Landareen defentsarako teoria ezberdinek gidalerro teoriko garrantzitsuak eskaintzen dituzte landareen metabolismo espezializatuaren ereduak azaltzeko, baina haien iragarpen nagusiak oraindik probatu gabe daude. Hemen, tandem masa-espektrometria (MS/MS) analisi inpartziala erabili dugu tabako-andui ahulduen metaboloma sistematikoki aztertzeko, landare indibidualetatik hasi eta populazioetaraino eta espezie estuki erlazionatuetaraino, eta informazioko konposatuen espektroetan oinarritutako masa-espektrometriako ezaugarri-teoria ugari prozesatu ditugu. Defentsa optimoaren (OD) eta helburu mugikorreko (MT) teorien iragarpen nagusiak probatzeko esparrua. Landareen metabolomikaren informazio-osagaia OD teoriarekin bat dator, baina belarjaleek eragindako metabolomika-dinamikari buruz MT teoriaren iragarpen nagusiarekin kontraesanean dago. Mikro-eskala ebolutibotik makro-eskalara, jasmonato-seinalea OD-ren determinatzaile nagusitzat identifikatu zen, eta etileno-seinaleak, berriz, MS/MS sare molekularrak anotatutako belarjaleen erantzun espezifikoaren doikuntza fina eman zuen.
Egitura anitzeko metabolito bereziak dira landareen ingurunera egokitzeko parte-hartzaile nagusiak, batez ere etsaien defentsan (1). Landareetan aurkitzen den metabolismo bereziaren dibertsifikazio harrigarriak hamarkadetako ikerketa sakona bultzatu du bere funtzio ekologikoen alderdi askori buruz, eta landareen defentsarako teorien zerrenda luzea osatu du, hau da, landareen eta intsektuen arteko elkarrekintzen garapen ebolutiboa eta ekologikoa. Ikerketa enpirikoak orientazio garrantzitsua eskaintzen du (2). Hala ere, landareen defentsarako teoria hauek ez zuten arrazoiketa deduktibo hipotetikoaren bide normatiboa jarraitu, non iragarpen nagusiak analisi maila berean zeuden (3) eta esperimentalki probatu ziren garapen teorikoaren hurrengo zikloa aurrera eramateko (4). Muga teknikoek datuen bilketa kategoria metaboliko espezifikoetara mugatzen dute eta metabolito espezializatuen analisi integrala baztertzen dute, eta horrela, garapen teorikorako ezinbestekoak diren kategoria arteko konparaketak eragozten dituzte (5). Metabolomika datu integralen eta landare talde desberdinen arteko espazio metabolikoaren prozesatze-lan-fluxua alderatzeko moneta komun baten faltak eremuaren heldutasun zientifikoa oztopatzen du.
Tandem masa-espektrometriaren (MS/MS) metabolomikaren arloko azken aurrerapenek sistema-klado jakin bateko espezieen barruko eta arteko aldaketa metabolikoak modu integralean karakterizatu ditzakete, eta metodo konputazionalekin konbina daitezke nahasketa konplexu horien arteko egitura-antzekotasuna kalkulatzeko. Kimikaren aurreko ezagutza (5). Analisiaren eta konputazioaren teknologia aurreratuen konbinazioak beharrezko esparru bat eskaintzen du dibertsitate metabolikoaren teoria ekologiko eta ebolutiboek egindako iragarpen askoren epe luzerako probak egiteko. Shannonek (6) informazio-teoria aurkeztu zuen lehen aldiz 1948ko bere artikulu garrantzitsu batean, informazioaren analisi matematikoaren oinarriak ezarriz, eta hori bere jatorrizko aplikazioaz gain beste hainbat arlotan erabili izan da. Genomikan, informazio-teoria arrakastaz aplikatu da sekuentzia-informazio kontserbadorea kuantifikatzeko (7). Transkriptomikaren ikerketan, informazio-teoriak transkriptoman gertatzen diren aldaketa orokorrak aztertzen ditu (8). Aurreko ikerketetan, informazio-teoriaren esparru estatistikoa metabolomikan aplikatu genuen landareen ehunen mailaren espezializazio metabolikoa deskribatzeko (9). Hemen, MS/MS oinarritutako lan-fluxua informazio-teoriaren esparru estatistikoarekin konbinatzen dugu, moneta arruntean dagoen dibertsitate metabolikoak ezaugarritzen duena, belarjaleek eragindako metabolomaren landareen defentsa-teoriaren iragarpen nagusiak alderatzeko.
Landareen defentsaren esparru teorikoak normalean elkarren artean inklusiboak dira eta bi kategoriatan bana daitezke: landare-metabolito espezifikoen banaketa defentsa-funtzioetan oinarrituta azaltzen saiatzen direnak, hala nola defentsa optimoa (OD) (10), helburu mugikorra (MT) (11) eta itxuraren teoria (12), eta beste batzuek, berriz, baliabideen erabilgarritasunean izandako aldaketek landareen hazkuntzan eta metabolito espezializatuen metaketan nola eragiten duten azalpen mekanikoak bilatzen dituzte, hala nola karbonoa: mantenugaien oreka hipotesia (13), hazkunde-tasa hipotesia (14) eta hazkunde eta bereizketa oreka hipotesia (15). Bi teoria multzoak analisi maila desberdinetan daude (4). Hala ere, funtzio-mailako defentsa-funtzioak inplikatzen dituzten bi teoriak dira nagusi landareen defentsa konstitutibo eta induzigarriei buruzko eztabaidan: OD teoria, zeinak suposatzen duen landareek beren defentsa kimiko garestietan behar denean bakarrik inbertitzen dutela, adibidez, irensten direnean. Belardiko animalia batek erasotzen duenean, beraz, etorkizuneko erasoaren aukeraren arabera, defentsa-funtzioa duen konposatua esleitzen zaio (10); MT hipotesiak proposatzen du ez dagoela metabolitoen norabide-aldaketaren ardatzik, baina metabolitoa ausaz aldatzen dela, eta horrela belarjale erasotzaileen "mugimendu-helburu" metabolikoa oztopatzeko aukera sortzen dela. Beste era batera esanda, bi teoria hauek kontrako iragarpenak egiten dituzte belarjaleen erasoaren ondoren gertatzen den birmoldaketa metabolikoari buruz: funtzio defentsiboa duten metabolitoen metaketa unidirekzionalaren (OD) eta zuzendu gabeko aldaketa metabolikoen (MT) arteko erlazioa (11).
OD eta MT hipotesiek ez dituzte metabolomaren eragindako aldaketak bakarrik hartzen barne, baita metabolito hauen metaketaren ondorio ekologiko eta ebolutiboak ere, hala nola aldaketa metaboliko hauen egokitzapen-kostuak eta onurak ingurune ekologiko espezifiko batean (16). Bi hipotesiek metabolito espezializatuen defentsa-funtzioa aitortzen duten arren, garestia izan daitekeena edo ez, OD eta MT hipotesiak bereizten dituen iragarpen nagusia eragindako aldaketa metabolikoen norabidetasunean datza. OD teoriaren iragarpenak jaso du orain arte arreta esperimental gehien. Proba horien artean daude konposatu espezifikoen ehun desberdinen defentsa-funtzio zuzenak edo zeharkakoak aztertzea, negutegietan eta baldintza naturaletan, baita landareen garapen-etapan izandako aldaketak ere (17-19). Hala ere, orain arte, edozein organismoren dibertsitate metabolikoaren analisi global integrala egiteko lan-fluxu eta esparru estatistikorik ez dagoenez, bi teorien arteko iragarpenaren desberdintasun nagusia (hau da, aldaketa metabolikoen norabidea) probatu gabe dago oraindik. Hemen, analisi hori eskaintzen dugu.
Landare-metabolito espezifikoen ezaugarri esanguratsuenetako bat haien egitura-aniztasun handia da, landare bakarretik hasi eta populazioetatik hasi eta antzeko espezieetaraino (20). Metabolito espezializatuetan aldaketa kuantitatibo asko ikus daitezke populazio-eskalan, eta espezie-mailan, berriz, desberdintasun kualitatibo sendoak mantentzen dira normalean (20). Beraz, landareen metabolismo-aniztasuna da aniztasun funtzionalaren alderdi nagusia, nitxo desberdinetara egokitzeko gaitasuna islatzen duena, batez ere intsektu bereziek eta belarjale arruntek inbasio-aukera desberdinak dituzten nitxoetara (21). Fraenkelen (22) landare-metabolito espezifikoen existentziaren arrazoiei buruzko artikulu berritzailea idatzi zuenetik, intsektu ezberdinekin izandako elkarrekintzak hautespen-presio garrantzitsutzat hartu dira, eta uste da elkarrekintza horiek landareak moldatu dituztela eboluzioan zehar. Bide metabolikoa (23). Metabolito espezializatuen aniztasunean dauden espezieen arteko desberdintasunek belarjaleen estrategien aurkako landareen defentsa eratzaile eta induzigarriarekin lotutako oreka fisiologikoa ere islatu dezakete, bi espezieak askotan elkarren artean korrelazio negatiboa baitute (24). Uneoro defentsa ona mantentzea onuragarria izan daitekeen arren, defentsarekin lotutako aldaketa metaboliko puntualek onura argiak eskaintzen dituzte landareei baliabide baliotsuak beste inbertsio fisiologiko batzuetara bideratzeko aukera ematen dietelako (19, 24), eta sinbiosiaren beharra saihesten dutelako. Kalte kolateralak (25). Gainera, intsektu belarjaleek eragindako metabolito espezializatuen berrantolaketa hauek populazioan banaketa suntsitzailea ekar dezakete (26), eta azido jasmonikoaren (JA) seinalean aldaketa natural nabarmenen irakurketa zuzenak islatu ditzakete, eta horiek populazioan mantendu daitezke. JA seinale altuak eta baxuak belarjaleen aurkako defentsaren eta espezie espezifikoekin lehiatzearen arteko oreka dira (27). Gainera, metabolitoen biosintesi bide espezializatuek galera eta eraldaketa azkarrak jasango dituzte eboluzioan zehar, eta horrek banaketa metaboliko irregularra eragingo du espezie estuen artean (28). Polimorfismo hauek azkar ezar daitezke belarjaleen eredu aldakorrei erantzunez (29), eta horrek esan nahi du belarjaleen komunitateen gorabeherak faktore gakoa direla heterogeneotasun metabolikoa bultzatzen dutenak.
