako haize-abiaduraren profila erakusten ditu.
Azkenik, ikerketa honetan proposatutako MICP formulazio ez-urealitikoaren emaitzak MICP kontrol-proba urealitikoaren emaitzekin alderatzeko, duna-laginak ere prestatu eta urea, kaltzio kloruroa eta Sporosarcina pasteurii dituen soluzio biologiko batekin tratatu ziren (Sporosarcina pasteurii-k ureasa sortzeko gaitasun handia baitu63). Bakterio-soluzioaren dentsitate optikoa 1,5ekoa zen, eta urea eta kaltzio kloruroaren kontzentrazioak 1 M-koak ziren (aurreko ikerketetan gomendatutako balioetan oinarrituta hautatuak36,64,65). Kultura-ingurunea mantenugai-saldaz (8 g/L) eta ureaz (20 g/L) osatuta zegoen. Bakterio-soluzioa dunaren gainazalean ihinztatu zen eta 24 orduz utzi zen bakterioen atxikimendurako. 24 orduko atxikimenduaren ondoren, zementazio-soluzio bat (kaltzio kloruroa eta urea) ihinztatu zen. MICP kontrol-proba urealitikoari hemendik aurrera UMC deituko zaio. Urealitikoki eta urealitikoki tratatu gabeko lurzoru-laginen kaltzio karbonatoaren edukia Choi et al.-ek proposatutako prozeduraren arabera garbituz lortu zen.66
5. irudiak Bacillus amyloliquefaciens eta Bacillus subtilis-en hazkunde-kurbak erakusten ditu hazkuntza-ingurunean (mantenugai-soluzioa), hasierako 5 eta 10 arteko pH-tartearekin. Irudian ikusten den bezala, Bacillus amyloliquefaciens eta Bacillus subtilis azkarrago hazi ziren 6-8 eta 7-9 pH-tan, hurrenez hurren. Beraz, pH-tarte hau hartu zen optimizazio-fasean.
(a) Bacillus amyloliquefaciens eta (b) Bacillus subtilis-en hazkuntza-kurbak mantenugai-ingurunearen hasierako pH balio desberdinetan.
6. irudiak Bernard kareometroan sortutako karbono dioxidoaren kantitatea erakusten du, hau da, prezipitatutako kaltzio karbonatoa (CaCO3) adierazten duena. Faktore bat konbinazio bakoitzean finkatu zenez eta beste faktoreak aldatu zirenez, grafiko hauetako puntu bakoitza esperimentu multzo horretako karbono dioxidoaren bolumen maximoari dagokio. Irudian ikusten den bezala, kaltzio iturriaren kontzentrazioa handitu ahala, kaltzio karbonatoaren ekoizpena handitu zen. Beraz, kaltzio iturriaren kontzentrazioak zuzenean eragiten dio kaltzio karbonatoaren ekoizpenari. Kaltzio iturria eta karbono iturria berdinak direnez (hau da, kaltzio formiatoa eta kaltzio azetatoa), zenbat eta kaltzio ioi gehiago askatu, orduan eta kaltzio karbonato gehiago sortzen da (6a irudia). AS eta AA formulazioetan, kaltzio karbonatoaren ekoizpena handitzen jarraitu zuen sendatze denbora handitu ahala, prezipitatuaren kantitatea ia aldatu gabe geratu arte 9 egun igaro ondoren. FA formulazioan, kaltzio karbonatoaren eraketa-tasa gutxitu egin zen sendatze denbora 6 egun baino gehiago igaro zenean. Beste formulazioekin alderatuta, FS formulazioak kaltzio karbonatoaren eraketa-tasa nahiko baxua erakutsi zuen 3 egun igaro ondoren (6b irudia). FA eta FS formulazioetan, kaltzio karbonatoaren ekoizpen osoaren % 70 eta % 87 lortu ziren hiru egun igaro ondoren, AA eta AS formulazioetan, berriz, proportzio hori % 46 eta % 45 ingurukoa baino ez zen, hurrenez hurren. Horrek adierazten du azido formikoan oinarritutako formulazioak CaCO3 eraketa-tasa handiagoa duela hasierako fasean azetatoan oinarritutako formulazioarekin alderatuta. Hala ere, eraketa-tasa moteldu egiten da sendatze-denbora handitzen den heinean. 6c iruditik ondoriozta daiteke OD1-tik gorako bakterioen kontzentrazioetan ere ez dagoela kaltzio karbonatoaren eraketan ekarpen esanguratsurik.