Hemen, zehazki honako arazo hauek konpondu ditugu. (I) Nola birkonfiguratzen du intsektu belarjaleak landareen metaboloma? (Ii) Zeintzuk dira epe luzeko defentsa-teoriaren iragarpenak probatzeko kuantifika daitezkeen plastizitate metabolikoaren informazio-osagai nagusiak? (Iii) Landareen metaboloma erasotzailearentzat bakarrik den moduan birprogramatu behar den ala ez, hala bada, zer eginkizun jokatzen du landare-hormonak erantzun metaboliko espezifiko bat egokitzeko, eta zein metabolitok laguntzen dute defentsaren espezie-espezifikotasunean? (Iv) Defentsa-teoria askok egindako iragarpenak ehun biologikoen maila guztietara zabaldu daitezkeenez, galdetu dugu zein koherentea den eragindako erantzun metabolikoa barne-konparaziotik espezie arteko konparaziora. Horretarako, sistematikoki aztertu dugu tabako-nikotinaren hosto-metaboloma. Landare hau metabolismo espezializatu aberatsa du eta bi belarjale natiboen larben aurka eraginkorra da, Lepidoptera Datura (Ms) (oso oldarkorra, batez ere jaten dena). Solanaceae eta Spodoptera littoralis (Sl) landareetan, kotoi-hosto-zizareak "genero" moduko bat dira, Solanaceae landare ostalariekin eta beste genero eta familietako beste ostalari batzuekin. MS/MS metabolomikaren espektroa aztertu dugu eta informazio-teoriaren deskribapen estatistikoak atera ditugu OD eta MT teoriak alderatzeko. Espezifikotasun-mapak sortu ditugu metabolito gakoen identitatea agerian uzteko. Analisia N. nasi-ren bertako populaziora eta antzeko tabako-espezieetara zabaldu da, landare-hormonen seinaleztapenaren eta OD indukzioaren arteko kobariantza gehiago aztertzeko.
Belarjale tabakoaren hosto-metabolomaren plastizitate eta egituraren mapa orokor bat ateratzeko, aurretik garatutako analisi eta kalkulu-lan-fluxu bat erabili genuen landare-estraktuetatik bereizmen handiko datu independenteko MS/MS espektroak modu integralean biltzeko eta dekonboluzionatzeko (9). Metodo bereizgabe honek (MS/MS izenekoak) konposatu-espektro ez-erredundanteak eraiki ditzake, eta gero hemen deskribatutako konposatu-mailako analisi guztietarako erabil daitezke. Landare-metabolito dekonboluzionatu hauek mota askotakoak dira, ehunka eta milaka metabolitoz osatuta (hemen 500-1000-s/MS/MS inguru). Hemen, plastizitate metabolikoa informazio-teoriaren esparruan aztertzen dugu, eta metabolomaren aniztasuna eta profesionaltasuna kuantifikatzen ditugu maiztasun metabolikoaren banaketaren Shannon entropian oinarrituta. Aurretik inplementatutako formula (8) erabiliz, metabolomaren aniztasuna (Hj adierazlea), profil metabolikoaren espezializazioa (δj adierazlea) eta metabolito bakar baten espezifikotasun metabolikoa (Si adierazlea) kuantifikatzeko erabil daitezkeen adierazle multzo bat kalkulatu genuen. Horrez gain, Distantzia Erlatiboaren Plastizitate Indizea (RDPI) aplikatu genuen belarjaleen metabolomaren induzigarritasuna kuantifikatzeko (1A irudia) (30). Esparru estatistiko honen barruan, MS/MS espektroa oinarrizko informazio-unitate gisa hartzen dugu, eta MS/MS-ren ugaritasun erlatiboa maiztasun-banaketa mapa batean prozesatzen dugu, eta ondoren Shannon entropia erabiltzen dugu metabolomaren dibertsitatea kalkulatzeko. Metabolomaren espezializazioa MS/MS espektro bakar baten batez besteko espezifikotasunaren bidez neurtzen da. Beraz, belarjaleen indukzioaren ondoren MS/MS klase batzuen ugaritasunaren igoera induzigarritasun espektral, RDPI eta espezializazio bihurtzen da, hau da, δj indizearen igoera, metabolito espezializatuagoak sortzen direlako eta Si indize altua sortzen delako. Hj dibertsitate indizearen jaitsierak islatzen du sortutako MS/MS kopurua murriztu dela, edo profilaren maiztasun-banaketa norabide ez hain uniformean aldatzen dela, bere ziurgabetasun orokorra murriztuz. Si indizearen kalkuluaren bidez, zein MS/MS belarjale jakin batzuek induzitzen dituzten nabarmendu daiteke, eta, aitzitik, zein MS/MSk ez dion indukzioari erantzuten, eta hori adierazle gakoa da MT eta OD iragarpena bereizteko.
(A) Belarjaleen (H1etik Hxra) MS/MS datu-induzigarritasunerako (RDPI), dibertsitaterako (Hj indizea), espezializaziorako (δj indizea) eta metabolitoen espezifikotasunerako (Si indizea) erabilitako deskriptore estatistikoak. Espezializazio-mailaren igoerak (δj) adierazten du, batez beste, belarjaleen metabolito espezifiko gehiago sortuko direla, eta dibertsitatearen jaitsierak (Hj) metabolitoen ekoizpenaren jaitsiera edo metabolitoen banaketa irregularra adierazten du banaketa-mapan. Si balioak ebaluatzen du metabolitoa baldintza jakin baterako espezifikoa den (hemen, belarjalea) edo alderantziz maila berean mantentzen den. (B) Defentsa-teoriaren iragarpenaren diagrama kontzeptuala informazio-teoriaren ardatza erabiliz. OD teoriak aurreikusten du belarjaleen erasoak defentsa-metabolitoak handituko dituela, eta horrela δj handituko dela. Aldi berean, Hj gutxitzen da profila informazio metabolikoaren ziurgabetasuna murrizterantz berrantolatzen delako. MT teoriak aurreikusten du belarjaleen erasoak metabolomaren norabiderik gabeko aldaketak eragingo dituela, eta horrela Hj handituko dela informazio metabolikoaren ziurgabetasuna handitu den adierazle gisa eta Si-ren banaketa ausazkoa eragingo duela. Eredu misto bat ere proposatu genuen, MT onena, non defentsa-balio handiagoak dituzten metabolito batzuk bereziki handituko diren (Si balio altua), eta beste batzuek ausazko erantzunak erakusten dituzten bitartean (Si balio baxuagoa).
Informazio-teoriaren deskribatzaileak erabiliz, OD teoria interpretatzen dugu belarjaleek eragindako metabolito berezien aldaketek, egoera eratzaile induzitu gabe batean, honako hauek ekarriko dituztela aurreikusteko: (i) espezifikotasun metabolikoaren igoera (Si indizea), metabonomaren espezifikotasuna (δj indizea) bultzatuz. Defentsa-balio handiagoa duten metabolito-talde berezi batzuen igoera, eta (ii) metabolomaren dibertsitatearen jaitsiera (Hj indizea), maiztasun metabolikoaren banaketa leptinaren gorputz-banaketa gehiago izatera aldatu delako. Metabolito bakar baten mailan, Si banaketa ordenatua espero da, non metabolitoak Si balioa handituko duen bere defentsa-balioaren arabera (1B irudia). Ildo horretatik, MT teoria azaltzen dugu kitzikapenak (i) metabolitoen norabide gabeko aldaketak ekarriko dituela aurreikusteko, δj indizearen jaitsiera eraginez, eta (ii) Hj indizearen igoera, ziurgabetasun metabolikoaren igoeraren ondorioz. Edo ausazkotasuna, Shannon entropiaren bidez kuantifika daitekeena, dibertsitate orokortuaren moduan. Konposizio metabolikoari dagokionez, MT teoriak Si-ren banaketa aleatorioa iragarriko du. Kontuan hartuta metabolito batzuk baldintza espezifikoetan daudela, eta beste batzuk ez daudela baldintza espezifikoetan, eta haien defentsa-balioa ingurunearen araberakoa dela, defentsa-eredu misto bat ere proposatu genuen, non δj eta Hj Si-ren gainean bitan banatzen diren. Norabide guztietan handitzen da, defentsa-balio handiagoak dituzten metabolito-talde batzuek bakarrik handituko dute Si bereziki, eta beste batzuek banaketa ausazkoa izango dute (1B irudia).