Bernard kaltzimetroak neurtutako CO2 bolumenaren (eta dagokion CaCO3 edukiaren) aldaketa, honako hauen funtzio gisa: (a) kaltzio iturriaren kontzentrazioa, (b) sendotze denbora, (c) dentsitate optikoa, (d) hasierako pH-a, (e) kaltzio iturriaren eta bakterioen disoluzioaren arteko erlazioa (formulazio bakoitzerako); eta (f) kaltzio iturriaren eta bakterioen konbinazio bakoitzerako sortutako kaltzio karbonato kopuru maximoa.
Ingurunearen hasierako pH-aren eraginari dagokionez, 6d irudiak erakusten du FA eta FS-rentzat CaCO3 ekoizpenak gehienezko balioa lortu zuela pH 7an. Behaketa hau bat dator aurreko ikerketekin, FDH entzimak pH 7-6,7an egonkorrenak direla diotenekin. Hala ere, AA eta AS-rentzat, CaCO3 prezipitazioa handitu egin zen pH-a 7tik gorakoa zenean. Aurreko ikerketek ere erakutsi zuten CoA entzimaren jarduerarako pH tarte optimoa 8tik 9,2-6,8ra bitartekoa dela. CoA entzimaren jarduerarako eta B. amyloliquefaciens-en hazkuntzarako pH tarte optimoak (8-9,2) eta (6-8) direla kontuan hartuta, hurrenez hurren (5a irudia), AA formulazioaren pH optimoa 8 izatea espero da, eta bi pH tarteak gainjartzen dira. Gertakari hau esperimentuen bidez berretsi zen, 6d irudian erakusten den bezala. B. subtilis hazkuntzarako pH optimoa 7-9 denez (5b irudia) eta CoA entzimaren jarduerarako pH optimoa 8-9,2 denez, CaCO3 prezipitazio-errendimendu maximoa 8-9 pH tartean egotea espero da, 6d irudiak berresten duen bezala (hau da, prezipitazio-pH optimoa 9 da). 6e irudian erakusten diren emaitzek adierazten dute kaltzio-iturri-soluzioaren eta bakterio-soluzioaren arteko erlazio optimoa 1 dela bai azetato-bai formiato-soluzioetarako. Alderatzeko, formulazio desberdinen (hau da, AA, AS, FA eta FS) errendimendua ebaluatu zen baldintza desberdinetan izandako CaCO3 ekoizpen maximoan oinarrituta (hau da, kaltzio-iturriaren kontzentrazioa, sendatze-denbora, OD, kaltzio-iturriaren eta bakterio-soluzioaren arteko erlazioa eta hasierako pHa). Aztertutako formulazioen artean, FS formulazioak izan zuen CaCO3 ekoizpen handiena, AA formulazioaren hirukoitza gutxi gorabehera (6f irudia). Lau kontrol-esperimentu bakteriorik gabe egin ziren bi kaltzio-iturrietarako eta ez zen CaCO3 prezipitaziorik ikusi 30 egun igaro ondoren.