Informazio-teoriaren deskriptorearen ardatzean birdefinitutako defentsa-teoriaren iragarpena probatzeko, Nepenthes pallens-en hostoetan aditu (Ms) edo orokor (Sl) belarjale larbak sortu genituen (2A irudia). MS/MS analisia erabiliz, 599 MS/MS espektro ez-erredundante (S1 datu-fitxategia) berreskuratu genituen beldarrak elikatu ondoren bildutako hosto-ehunen metanol-estraktuetatik. RDPI, Hj eta δj indizeak erabiliz MS/MS konfigurazio-fitxategietako informazio-edukiaren birkonfigurazioa bistaratzeko, eredu interesgarriak agerian geratzen dira (2B irudia). Joera orokorra da, informazio-deskriptoreak deskribatzen duen bezala, beldarrek hostoak jaten jarraitzen duten heinean, metabolismo-berrantolaketa guztiaren maila denboran zehar handitzen dela: belarjaleak jan eta 72 ordura, RDPI nabarmen handitzen da. Kaltetu gabeko kontrolarekin alderatuta, Hj nabarmen murriztu zen, eta hori profil metabolikoaren espezializazio-maila handiagoari zor zitzaion, δj indizearen bidez kuantifikatu zena. Joera ageriko hau OD teoriaren iragarpenekin bat dator, baina MT teoriaren iragarpen nagusiekin ez dator bat, zeinak uste baitu metabolito mailen ausazko (norabiderik gabeko) aldaketak kamuflaje defentsa gisa erabiltzen direla (1B irudia). Bi belarjale hauen ahozko jariapenaren (OS) eliztoreen edukia eta elikadura-portaera desberdinak diren arren, haien elikadura zuzenak Hj eta δj-ren norabideetan antzeko aldaketak eragin zituen 24 orduko eta 72 orduko uzta-aldietan. Desberdintasun bakarra RDPIren 72 orduetan gertatu zen. Ms elikadurak eragindakoarekin alderatuta, Sl elikadurak eragindako metabolismo orokorra handiagoa izan zen.
(A) Diseinu esperimentala: txerri arrunta (S1) edo aditua (Ms) belarjalea landare pitxerren hosto gatzgabetuekin elikatzen da, belarjale simulaturako, berriz, Ms-ren OS (W + OSM) erabiltzen da hostoen posizio estandarizatuen zauria zulatzeko. S1 (W + OSSl) larbak edo ura (W + W) zauritzen dira. Kontrola (C) hosto kaltetu gabea da. (B) Induktibilitate (RDPI kontrol-taularekin alderatuta), dibertsitatea (Hj indizea) eta espezializazio (δj indizea) indizea metabolito mapa berezirako kalkulatuta (599 MS/MS; S1 datu fitxategia). Asteriskoek belarjaleen zuzeneko elikaduraren eta kontrol taldearen arteko desberdintasun esanguratsuak adierazten dituzte (Student-en t-testa t-test parekatuarekin, *P<0,05 eta ***P<0,001). ns, ez da garrantzitsua. (C) Belarjale-tratamendu simulatuaren ondoren, metabolito-espektro nagusiaren (kutxa urdina, aminoazidoa, azido organikoa eta azukrea; S2 datu-fitxategia) eta metabolito berezien (kutxa gorria 443 MS/MS; S1 datu-fitxategia) denbora-bereizmenaren indizea. Kolore-bandak % 95eko konfiantza-tartea adierazten du. Izartxoak tratamenduaren eta kontrol-taldearen arteko aldea esanguratsua dela adierazten du [bariantza-analisi koadratikoa (ANOVA), eta ondoren Tukey-ren aldea esanguratsuena (HSD) post hoc konparazio anitzekoetarako, *P<0,05, **P<0,01 eta *** P <0,001]. (D) Sakabanaketa-diagramen espezializazioa eta metabolito-profil bereziak (tratamendu desberdinekin errepikatutako laginak).
Belarjaleek eragindako metaboloma mailan birmoldaketa metabolito indibidualen mailaren aldaketetan islatzen den aztertzeko, lehenik eta behin Nepenthes pallens-en hostoetan aurretik aztertutako metabolitoetan zentratu ginen, belarjaleekiko erresistentzia frogatua dutenetan. Fenol amidak hidroxizinamamida-poliamina konjugatuak dira, intsektuen belarjale-prozesuan metatzen direnak eta intsektuen errendimendua murrizten dutela ezagutzen dena (32). Dagokion MS/MS-ren aitzindariak bilatu genituen eta haien metatutako kurbak irudikatu genituen (S1 irudia). Ez da harritzekoa belarjaleen aurkako defentsan zuzenean parte hartzen ez duten fenol deribatuak, hala nola azido klorogenikoa (CGA) eta rutina, belarjaleen ondoren gutxitzea. Aitzitik, belarjaleek fenol amidak oso indartsu bihur ditzakete. Bi belarjaleen etengabeko elikadurak fenolamiden kitzikapen-espektro ia berdina eragin zuen, eta eredu hau bereziki agerikoa zen fenolamiden de novo sintesian. Fenomeno bera ikusiko da 17-hidroxigeranil nonanediol diterpeno glukosidoen (17-HGL-DTG) bidea aztertzean, zeinak belarjaleen aurkako funtzio eraginkorrak dituzten diterpeno azikliko ugari sortzen dituen (33), eta horietatik Ms Sl-rekin elikatzeak antzeko adierazpen-profila eragin zuen (S1 irudia)).
Belarjaleen zuzeneko elikadura esperimentuen desabantaila posiblea belarjaleen hostoen kontsumo-tasaren eta elikadura-denboraren arteko aldea da, eta horrek zaildu egiten du zauriek eta belarjaleek eragindako belarjaleen efektu espezifikoak ezabatzea. Hostoen metabolismo-erantzun induzituaren belarjale espezieen espezifikotasuna hobeto konpontzeko, Ms eta Sl larben elikadura simulatu genuen, bildutako OS berria (OSM eta OSS1) hostoen posizio koherenteen W zulaketa estandarrean berehala aplikatuz. Prozedura horri W + OS tratamendua deitzen zaio, eta indukzioa estandarizatzen du belarjaleak eragindako erantzunaren hasiera zehatz-mehatz denboratuz, ehunen galera-tasaren edo kantitatearen arteko desberdintasunen nahasgarritasun-ondorioak eragin gabe (2A irudia) (34). MS/MS analisi eta kalkulu-hodia erabiliz, 443 MS/MS espektro berreskuratu genituen (S1 datu-fitxategia), aurretik zuzeneko elikadura-esperimentuetatik bildutako espektroekin gainjartzen zirenak. MS/MS datu-multzo honen informazio-teoriaren analisiak erakutsi zuen belarjaleak simulatuz hostoetan espezializatutako metabolomak birprogramatzeak OS-eraginkortasun espezifikoak erakusten zituela (2C irudia). Bereziki, OSS1 tratamenduarekin alderatuta, OSM-k metabolomaren espezializazioaren hobekuntza eragin zuen 4 ordutan. Aipatzekoa da belarjaleen zuzeneko elikadura esperimentalaren datu-multzoarekin alderatuta, bi dimentsioko espazioan bistaratutako zinetika metabolikoa Hj eta δj koordenatu gisa erabiliz eta metabolomaren espezializazioaren norabidetasuna denboran zehar simulatutako belarjaleen tratamenduari erantzunez handitzen direla (2D irudia). Aldi berean, aminoazidoen, azido organikoen eta azukreen edukia kuantifikatu genuen (S2 datu-fitxategia) metabolomaren espezializazioan izandako igoera hori belarjale simulatuen erantzunez karbono-metabolismo zentralaren birkonfigurazioaren ondorio den ikertzeko (S2 irudia). Eredu hau hobeto azaltzeko, aurretik eztabaidatutako fenolamida eta 17-HGL-DTG bideen metaketa metabolikoaren zinetika gehiago kontrolatu genuen. Belarjaleen OS-espezifiko indukzioa fenolamida metabolismoaren barruan birmoldaketa-eredu diferentzial batean eraldatzen da (S3 irudia). Kumarina eta kafeoil zatiak dituzten amida fenolikoak OSS1-ek lehentasunez induzitzen ditu, OSM-ek, berriz, ferulil konjugatuen indukzio espezifikoa eragiten dute. 17-HGL-DTG bideari dagokionez, OS indukzio diferentziala detektatu zen beheranzko malonilazio eta dimalonilazio produktuen bidez (S3 irudia).
Ondoren, OS-k eragindako transkriptomaren plastizitatea aztertu genuen denbora-ibilbideko mikroarray datu-multzoa erabiliz, belarjaleen arroseta landareen hostoak tratatzeko OSM-en erabilera simulatzen duena. Laginketa-zinetika funtsean metabolomika-azterketa honetan erabilitako zinetikarekin gainjartzen da (35). Metabolomaren birkonfigurazioarekin alderatuta, non plastizitate metabolikoa denboran zehar handitzen den bereziki, Ms-k eragindako hostoetan transkripzio-leherketa iragankorrak ikusten ditugu, non transkriptomaren induzigarritasuna (RDPI) eta espezializazioa (δj) 1-ean dauden. Orduetan eta dibertsitatean (Hj) igoera nabarmena izan zen une honetan, BMP1-en adierazpena nabarmen murriztu zen, eta ondoren transkriptomaren espezializazioaren erlaxazioa gertatu zen (S4 irudia). Gene metabolikoen familiek (adibidez, P450, glikosiltransferasa eta BAHD aziltransferasa) metabolismo primariotik eratorritako unitate estrukturaletatik metabolito bereziak muntatzeko prozesuan parte hartzen dute, aipatutako espezializazio handiko eredu goiztiarra jarraituz. Kasu-azterketa gisa, fenilalaninaren bidea aztertu zen. Analisiak baieztatu zuen fenolamida metabolismoaren gene nagusiak OS-ek eragin handia dutela belarjaleetan, erakarri gabeko landareekin alderatuta, eta haien adierazpen-ereduetan oso lerrokatuta daudela. Bide honen goialdean dauden MYB8 transkripzio-faktoreak eta PAL1, PAL2, C4H eta 4CL egitura-geneek transkripzioaren hasiera goiztiarra erakutsi zuten. Fenolamidaren azken muntaketan parte hartzen duten aziltransferasek, hala nola AT1, DH29 eta CV86, goranzko erregulazio-eredu luzea erakusten dute (S4 irudia). Goiko behaketek adierazten dute transkriptomaren espezializazioaren hasiera goiztiarra eta metabolomikako espezializazioaren geroagoko hobekuntza modu akoplatuak direla, eta hori defentsa-erantzun indartsu bat abiarazten duen erregulazio-sistema sinkronoaren ondorioz izan daitekeela.
Landare-hormonen seinaleztapenaren birkonfigurazioak belarjaleen informazioa integratzen duen geruza erregulatzaile gisa jokatzen du, landareen fisiologia birprogramatzeko. Belarjaleen simulazioaren ondoren, landare-hormonen kategoria nagusien dinamika metatua neurtu genuen eta haien arteko ko-adierazpen tenporala bistaratu genuen [Pearson korrelazio koefizientea (PCC) > 0.4] (3A irudia). Espero bezala, biosintesiarekin lotutako landare-hormonak landare-hormonen ko-adierazpen sarearen barruan lotuta daude. Horrez gain, espezifikotasun metabolikoa (Si indizea) sare honetan mapatzen da tratamendu ezberdinek eragindako landare-hormonak nabarmentzeko. Belarjaleen erantzun espezifikoaren bi eremu nagusi marrazten dira: bata JA multzoan dago, non JA-Ile (bere forma biologikoki aktiboa) eta beste JA deribatu batzuek Si puntuazio altuena erakusten duten; bestea etilenoa (ET) da. Giberelinak belarjaleen espezifikotasunean igoera moderatua baino ez zuen erakutsi, beste landare-hormona batzuek, hala nola zitozininak, auxinak eta azido abszisikoak, belarjaleen indukzio-espezifikotasun baxua izan zuten bitartean. W + W bakarrik erabiltzearekin alderatuta, JA deribatuen gailurraren balioaren anplifikazioa OS aplikazioaren bidez (W + OS) funtsean JAen adierazle espezifiko sendo bihur daiteke. Ustekabean, OSM eta OSS1 eliztore edukiera desberdinarekin JA eta JA-Ile metaketa antzekoa eragiten dutela ezagutzen da. OSS1ekin alderatuta, OSM OSMek espezifikoki eta sendo eragiten dute, OSS1ek, berriz, ez du oinarrizko zaurien erantzuna anplifikatzen (3B irudia).
(A) Belarjaleek eragindako landare-hormonen metaketa-zinetikaren simulazioaren PCC kalkuluan oinarritutako ko-adierazpen sarearen analisia. Nodoak landare-hormona bakarra adierazten du, eta nodoaren tamaina tratamenduen arteko landare-hormonaren Si indizea adierazten du. (B) JA, JA-Ile eta ET metaketa hostoetan tratamendu desberdinek eragindakoa, kolore desberdinekin adierazita: abrikota, W + OSM; urdina, W + OSSl; beltza, W + W; grisa, C (kontrola). Izartxoek tratamenduaren eta kontrolaren arteko desberdintasun esanguratsuak adierazten dituzte (bi norabideko ANOVA, ondoren Tukey HSD post hoc konparazio anizkoitza, *** P <0,001). (C)697 MS/MS-ren (S1 datu-fitxategia) informazio-teoriaren analisia JA biosintesian eta pertzepzio-espektro narriatuan (irAOC eta irCOI1) eta (D)585 MS/MS-ren (S1 datu-fitxategia) ETR1-en ET seinale narriatua duela. Bi belarjale tratamendu simulatuek landare-lerroak eta ibilgailu hutsak (EV) kontrol-landareak eragin zituzten. Izartxoek W+OS tratamenduaren eta kalterik gabeko kontrol-taldearen arteko desberdintasun esanguratsuak adierazten dituzte (bi norabideko ANOVA, ondoren Tukey HSD post hoc konparazio anizkoitza, *P<0,05, **P<0,01 eta ***P<0,001). (E) Espezializazioarekiko oposizio sakabanatuaren grafiko sakabanatuak. Koloreek genetikoki eraldatutako andui desberdinak adierazten dituzte; sinboloek tratamendu-metodo desberdinak: triangelua, W + OSS1; laukizuzena, W + OSM; zirkulua C
Ondoren, Nepenthes ahulduaren (irCOI1 eta sETR1) genetikoki eraldatutako andui bat erabili dugu JA eta ET biosintesiaren (irAOC eta irACO) eta pertzepzioaren (irCOI1 eta sETR1) urrats gakoetan bi landare-hormona hauen metabolismoa belarjaleetan aztertzeko. Birprogramazioaren ekarpen erlatiboa. Aurreko esperimentuekin bat etorriz, belarjale-OSaren indukzioa baieztatu dugu eramaile hutseko (EV) landareetan (3. irudia, C-tik D-ra) eta OSM-k eragindako Hj indizearen jaitsiera orokorra, δj indizea handitu den bitartean. Erantzuna OSS1-ek eragindako erantzuna baino nabarmenagoa da. Hj eta δj koordenatu gisa erabiltzen dituen bi lerroko grafiko batek desregulazio espezifikoa erakusten du (3E irudia). Joera nabarmenena da JA seinalerik gabeko anduietan belarjaleek eragindako metabolomaren dibertsitate eta espezializazio aldaketak ia erabat ezabatzen direla (3C irudia). Aitzitik, sETR1 landareetan ET pertzepzio isila, belarjaleen metabolismoaren aldaketetan duen eragin orokorra JA seinaleztapenarena baino askoz txikiagoa den arren, OSM eta OSS1 kitzikapenen arteko Hj eta δj indizeen aldea ahultzen du (3D irudia eta S5 irudia). Horrek adierazten du JA seinale transdukzioaren funtzio nagusiaz gain, ET seinale transdukzioak belarjaleen espezie espezifikoaren erantzun metabolikoaren doikuntza fin gisa ere balio duela. Doikuntza fin honen funtzioarekin bat etorriz, ez zen aldaketarik egon metabolomaren induzigarritasun orokorrean sETR1 landareetan. Bestalde, sETR1 landareekin alderatuta, irACO landareek belarjaleek eragindako aldaketa metabolikoen anplitude orokor antzekoak eragin zituzten, baina Hj eta δj puntuazio nabarmen desberdinak erakutsi zituzten OSM eta OSS1 erronken artean (S5 irudia).
Belarjaleen espezie-espezifiko erantzunean ekarpen garrantzitsuak dituzten metabolito espezializatuak identifikatzeko eta haien ekoizpena ET seinalen bidez doitzeko, aurretik garatutako MS/MS metodo estrukturala erabili genuen. Metodo honek bi-clustering metodoan oinarritzen da familia metabolikoa MS/MS zatietatik [normalizatutako puntu-produktua (NDP)] eta galera neutroan (NL) oinarritutako antzekotasun-puntuazioa berriro ondorioztatzeko. ET lerro transgenikoen analisi bidez eraikitako MS/MS datu-multzoak 585 MS/MS sortu zituen (S1 datu-fitxategia), eta zazpi MS/MS modulu nagusitan (M) multzokatuz ebatzi zen (4A irudia). Modulu horietako batzuk aurretik karakterizatutako metabolito bereziz beteta daude: adibidez, M1, M2, M3, M4 eta M7 hainbat fenol deribatutan (M1), flavonoide glukosidotan (M2), azil azukreetan (M3 eta M4) eta 17-HGL-DTG (M7) aberatsak dira. Gainera, modulu bakoitzeko metabolito bakar baten informazio metaboliko espezifikoa (Si indizea) kalkulatzen da, eta bere Si banaketa intuitiboki ikus daiteke. Laburbilduz, belarjale eta genotipo espezifikotasun handia erakusten duten MS/MS espektroak Si balio altuengatik bereizten dira, eta kurtosi estatistikek ilearen banaketa eskuineko isatsaren izkinan adierazten dute. Horrelako koloideen banaketa gihartsu bat detektatu zen M1-en, non fenol amidak Si frakzio handiena erakutsi zuen (4B irudia). Aurretik aipatutako belarjale induzigarri den 17-HGL-DTG M7-n Si puntuazio moderatua erakutsi zuen, bi OS moten arteko erregulazio diferentzial maila moderatua adieraziz. Aitzitik, era konstitutiboan sortutako metabolito espezializatu gehienak, hala nola rutina, CGA eta azil azukreak, Si puntuazio baxuenen artean daude. Metabolito berezien arteko egitura-konplexutasuna eta Si banaketa hobeto aztertzeko, sare molekular bat eraiki zen modulu bakoitzerako (4B irudia). OD teoriaren iragarpen garrantzitsu bat (1B irudian laburbilduta) da belarjaleen ondorengo metabolito berezien berrantolaketak defentsa-balio handiko metabolitoetan norabide bakarreko aldaketak ekarriko dituela, batez ere haien espezifikotasuna handituz (ausazko banaketaren aldean) Modua) MT teoriak iragarritako metabolito defentsiboa. M1-en metatutako fenol deribatu gehienak intsektuen errendimenduaren beherakadarekin lotuta daude funtzionalki (32). M1 metabolitoetako Si balioak hosto induzituen eta EV kontrol-landareen hosto osagaien artean 24 ordutan alderatzean, ikusi genuen metabolito askoren espezifikotasun metabolikoak goranzko joera nabarmena duela intsektu belarjaleen ondorengoetan (4C irudia). Si balioaren igoera espezifikoa fenolamida defentsiboetan bakarrik detektatu zen, baina ez zen Si balioaren igoerarik detektatu modulu honetan koexistitzen diren beste fenol eta metabolito ezezagunetan. Hau eredu espezializatua da, OD teoriarekin lotuta dagoena. Belarjaleek eragindako aldaketa metabolikoen iragarpen nagusiak koherenteak dira. Fenolamida espektroaren berezitasun hau OS-espezifiko ET-k eragin ote zuen probatzeko, Si metabolitoaren indizea irudikatu genuen eta OSM eta OSS1 arteko adierazpen-balio diferentzial bat eragin genuen EV eta sETR1 genotipoetan (4D irudia). sETR1-en, fenamidak eragindako OSM eta OSS1 arteko aldea asko murriztu zen. Bi-klusterizazio metodoa JA nahikoa ez zuten anduietan bildutako MS/MS datuetan ere aplikatu zen, JA-k erregulatutako espezializazio metabolikoarekin lotutako MS/MS modulu nagusiak ondorioztatzeko (S6 irudia).