Formulazio guztien mikroskopia optikoaren irudiek erakutsi zuten vaterita zela kaltzio karbonatoa eratu zen fase nagusia (7. irudia). Vaterita kristalak forma esferikoak ziren69,70,71. Kaltzio karbonatoa bakterio-zeluletan prezipitatzen zela ikusi zen, bakterio-zelulen gainazala negatiboki kargatuta zegoelako eta katioi dibalenteen adsorbente gisa joka zezakeelako. FS formulazioa adibide gisa hartuta ikerketa honetan, 24 ordu igaro ondoren, kaltzio karbonatoa sortzen hasi zen bakterio-zelula batzuetan (7a irudia), eta 48 ordu igaro ondoren, kaltzio karbonatoz estalitako bakterio-zelulen kopurua nabarmen handitu zen. Gainera, 7b irudian erakusten den bezala, vaterita partikulak ere detektatu ahal izan ziren. Azkenik, 72 ordu igaro ondoren, bakterio kopuru handia vaterita kristalek lotuta zegoela zirudien, eta vaterita partikulen kopurua nabarmen handitu zen (7c irudia).
CaCO3 prezipitazioen mikroskopia optikoaren behaketak FS konposizioetan denboran zehar: (a) 24, (b) 48 eta (c) 72 h.
Prezipitatutako fasearen morfologia gehiago ikertzeko, hautsen X izpien difrakzio (XRD) eta SEM analisiak egin ziren. XRD espektroek (8a irudia) eta SEM mikrografiek (8b eta c irudiak) vaterita kristalen presentzia baieztatu zuten, letxuga itxura zutelako eta vaterita gailurren eta prezipitatu gailurren arteko korrespondentzia ikusi baitzen.
(a) Sortutako CaCO3 eta vateritaren X izpien difrakzio-espektroen konparaketa. Vateritaren SEM mikrografiak (b) 1 kHz-ko eta (c) 5,27 kHz-ko handitze-mailan, hurrenez hurren.
Haize-tuneleko proben emaitzak 9a eta b irudietan ageri dira. 9a irudian ikus daiteke tratatu gabeko hareatzaren higadura-abiadura maximoa (TDV) 4,32 m/s ingurukoa dela. 1 l/m²-ko aplikazio-tasan (9a irudia), FA, FS, AA eta UMC frakzioen lurzoruaren galera-tasaren lerroen maldak tratatu gabeko dunaren berdinak dira gutxi gorabehera. Horrek adierazten du aplikazio-tasa horretan egindako tratamendua ez dela eraginkorra eta haizearen abiadura TDV gainditzen duenean, lurzoru-azal mehea desagertzen dela eta dunaren higadura-tasa tratatu gabeko dunaren berdina dela. AS frakzioaren higadura-malda ere abszisa txikiagoak dituzten beste frakzioena (hau da, TDV) baino txikiagoa da (9a irudia). 9b irudiko geziek adierazten dute 25 m/s-ko haize-abiadura maximoan, ez dela higadurarik gertatu tratatutako dunetan 2 eta 3 l/m²-ko aplikazio-tasetan. Beste era batera esanda, FS, FA, AS eta UMC-rentzat, dunak erresistenteagoak izan ziren CaCO³-aren metaketak eragindako haize-higaduraren aurrean 2 eta 3 l/m²-ko aplikazio-tasetan haize-abiadura maximoan baino (hau da, 25 m/s). Beraz, proba hauetan lortutako 25 m/s-ko TDV balioa da 9b irudian erakusten diren aplikazio-tasen beheko muga, AA-ren kasuan izan ezik, non TDV ia haize-tuneleko abiadura maximoaren berdina den.
Haizearen higadura-proba (a) Pisu-galera haizearen abiaduraren arabera (aplikazio-tasa 1 l/m2), (b) Atalase-kentzeko abiadura aplikazio-tasaren eta formulazioaren arabera (CA kaltzio azetatoarentzat, CF kaltzio formiatoarentzat).