(A) 585 MS/MS-ren multzokatze-emaitzek, zati partekatuetan (NDP antzekotasunean) eta galera neutro partekatuan (NL antzekotasunean) oinarrituta, modulua (M) konposatu-familia ezagunarekin koherentea dela ondorioztatzen dute, edo metabolitoen konposizio ezezagun edo gaizki metabolizatua dela. Modulu bakoitzaren ondoan, metabolitoaren (MS/MS) banaketa espezifikoa (Si) erakusten da. (B) Sare molekular modularra: Nodoek MS/MS eta ertzak adierazten dituzte, NDP (gorria) eta NL (urdina) MS/MS puntuazioak (muga, > 0,6). Metabolitoen espezifikotasun-indize mailakatua (Si) moduluaren arabera koloreztatua (ezkerrean) eta sare molekularrean mapatua (eskuinean). (C) EV landarearen M1 modulua egoera konstitutiboan (kontrola) eta induzituan (belarjale simulatua) 24 ordutan: sare molekularraren diagrama (Si balioa nodoaren tamaina da, fenolamida defentsiboa urdinez nabarmenduta dago). (D) sETR1 espektro-lerroaren M1 sare molekularraren diagrama, EV eta ET pertzepzio urriarekin: zirkulu berdeko nodoak irudikatutako konposatu fenolikoa, eta W + OSM eta W + OSS1 tratamenduen arteko aldea (P balioa) nodoaren tamainari dagokionez. CP, N-kafeoil-tirosina; CS, N-kafeoil-espermidina; FP, N-feruliko azido ester-urikoa; FS, N-ferulil-espermidina; CoP, N', N “-kumarolil-tirosina; DCS, N', N”-dikafeoil-espermidina; CFS, N', N”-kafeoil, feruloil-espermidina; Lycium barbarum owlberry Son-en; Nick. O-AS, O-azil azukrea.
Nepenthes genotipo ahuldu bakar batetik populazio naturaletara zabaldu genuen analisia, non belarjaleen JA mailetan eta metabolito espezifikoen mailatan aldaketa intraespezifiko sendoak deskribatu diren aurretik populazio naturaletan (26). Erabili datu multzo hau 43 germoplasma aztertzeko. Germoplasma hauek N. pallens-eko 123 landare espeziez osatuta daude. Landare hauek Utah, Nevada, Arizona eta Kaliforniako habitat natibo desberdinetan bildutako hazietatik hartu ziren (S7 irudia), metabolomaren dibertsitatea (hemen populazio maila deitzen zaio) β dibertsitatea) eta OSM-k eragindako espezializazioa kalkulatu genituen. Aurreko ikerketekin bat etorriz, aldaketa metaboliko sorta zabala ikusi genuen Hj eta δj ardatzetan zehar, eta horrek adierazten du germoplasmek belarjaleekiko erantzun metabolikoen plastizitatean alde nabarmenak dituztela (S7 irudia). Antolaketa honek belarjaleek eragindako JA aldaketen sorta dinamikoari buruzko aurreko behaketak gogorarazten ditu, eta balio oso altua mantendu du populazio bakarrean (26, 36). JA eta JA-Ile erabiliz Hj eta δj arteko korrelazio orokorra probatzeko, ikusi genuen JAren eta metabolomaren β dibertsitate eta espezializazio indizearen artean korrelazio positibo esanguratsua dagoela (S7 irudia). Horrek iradokitzen du populazio mailan detektatutako JA indukzioan belarjaleek eragindako heterogeneotasuna intsektu belarjaleen hautaketak eragindako polimorfismo metaboliko gakoen ondorio izan daitekeela.
Aurreko ikerketek erakutsi dute tabako motak oso desberdinak direla motari eta defentsa metaboliko induzitu eta eratzaileen menpekotasun erlatiboari dagokionez. Uste da belarjaleen aurkako seinaleen transdukzio eta defentsa gaitasunetan izandako aldaketa hauek intsektuen populazioaren presioak, landareen bizi-zikloak eta espezie jakin bat hazten den nitxoko defentsa-ekoizpen kostuek erregulatzen dituztela. Ipar Amerikako eta Hego Amerikako sei Nicotiana espezieren hostoen metabolomaren birmoldaketaren koherentzia aztertu genuen. Espezie hauek Ipar Amerikako Nepenthes-ekin estuki lotuta daude, hots, Nicolas Bociflo. La, N. nicotinis, Nicotiana n. belar ahuldua, Nicotiana tabacum, tabako lineala, tabakoa (Nicotiana spegazzinii) eta tabako hosto-tabakoa (Nicotiana obtusifolia) (5A irudia) (37). Espezie horietatik sei, ondo karakterizatutako N. please espeziea barne, petunia kladoko urteko landareak dira, eta obtusifolia N. Trigonophyllae ahizpa kladoko landare iraunkorrak dira (38). Ondoren, W + W, W + OSM eta W + OSS1 indukzioa egin zen zazpi espezie hauetan intsektuen elikaduraren espezie-mailako birmoldaketa metabolikoa aztertzeko.
(A) [glutamina nuklearraren sintesirako (38)] eta zazpi Nicotiana espezie estuki erlazionatuen banaketa geografikoan oinarritutako bootstrap zuhaitz filogenetikoa (kolore desberdinak) (37). (B) Zazpi Nicotiana espezieren profil metabolikoetarako dibertsitate espezializatuaren dispertsio-diagrama (939 MS/MS; S1 datu-fitxategia). Espezie mailan, metabolomaren dibertsitatea negatiboki korrelazionatuta dago espezializazio-mailarekin. Dibertsitate metabolikoaren eta espezializazioaren eta JA metaketaren arteko espezie-mailako korrelazioaren analisia 2. irudian ageri da. S9. Kolorea, mota desberdinak; triangelua, W + OSS1; laukizuzena, W + OSM; (C) Nicotiana JA eta JA-Ile dinamika OS kitzikapen-anplitudearen arabera sailkatuta daude (bi norabideko ANOVA eta Tukey HSD anizkoitz osteko konparaketa, * P <0,05, ** P <0,01 eta * ** W + OS eta W + W konparatzeko, P <0,001). Espezie bakoitzaren (D) dibertsitatearen eta (E) espezializazioaren kaxa-diagrama, belarjalea eta metil JA (MeJA) simulatu ondoren. Izartxoak W + OS eta W + W edo lanolina gehi W (Lan + W) edo Lan gehi MeJA (Lan + MeJa) eta Lan kontrolaren arteko aldea esanguratsua adierazten du (bariantzien bi norabideko analisia, eta ondoren Tukey-ren HSD post hoc konparazio anizkoitza, *P<0,05, **P<0,01 eta ***P<0,001).
Kluster bikoitzaren metodoa erabiliz, 939 MS/MSko 9 modulu identifikatu genituen (S1 datu fitxategia). Tratamendu ezberdinek birkonfiguratutako MS/MSren osaera asko aldatzen da espezieen arteko moduluen artean (S8 irudia). Hj (hemen espezie-mailako γ-aniztasuna deitua) eta δj bistaratzeak erakusten du espezie desberdinak talde oso desberdinetan biltzen direla espazio metabolikoan, non espezie-mailako banaketa normalean kitzikapena baino nabarmenagoa den. N. linear eta N. obliquus izan ezik, indukzio-efektuen gama dinamiko zabala erakusten dute (5B irudia). Aldiz, N. purpurea eta N. obtusifolia bezalako espezieek tratamenduarekiko erantzun metaboliko ez hain agerikoa dute, baina metaboloma anitzagoa da. Induzitutako erantzun metabolikoaren espezie-espezifiko banaketak espezializazioaren eta gamma dibertsitatearen arteko korrelazio negatibo esanguratsua eragin zuen (PCC = -0,46, P = 4,9×10-8). JA mailetan OS-k eragindako aldaketak positiboki korrelazionatuta daude metabolomaren espezializazioarekin, eta negatiboki korrelazionatuta espezie bakoitzak erakusten duen gamma dibertsitate metabolikoarekin (5B irudia eta S9 irudia). Aipatzekoa da 5C irudian "seinale-erantzun" espezie gisa aipatzen diren espezieek, hala nola Nepenthes nematodoek, Nepenthes nepenthesek, Nepenthes akutuak eta Nepenthes ahulduak, seinale esanguratsuak eragin zituztela 30 minututan. Duela gutxiko OS espezifiko JA eta JA-Ile agerraldiek, "seinale-erantzunik gabeko" izeneko beste bakterio batzuek, hala nola Nepenthes millsek, Nepenthes powderyk eta N. obtusifoliak, JA-Ile Edge indukzioa baino ez dute erakusten, OS espezifikotasunik gabe (5C irudia). Maila metabolikoan, goian aipatu bezala, Nepenthes ahulduarentzat, seinale-erantzukizuneko substantziek OS espezifikotasuna erakutsi zuten eta δj nabarmen handitu zuten, Hj murriztuz. OS espezifiko priming efektu hau ez zen detektatu seinale-erreaktibo ez diren espezie gisa sailkatutako espezieetan (5. irudia, D eta E). OS-espezifiko metabolitoak maizago partekatzen dira seinaleei erantzuten dieten espezieen artean, eta seinale multzo hauek seinale erantzun ahulagoak dituzten espezieekin multzokatzen dira, seinale erantzun ahulagoak dituzten espezieek elkarrekiko menpekotasun txikiagoa erakusten duten bitartean (S8 irudia). Emaitza honek adierazten du JA-en OS-espezifiko indukzioa eta beheranzko metabolomaren OS-espezifiko birkonfigurazioa espezie mailan akoplatuta daudela.
Ondoren, metil JA (MeJA) duen lanolina pasta bat erabili genuen landareak tratatzeko, akoplamendu modu horiek landareen zitoplasman egongo den JA exogenoak aplikatutako JAren erabilgarritasunak mugatzen dituen ikertzeko. Desesterifikazio azkarra JA da. Seinaleei erantzuten dieten espezieetatik seinaleei erantzuten ez dieten espezieetara pixkanaka aldatzen den joera bera aurkitu genuen, JAren etengabeko hornidurak eraginda (5. irudia, D eta E). Laburbilduz, MeJA tratamenduak N. obliquus, N. aquaticus, N. pallens eta N. mikimotoi nematodo linealen metabolomak birprogramatu zituen, δj-ren igoera nabarmena eta Hj-ren jaitsiera eraginez. N. purpurea-k δj-ren igoera baino ez zuen erakutsi, baina ez Hj. N. obtusifolia-k, aurretik JA maila oso baxuak metatzen dituela frogatu denak, MeJA tratamenduari ere gaizki erantzuten dio metabolomaren birkonfigurazioari dagokionez. Emaitza hauek adierazten dute JA ekoizpena edo seinaleen transdukzioa fisiologikoki mugatuta dagoela seinaleei erantzuten ez dieten espezieetan. Hipotesi hau probatzeko, W + W, W + OSM eta W + OSS1 Transkriptomak (39) eragindako lau espezieak (N. pallens, N. mills, N. pink eta N. microphylla) aztertu genituen. Metabolomaren birmoldaketaren ereduarekin bat etorriz, espezieak ondo bereizita daude transkriptomaren espazioan, eta horien artean N. attenuated-ek erakutsi zuen OS-induzitutako RDPI altuena, eta N. gracilis-ek, berriz, baxuena (6A irudia). Hala ere, ikusi zen N. oblonga-k eragindako transkriptomaren dibertsitatea lau espezieen artean baxuena zela, N. oblonga-ren zazpi espezietan lehenago erakutsitako metabonomiko dibertsitate handienaren aurka. Aurreko ikerketek erakutsi dute hasierako defentsa-seinaleekin lotutako gene multzo batek, JA seinaleak barne, azaltzen duela Nicotiana espezieetan belarjaleekin lotutako elizitatzaileek eragindako hasierako defentsa-erantzunen espezifikotasuna (39). Lau espezie hauen arteko JA seinaleztapen-bideak alderatzeak eredu interesgarri bat agerian utzi zuen (6B irudia). Bide honetako gene gehienek, hala nola AOC, OPR3, ACX eta COI1, indukzio maila nahiko altuak erakutsi zituzten lau espezie hauetan. Hala ere, JAR4 gene gako batek JA JA-Ile transkripzio metatuen forma biologikoki aktiboan bihurtzen du, eta bere transkripzio maila oso baxua da, batez ere N. mills, Nepenthes pieris eta N. microphylla-n. Gainera, beste AOS gene baten transkripzioa bakarrik ez zen detektatu N. bifidum-en. Geneen adierazpenaren aldaketa hauek izan daitezke seinale anergiko espezieetan JA ekoizpen baxuak eta N. gracilis-en indukzioak eragindako fenotipo muturrekoen erantzule.
(A) Belarjaleen indukzioa egin eta 30 minutura lagindutako lau tabako espezieen transkripzio-erantzun goiztiarren birprogramazioaren informazio-teoriaren analisia. RDPI belarjaleen OSak eragindako hostoak zauri-kontrolarekin alderatuz kalkulatzen da. Koloreek espezie desberdinak adierazten dituzte, eta sinboloek tratamendu-metodo desberdinak. (B) Lau espezieen arteko JA seinaleztapen-bideetako geneen adierazpenaren analisia. JA bide sinplifikatua kaxa-diagramaren ondoan erakusten da. Kolore desberdinek prozesatzeko metodo desberdinak adierazten dituzte. Izartxoak W + OS tratamenduaren eta W + W kontrolaren artean alde nabarmena dagoela adierazten du (bikoteka desberdintasunetarako Student-en t-probarako, *P<0,05, **P<0,01 eta ***P<0,001). OPDA, azido 12-oxofitodienoikoa; OPC-8: azido 0,3-oxo-2(2′(Z)-pentenil)-ziklopentano-1-oktanoikoa.
Azken zatian, landare-espezie desberdinen metabolomaren birmoldaketa intsektu-espezie espezifikoak nola erresistentea izan daitekeen belarjaleekiko aztertu genuen. Aurreko ikerketek Nicotiana generoa azpimarratu zuten. Ms-rekiko eta larbekiko duten erresistentzia oso desberdina da (40). Hemen, eredu honen eta haien plastizitate metabolikoaren arteko lotura aztertu dugu. Goiko lau tabako-espezieak erabiliz, eta belarjaleek eragindako metabolomaren dibertsitatearen eta espezializazioaren eta landareek Ms-rekiko duten erresistentziaren arteko korrelazioa probatuz, aurkitu genuen erresistentzia, dibertsitatea eta espezializazioa Sl generalistarekiko. Guztiak positiboki korrelazionatuta daudela, emakume adituekiko erresistentziaren eta espezializazioaren arteko korrelazioa ahula den bitartean, eta dibertsitatearekiko korrelazioa ez da esanguratsua (S10 irudia). S1 erresistentziari dagokionez, N. chinensis eta N. gracilis ahulduek, aurretik JA seinale-transdukzio mailak eta metabolomaren plastizitatea erakusten zituztela erakutsi zenek, erantzun oso desberdinak izan zituzten belarjaleen indukzioarekiko, eta erresistentzia handia ere erakutsi zuten. Sexua.
Azken hirurogei urteotan, landareen defentsaren teoriak esparru teoriko bat eman du, eta bertan oinarritu dira ikertzaileek landareen metabolito espezializatuen bilakaera eta funtzio ugari iragarri dituztenak. Teoria horietako gehienek ez dute inferentzia sendoen ohiko prozedura jarraitzen (41). Gako-iragarpenak (3) proposatzen dituzte analisi-maila berean. Gako-iragarpenen probak teoria espezifikoak aztertzea ahalbidetzen duenean, horrek eremua aurrera doa. Onartuko da, baina beste batzuk baztertuko ditu (42). Horren ordez, teoria berriak analisi-maila desberdinetan egiten ditu iragarpenak eta deskriptibo-kontsiderazioen geruza berri bat gehitzen du (42). Hala ere, maila funtzionalean proposatutako bi teoriak, MT eta OD, erraz azal daitezke belarjaleek eragindako aldaketa metaboliko espezializatuen iragarpen garrantzitsu gisa: OD teoriak uste du "espazio" metaboliko espezializatuan izandako aldaketak oso norabidezkoak direla. MT teoriak uste du aldaketa horiek norabiderik gabekoak izango direla eta ausaz kokatuko direla espazio metabolikoan, eta defentsa-balio handiko metabolitoak izateko joera dutela. OD eta MT iragarpenen aurreko azterketak a priori "defentsa" konposatu multzo estu bat erabiliz probatu dira. Metabolitoetan oinarritutako proba hauek ez dute uzten belarjaleen elikaduran zehar metabolomaren birkonfigurazioaren hedadura eta ibilbidea aztertzen, eta ez dute uzten marko estatistiko koherente batean egindako probak egitea landareen metabolomaren aldaketak kuantifikatzeko osotasun gisa har daitezkeen iragarpen gakoak behar direnik. Hemen, metabolomikako teknologia berritzailea erabili dugu MS konputazionalean oinarrituta eta dekonboluzio MS analisia egin dugu informazio-teoriaren deskriptoreen balio orokorrean, metabolomika maila globalean proposatutako bien arteko bereizketa probatzeko. Teoria honen iragarpen gakoa. Informazio-teoria arlo askotan aplikatu da, batez ere biodibertsitatearen eta mantenugaien fluxuaren ikerketaren testuinguruan (43). Hala ere, dakigunez, hau da landareen informazio metabolikoaren espazioa deskribatzeko eta ingurumen-seinaleei erantzunez aldi baterako aldaketa metabolikoekin lotutako arazo ekologikoak konpontzeko erabiltzen den lehen aplikazioa. Bereziki, metodo honen gaitasuna landare-espezieen barruko eta arteko ereduak alderatzeko duen gaitasunean datza, belarjaleak espezie desberdinetatik espezie arteko makroeboluzio-ereduetara nola eboluzionatu duten aztertzeko, eboluzio-maila desberdinetan. Metabolismoa.