10. irudiak hareazko bonbardaketa-proba egin ondoren formulazio eta aplikazio-tasa desberdinekin tratatutako hareazko dunen gainazaleko higadura erakusten du, eta emaitza kuantitatiboak 11. irudian ageri dira. Tratatu gabeko kasua ez da erakusten, erresistentziarik erakutsi ez zuelako eta hareazko bonbardaketa-proban zehar guztiz higatu zelako (masa-galera osoa). 11. irudian argi ikusten da AA biokonposizioarekin tratatutako laginak bere pisuaren % 83,5 galdu zuela 2 l/m2-ko aplikazio-tasan, eta gainerako lagin guztiek % 30 baino gutxiagoko higadura erakutsi zutela hareazko bonbardaketa-prozesuan zehar. Aplikazio-tasa 3 l/m2-ra igo zenean, tratatutako lagin guztiek beren pisuaren % 25 baino gutxiago galdu zuten. Bi aplikazio-tasetan, FS konposatuak erakutsi zuen hareazko bonbardaketaren aurkako erresistentzia onena. FS eta AA tratatutako laginen bonbardaketaren aurkako erresistentzia maximoa eta minimoa CaCO3 prezipitazio maximoari eta minimoari egotz dakizkieke (6f irudia).
2 eta 3 l/m2-ko emariekin konposizio desberdineko hareazko dunen bonbardaketaren emaitzak (geziek haizearen norabidea adierazten dute, gurutzeek marrazkiaren planoarekiko perpendikularra den haizearen norabidea).
12. irudian ikusten den bezala, formula guztien kaltzio karbonato edukia handitu egin zen aplikazio-tasa 1 L/m²-tik 3 L/m²-ra igo ahala. Gainera, aplikazio-tasa guztietan, kaltzio karbonato eduki handiena zuen formula FS izan zen, ondoren FA eta UMC etorri zirelarik. Horrek iradokitzen du formula hauek gainazaleko erresistentzia handiagoa izan dezaketela.
13a irudiak tratatu gabeko, kontrol eta tratatutako lurzoru laginen gainazaleko erresistentziaren aldaketa erakusten du permeametro probaren bidez neurtuta. Irudi honetatik, argi dago UMC, AS, FA eta FS formulazioen gainazaleko erresistentzia nabarmen handitu zela aplikazio-tasa handitu ahala. Hala ere, gainazaleko erresistentziaren igoera nahiko txikia izan zen AA formulazioan. Irudian ikusten den bezala, urea-degradatu gabeko MICPren FA eta FS formulazioek gainazaleko iragazkortasun hobea dute urea-degradatutako MICPrekin alderatuta. 13b irudiak TDVren aldaketa erakusten du lurzoruaren gainazaleko erresistentziarekin. Irudi honetatik, argi ikusten da 100 kPa baino handiagoa den gainazaleko erresistentzia duten dunetan, atalase-kentze abiadura 25 m/s-tik gorakoa izango dela. In situ gainazaleko erresistentzia erraz neur daitekeenez permeametro bidez, ezagutza horrek TDV kalkulatzen lagun dezake haize-tuneleko probarik gabe, eta horrela, kalitate-kontroleko adierazle gisa balio dezake landa-aplikazioetarako.
SEM emaitzak 14. irudian ageri dira. 14a-b irudiek tratatu gabeko lurzoru laginaren partikula handituak erakusten dituzte, eta horrek argi adierazten du kohesioa duela eta ez duela lotura edo zementazio naturalik. 14c irudiak urea degradatutako MICP-rekin tratatutako kontrol laginaren SEM mikrografia erakusten du. Irudi honek kaltzita polimorfo gisa CaCO3 prezipitatuen presentzia erakusten du. 14d-o irudietan erakusten den bezala, prezipitatutako CaCO3-ak partikulak lotzen ditu elkarrekin; vaterita kristal esferikoak ere identifikatu daitezke SEM mikrografietan. Ikerketa honen eta aurreko ikerketen emaitzek adierazten dute vaterita polimorfo gisa eratutako CaCO3 loturek erresistentzia mekaniko arrazoizkoa eman dezaketela; gure emaitzek erakusten dute gainazaleko erresistentzia 350 kPa-ra igotzen dela eta atalase-banaketa abiadura 4,32tik 25 m/s baino gehiagora igotzen dela. Emaitza hau aurreko ikerketen emaitzekin bat dator, MICP-z prezipitatutako CaCO3-aren matrizea vaterita dela diotenak, erresistentzia mekaniko eta haize-higaduraren aurkako erresistentzia arrazoizkoa duena13,40 eta haize-higaduraren aurkako erresistentzia arrazoizkoa mantendu dezakeena landa-ingurumen-baldintzetan 180 egunez egon ondoren ere13.