Osagai nagusien analisiak (PCA) datu-multzo multibariagarri bat dimentsio-murrizketa espazio bihurtzen du, datuen joera nagusia azaldu ahal izateko, beraz, normalean teknika esploratzaile gisa erabiltzen da datu-multzoa aztertzeko, hala nola dekonboluzio metaboloma. Hala ere, dimentsio-murrizketak datu-multzoko informazio-edukiaren zati bat galduko du, eta PCAk ezin du informazio kuantitatiboa eman teoria ekologikoarentzat bereziki garrantzitsuak diren ezaugarriei buruz, hala nola: nola belarjaleek aniztasuna birkonfiguratzen duten eremu espezializatuetan (adibidez, aberastasuna, banaketa eta ugaritasuna) metabolitoetan? Zein metabolito dira belarjale jakin baten egoera induzituaren iragarleak? Espezifikotasunaren, dibertsitatearen eta induzigarritasunaren ikuspegitik, hosto espezifikoen metabolito-profilaren informazio-edukia deskonposatzen da, eta belarjaleen janariak metabolismo espezifikoa aktibatu dezakeela ikusten da. Ustekabean, ikusi genuen, inplementatutako informazio-teoriaren adierazleetan deskribatzen den bezala, ondoriozko egoera metabolikoak gainjartze handia duela bi belarjaleen erasoen ondoren (gauez elikatzen den Sl generalista) eta Solanaceae aditua den Ms. Nahiz eta haien elikadura-portaera eta kontzentrazioa nabarmen desberdinak izan. Gantz-azido konjugatu (FAC) abiarazlea OS-n (31). Belarjale OS erabiliz zauri zulatu estandarizatuak tratatzeko, belarjaleen tratamendu simulatuak ere joera antzekoa erakutsi zuen. Belarjaleen erasoei landareen erantzuna simulatzeko prozedura estandarizatu honek belarjaleen elikadura-portaeran izandako aldaketek eragindako nahasmen-faktoreak ezabatzen ditu, eta horiek kalte-maila desberdinak eragiten dituzte une desberdinetan (34). OSM-ren kausa nagusia dela ezagutzen den FAC-ek JAS eta beste landare-hormoneen erantzunak murrizten ditu OSS1-en, OSS1-ek ehunka aldiz murrizten duen bitartean (31). Hala ere, OSS1-ek JA metaketa-maila antzekoak eragin zituen OSM-rekin alderatuta. Aurretik frogatu da Nepenthes ahulduan JA erantzuna oso sentikorra dela OSM-rekiko, non FAC-ek bere jarduera mantendu dezakeen urarekin 1:1000 diluituta egon arren (44). Beraz, OSM-rekin alderatuta, OSS1-eko FAC oso baxua den arren, nahikoa da JA agerraldi nahikoa eragiteko. Aurreko ikerketek erakutsi dute porina itxurako proteinak (45) eta oligosakaridoak (46) OSS1-en landareen defentsa-erantzunak abiarazteko arrasto molekular gisa erabil daitezkeela. Hala ere, oraindik ez dago argi OSS1-eko eragile hauek egungo ikerketan ikusi den JA metaketaren erantzule diren ala ez.
Belarjale desberdinen edo JA edo SA (azido salizilikoa) aplikazio exogenoak eragindako hatz-marka metaboliko desberdinak deskribatzen dituzten ikerketa gutxi dauden arren (47), inork ez du landare-belar sarean belarjaleen espezie espezifikoen perturbazioa eta informazio pertsonal espezifikoan dituen ondorioak asaldatu. Metabolismoaren eragin orokorra sistematikoki aztertzen da. Analisia honek are gehiago baieztatu du JA-ez besteko landare-hormonekin duen barne-hormona-sarearen konexioak belarjaleek eragindako berrantolaketa metabolikoaren espezifikotasuna moldatzen duela. Bereziki, detektatu dugu OSM-k eragindako ET OSS1-ek eragindakoa baino nabarmen handiagoa zela. Modu hau OSM-n FAC eduki gehiagorekin bat dator, eta hori baldintza beharrezkoa eta nahikoa da ET eztanda bat eragiteko (48). Landareen eta belarjaleen arteko elkarrekintzaren testuinguruan, ET-k landare-metabolitoen dinamikan duen seinaleztapen-funtzioa oraindik esporadikoa da eta konposatu-talde bakarra du helburu. Gainera, ikerketa gehienek ET-ren edo bere aitzindarien edo hainbat inhibitzaileren aplikazio exogenoa erabili dute ET-ren erregulazioa aztertzeko, eta horien artean aplikazio kimiko exogeno hauek albo-ondorio ez-espezifiko asko sortuko dituzte. Gure ezagutzaren arabera, ikerketa honek ET-k landare transgeniko narriatuak ekoizteko eta hautemateko ET-ren erabileran duen eginkizunaren lehen azterketa sistematiko eskala handia adierazten du, landareen metabolomaren dinamika koordinatzeko. Belarjaleen ET indukzioak, azken finean, metabolomaren erantzuna modula dezake. Garrantzitsuena ET biosintesiaren (ACO) eta pertzepzioaren (ETR1) geneen manipulazio transgenikoa da, belarjaleen fenolamiden de novo metaketa agerian utzi duena. Aurretik erakutsi da ET-k JA-k eragindako nikotina metaketa doitzen duela putreszina N-metiltransferasa erregulatuz (49). Hala ere, ikuspuntu mekaniko batetik, ez dago argi nola doitzen duen ET-k fenamidaren indukzioa. ET-ren seinale transdukzio funtzioaz gain, fluxu metabolikoa S-adenosil-1-metioninara ere desbideratu daiteke poliaminofenol amiden inbertsioa erregulatzeko. S-adenosil-1-metionina ET da eta poliamina biosintesi bidearen bitartekari arrunta. ET seinaleak fenolamida maila erregulatzen duen mekanismoak azterketa gehiago behar ditu.
Denbora luzez, egitura ezezaguneko metabolito berezi kopuru handia dela eta, kategoria metaboliko espezifikoei arreta handia jarri izanak ez du lortu elkarrekintza biologikoen ondoren dibertsitate metabolikoaren denborazko aldaketak zorrotz ebaluatzea. Gaur egun, informazio-teoriaren analisian oinarrituta, metabolito inpartzialetan oinarritutako MS/MS espektroaren eskuratzearen emaitza nagusia da belarjaleek belarjaleak jaten edo simulatzen dituztenek hosto-metabolomaren dibertsitate metaboliko orokorra murrizten jarraitzen dutela, bere espezializazio-maila handituz. Belarjaleek eragindako metabolomaren espezifikotasunaren aldi baterako igoera hau transkriptomaren espezifikotasunaren igoera sinergiko batekin lotuta dago. Metabolomaren espezializazio handiago honetan gehien laguntzen duen ezaugarria (Si balio handiagoa izatea) aurretik karakterizatutako funtzio belarjalea duen metabolito berezia da. Eredu hau OD teoriaren iragarpenarekin bat dator, baina metabolomaren birprogramazioaren ausazkotasunarekin lotutako MTren iragarpena ez da koherentea. Hala ere, datu hau eredu mistoaren iragarpenarekin ere bat dator (MT onena; 1B irudia), defentsa-funtzio ezezagunak dituzten beste metabolito ez-karakterizatu batzuek Si banaketa ausazkoa jarrai dezaketelako oraindik.
Ikerketa honek gehiago jasotzen duen eredu aipagarri bat da mikroeboluzio mailatik (landare bakarra eta tabako populazioa) eboluzio eskala handiago bateraino (tabako espezie estuak), eboluzio antolakuntza maila desberdinak direla "defentsa onena". Belarjaleen gaitasunetan alde nabarmenak daude. Moore et al. (20) eta Kessler eta Kalske-k (1) modu independentean proposatu zuten Whittakerrek (50) jatorriz bereizitako biodibertsitatearen hiru maila funtzionalak dibertsitate kimikoaren aldaketa tenporal konstitutibo eta induzitu bihurtzea; egile hauek ez zuten laburbildu. Eskala handiko metabolomaren datuak biltzeko prozedurek ere ez dute zehazten nola kalkulatu dibertsitate metabolikoa datu horietatik abiatuta. Ikerketa honetan, Whittakerren sailkapen funtzionalean egindako doikuntza txikiek α-dibertsitate metabolikoa landare jakin bateko MS/MS espektroen dibertsitate gisa hartuko dute kontuan, eta β-dibertsitate metabolikoa populazio talde baten oinarrizko metabolismo intraespezifiko gisa. Espazioa, eta γ-dibertsitate metabolikoa espezie antzekoen analisi baten luzapena izango da.
JA seinalea ezinbestekoa da belarjaleen erantzun metaboliko sorta zabal baterako. Hala ere, ez dago JA biosintesiaren erregulazio intraespezifikoak metabolomaren dibertsitateari egiten dion ekarpenaren proba kuantitatibo zorrotzik, eta JA seinalea estresak eragindako dibertsifikazio metabolikorako gune orokorra den ala ez makroeboluzio eskala handiago batean oraindik ez da argitzen. Ikusi genuen Nepenthes belarjalearen izaera belarjaleak metabolomaren espezializazioa eragiten duela eta metabolomaren espezializazioaren aldakuntza Nicotiana espezieen populazioan eta Nicotiana espezieen artean sistematikoki positiboki korrelazionatzen dela JA seinaleztapenarekin. Gainera, JA seinalea kaltetuta dagoenean, genotipo belarjale bakar batek eragindako espezifikotasun metabolikoa ezeztatuko da (3. irudia, C eta E). Naturalki ahuldutako Nepenthes populazioen espektro metabolikoaren aldaketak gehienbat kuantitatiboak direnez, analisi honetan β dibertsitate eta espezifikotasun metabolikoan izandako aldaketak neurri handi batean metabolitoetan aberatsak diren konposatu kategorien kitzikapen sendoak eragin ditzake. Konposatu klase hauek metabolomaren profilaren zati bat menderatzen dute eta JA seinaleekin korrelazio positiboa eragiten dute.