(a, b) Tratatu gabeko lurzoruaren SEM mikrografiak, (c) MICP urearen degradazio-kontrola, (df) AAz tratatutako laginak, (gi) ASz tratatutako laginak, (jl) FAz tratatutako laginak eta (mo) FSz tratatutako laginak, 3 L/m2-ko aplikazio-tasan eta handitze desberdinetan.
14d-f irudiek erakusten dute AA konposatuekin tratatu ondoren, kaltzio karbonatoa hauspeatu zela gainazalean eta harea-aleen artean, eta estali gabeko harea-ale batzuk ere ikusi zirela. AS osagaien kasuan, sortutako CaCO3 kantitatea ez zen nabarmen handitu (6f irudia), baina CaCO3-k eragindako harea-aleen arteko kontaktuen kopurua nabarmen handitu zen AA konposatuekin alderatuta (14g-i irudia).
14j-l eta 14m-o irudietatik argi ikusten da kaltzio formiatoa kaltzio iturri gisa erabiltzeak CaCO3 prezipitazioa areagotzen duela AS konposatuarekin alderatuta, eta hori bat dator 6f irudiko kaltzio neurgailuaren neurketekin. Badirudi CaCO3 gehigarri hau batez ere harea partikuletan metatzen dela eta ez duela zertan kontaktuaren kalitatea hobetu. Honek aurretik behatutako portaera berresten du: CaCO3 prezipitazio kopuruan dauden desberdintasunak gorabehera (6f irudia), hiru formulazioak (AS, FA eta FS) ez dira nabarmen desberdinak eolikoen aurkako (haize) errendimenduari (11. irudia) eta gainazaleko erresistentziari (13a irudia).
CaCO3-z estalitako bakterio-zelulak eta prezipitatutako kristalen gaineko bakterioen aztarna hobeto ikusteko, handitze handiko SEM mikrografiak egin ziren eta emaitzak 15. irudian ageri dira. Erakusten den bezala, kaltzio karbonatoa bakterio-zeluletan prezipitatzen da eta bertan prezipitaziorako beharrezkoak diren nukleoak ematen ditu. Irudiak CaCO3-k eragindako lotura aktibo eta inaktiboak ere erakusten ditu. Ondorioztatu daiteke lotura inaktiboen edozein igoerak ez duela zertan portaera mekanikoaren hobekuntza gehiago ekarri. Beraz, CaCO3 prezipitazioa handitzeak ez du zertan erresistentzia mekaniko handiagoa ekarri eta prezipitazio-ereduak paper garrantzitsua betetzen du. Puntu hau Terzis eta Laloui72 eta Soghi eta Al-Kabani45,73-ren lanetan ere aztertu da. Prezipitazio-ereduaren eta erresistentzia mekanikoaren arteko erlazioa gehiago aztertzeko, µCT irudiak erabiliz MICP azterketak gomendatzen dira, eta hori ikerketa honen esparrutik kanpo dago (hau da, kaltzio-iturriaren eta bakterioen konbinazio desberdinak sartzea amoniakorik gabeko MICPrako).
CaCO3-ak lotura aktiboak eta inaktiboak eragin zituen (a) AS konposizioarekin eta (b) FS konposizioarekin tratatutako laginetan, eta zelula bakterianoen aztarna utzi zuen sedimentuan.
14j-o eta 15b irudietan ikusten den bezala, CaCO3 film bat dago (EDX analisiaren arabera, filmean elementu bakoitzaren ehuneko konposizioa karbono % 11, oxigeno % 46,62 eta kaltzio % 42,39 da, eta hori 16. irudiko CaCO3-ren ehunekotik oso gertu dago). Film honek vaterita kristalak eta lurzoruko partikulak estaltzen ditu, lurzoru-sedimentu sistemaren osotasuna mantentzen lagunduz. Film honen presentzia formiatoan oinarritutako formulazioarekin tratatutako laginetan bakarrik ikusi zen.
2. taulak aurreko ikerketetan eta ikerketa honetan urea degradatzen duten eta urea degradatzen ez duten MICP bideekin tratatutako lurzoruen gainazaleko erresistentzia, atalase-askapen abiadura eta bioinduzitutako CaCO3 edukia alderatzen ditu. MICPz tratatutako duna-laginen haize-higaduraren erresistentziari buruzko ikerketak mugatuak dira. Meng et al.-ek MICPz tratatutako urea degradatzen duten duna-laginen haize-higaduraren erresistentzia ikertu zuten hosto-puzgailu bat erabiliz,13 ikerketa honetan, urea degradatzen ez duten duna-laginak (baita urea degradatzen duten kontrolak ere) haize-tunel batean probatu eta lau bakterio eta substantzien konbinazio ezberdinekin tratatu ziren.
Ikus daitekeenez, aurreko ikerketa batzuek 4 L/m213,41,74 baino gehiagoko aplikazio-tasa altuak kontuan hartu dituzte. Aipatzekoa da aplikazio-tasa altuak ez direla erraz aplikagarriak izango ikuspegi ekonomiko batetik, ur-hornikuntzarekin, garraioarekin eta ur-bolumen handien aplikazioarekin lotutako kostuak direla eta. Aplikazio-tasa txikiagoek, hala nola 1,62-2 L/m2-k, gainazaleko erresistentzia nahiko onak lortu dituzte, 190 kPa-raino, eta 25 m/s-tik gorako TDV. Oraingo ikerketan, urea degradatu gabe formiatoan oinarritutako MICP-arekin tratatutako dunek gainazaleko erresistentzia handiak lortu dituzte, urea degradazio-bidearekin lortutakoekin alderagarriak direnak aplikazio-tasa-tarte berean (hau da, urea degradatu gabe formiatoan oinarritutako MICP-arekin tratatutako laginak ere gai izan dira gainazaleko erresistentzia-balioen tarte bera lortzeko, Meng et al.-ek jakinarazi duten bezala, 13, 13a irudia). Ikus daiteke, halaber, 2 L/m2-ko aplikazio-tasan, haizearen higadura arintzeko kaltzio karbonatoaren etekina % 2,25ekoa izan zela 25 m/s-ko haize-abiaduran, formiatoan oinarritutako MICP-arentzat, urea degradatu gabe, eta hori oso gertu dago behar den CaCO3 kantitatetik (hau da, % 2,41), aplikazio-tasa eta haize-abiadura berdinean (25 m/s) urea degradatu duten kontrol-MICP-arekin tratatutako dunekin alderatuta.
Beraz, taula honetatik ondoriozta daiteke bai urea degradazio-bideak bai urea gabeko degradazio-bideak errendimendu nahiko onargarria eman dezaketela gainazaleko erresistentziari eta TDVari dagokionez. Desberdintasun nagusia da urea gabeko degradazio-bideak ez duela amoniakorik eta, beraz, ingurumen-inpaktu txikiagoa duela. Gainera, ikerketa honetan proposatutako urea degradaziorik gabeko formiatoan oinarritutako MICP metodoak urea degradaziorik gabeko azetatoan oinarritutako MICP metodoak baino hobeto funtzionatzen duela dirudi. Mohebbi et al.-ek urea degradaziorik gabeko azetatoan oinarritutako MICP metodoa aztertu bazuten ere, haien ikerketak gainazal lauetan egindako laginak sartu zituen9. Duna-laginen inguruan zurrunbiloen sorrerak eragindako higadura-maila handiagoaren eta ondoriozko zizailaduraren ondorioz, TDV txikiagoa dakarrenez, duna-laginen haize-higadura abiadura berean gainazal lauena baino nabarmenagoa izatea espero da.