Tabako espezieen mekanismo biokimikoak oso desberdinak direnez, metabolitoak alderdi kualitatiboan identifikatzen dira zehazki, beraz, analitikoagoa da. Informazio-teoriak hartutako profil metabolikoa prozesatzea erakusten du belarjaleen indukzioek areagotzen dutela gamma metabolikoaren dibertsitatearen eta espezializazioaren arteko oreka. JA seinaleak zeregin garrantzitsua du oreka honetan. Metabolomaren espezializazioaren igoera OD iragarpen nagusiarekin bat dator eta positiboki korrelazionatuta dago JA seinalearekin, JA seinalea negatiboki korrelazionatuta dagoen bitartean gamma metabolikoaren dibertsitatearekin. Eredu hauek adierazten dute landareen OD gaitasuna batez ere JAren plastizitateak zehazten duela, mikroeboluzio eskalan edo eboluzio eskala handiago batean. JA biosintesi akatsak saihesten dituzten JA aplikazio exogenoen esperimentuek agerian uzten dute estuki lotutako tabako espezieak seinalearekiko sentikorrak diren eta seinalearekiko sentikorrak ez diren espezieetan bereiz daitezkeela, belarjaleek eragindako JA modua eta metabolomaren plastizitatea bezala. Seinalearekiko sentikorrak ez diren espezieek ezin dute erantzun JA endogenoa ekoizteko ezintasunagatik eta, beraz, muga fisiologikoen menpe daude. Baliteke hau JA seinaleztapen bideko gene gako batzuen mutazioek (AOS eta JAR4 N. crescens-en) eraginda egotea. Emaitza honek azpimarratzen du espezie arteko makroeboluzio-eredu hauek batez ere barne-hormonen pertzepzioan eta erantzun-gaitasunean izandako aldaketek eragin ditzaketela.
Landareen eta belarjaleen arteko elkarrekintzaz gain, dibertsitate metabolikoaren azterketa ingurumenarekiko egokitzapen biologikoaren ikerketan eta ezaugarri fenotipo konplexuen bilakaeran izandako aurrerapen teoriko garrantzitsu guztiekin lotuta dago. MS tresna modernoek eskuratutako datu kopurua handitzearekin batera, dibertsitate metabolikoari buruzko hipotesi probak egiteak orain banakako/kategoria metabolitoen arteko desberdintasunak gainditu ditzake eta analisi globala egin dezake ustekabeko ereduak agerian uzteko. Eskala handiko analisi prozesuan, metafora garrantzitsu bat datuak aztertzeko erabil daitezkeen mapa esanguratsuak sortzeko ideia da. Beraz, MS/MS metabolomika inpartzialaren eta informazio teoriaren egungo konbinazioaren emaitza garrantzitsu bat da metrika sinple bat eskaintzen duela, mapak eraikitzeko erabil daitekeena dibertsitate metabolikoa eskala taxonomiko desberdinetan arakatzeko. Metodo honen oinarrizko eskakizuna da. Mikro/makro eboluzioaren eta komunitate ekologiaren azterketa.
Makro-eboluzio mailan, Ehrlich eta Ravenen (51) landare-intsektuen ko-eboluzio teoriaren muina espezie arteko dibertsitate metabolikoaren aldakuntza landare-lerroen dibertsifikazioaren kausa dela aurreikustea da. Hala ere, lan garrantzitsu hau argitaratu zenetik berrogeita hamar urte igaro direnean, hipotesi hau gutxitan probatu da (52). Hau neurri handi batean distantzia luzeko landare-lerroetan zehar dauden ezaugarri metaboliko konparagarrien ezaugarri filogenetikoengatik da. Arrarotasun hori erabil daiteke helburu-analisi metodoak finkatzeko. Informazio-teoriak prozesatzen duen egungo MS/MS lan-fluxuak metabolito ezezagunen MS/MS egitura-antzekotasuna kuantifikatzen du (aurretik metabolitoen hautaketarik gabe) eta MS/MS horiek MS/MS multzo batean bihurtzen ditu, horrela metabolismo profesionalean makro-eboluzio eredu hauek sailkapen-eskalan alderatzen dira. Adierazle estatistiko sinpleak. Prozesua analisi filogenetikoaren antzekoa da, eta horrek sekuentzien lerrokatzea erabil dezake dibertsifikazio-tasa edo karaktereen eboluzioa kuantifikatzeko, aldez aurretiko iragarpenik gabe.
Maila biokimikoan, Firn eta Jonesen (53) bahetze-hipotesiak erakusten du dibertsitate metabolikoa maila desberdinetan mantentzen dela, lehenago erlazionatu gabeko edo ordezkatutako metabolitoen jarduera biologikoak gauzatzeko lehengaiak emateko. Informazio-teoriaren metodoek esparru bat eskaintzen dute, non metabolitoen espezializazioan zehar gertatzen diren metabolito espezifikoen eboluzio-trantsizio horiek kuantifikatu daitezkeen proposatutako eboluzio-bahetze prozesuaren barruan: egokitzapen biologikoki aktiboa espezifikotasun baxutik espezifikotasun handiko ingurune jakin bateko metabolito inhibituak.
Oro har, biologia molekularraren lehen egunetan, landareen defentsarako teoria garrantzitsuak garatu ziren, eta hipotesi deduktiboetan oinarritutako metodoak aurrerapen zientifikorako bide bakarra direla uste da. Hau neurri handi batean metaboloma osoa neurtzearen muga teknikoengatik da. Hipotesietan oinarritutako metodoak beste mekanismo kausal batzuk aukeratzeko bereziki erabilgarriak diren arren, sare biokimikoen ulermena aurreratzeko duten gaitasuna mugatuagoa da gaur egungo datu-intentsiboko zientzian eskuragarri dauden metodo konputazionalak baino. Beraz, aurreikusi ezin diren teoriak eskuragarri dauden datuen esparrutik haratago daude, beraz, ikerketa-arloko aurrerapenaren formula/proba ziklo hipotetikoa ezin da deuseztatu (4). Aurreikusten dugu hemen aurkeztutako metabolomikaren lan-fluxu konputazionalak aniztasun metabolikoaren azken (nola) eta azken (zergatik) gaiekiko interesa berpiztu dezakeela, eta datu-zientzia teorikoki gidatuaren aro berri bati lagun diezaiokeela. Aro horrek aurreko belaunaldiak inspiratu zituzten teoria garrantzitsuak berriro aztertu zituen.
Belarjaleen zuzeneko elikadura arrosa-loratzen ari den landare bakar baten pitxer-landare zurbilaren hosto bakar batean bigarren mailako larba edo Sl larba bat haztean egiten da, landare bakoitzeko 10 landare-errepikapenekin. Intsektu-larbak pintzekin lotu ziren, eta gainerako hosto-ehuna infekzioaren ondorengo 24 eta 72 orduetan bildu eta azkar izoztu zen, eta metabolitoak erauzi ziren.
Simulatu belarjaleen tratamendua modu oso sinkronizatuan. Metodoa oihal-ereduzko gurpilak erabiltzea da, landarearen hiru hosto guztiz zabalduen erdiko nerbioaren alde bakoitzean hiru arantza-ilara zulatzeko, oihal-girlandaren hazkuntza-fasean, eta berehala 1:5 Ms Diluitua aplikatzea. Edo eskularrudun hatzak erabili S1 OS zulaketa-zaurian sartzeko. Bildu eta prozesatu hosto bat goian deskribatutako moduan. Erabili aurretik deskribatutako metodoa metabolito primarioak eta landare-hormonak ateratzeko (54).
JA aplikazio exogenoetarako, espezie bakoitzeko sei arrosa-landareen hiru peziolo-hostoak 20 μl lanolina-pastarekin tratatzen dira, 150 μg MeJArekin (Lan + MeJA), eta 20 μl lanolina gehi zaurien tratamenduarekin (Lan + W), edo 20 μl lanolina purua erabiltzen da kontrol gisa. Hostoak tratamendua egin eta 72 ordura bildu ziren, nitrogeno likidoan izoztu eta -80 °C-tan gorde ziren erabili arte.
Gure ikerketa taldean lau JA eta ET lerro transgeniko identifikatu dira, hain zuzen ere irAOC (36), irCOI1 (55), irACO eta sETR1 (48). irAOC-k JA eta JA-Ile mailen jaitsiera nabarmena erakutsi zuen, irCOI1, berriz, ez zen JA-ekiko sentikorra izan. EV-rekin alderatuta, JA-Ile metaketa handitu egin zen. Era berean, irACO-k ET ekoizpena murriztuko du, eta EV-rekin alderatuta, sETR1-k, ET-arekiko sentikorra ez denak, ET ekoizpena handituko du.
Espektrometro laser fotoakustiko bat (Sensor Sense ETD-300 denbora errealeko ET sentsorea) erabiltzen da ET neurketa modu ez-inbaditzailean egiteko. Tratamendua egin eta berehala, hostoen erdia moztu eta 4 ml-ko beirazko ontzi itxi batera eraman ziren, eta goi-espazioa 5 ordutan pilatzen utzi zen. Neurketa egiten ari zela, ontzi bakoitza 2 litro/orduko aire puruaren korronte batekin garbitu zen 8 minutuz, aurretik Sensor Sense-k emandako katalizatzaile batetik igaro ondoren CO2 eta ura kentzeko.
Mikroarray datuak jatorriz (35) artikuluan argitaratu ziren eta National Center for Biotechnology Information (NCBI) Gene Expression Comprehensive Database-n gorde ziren (GSE30287 sarbide zenbakia). W + OSM tratamenduak eragindako hostoei eta kaltetu gabeko kontrolei dagozkien datuak atera ziren ikerketa honetarako. Intentsitate gordina log2 da. Analisi estatistikoa egin aurretik, oinarri-lerroa bihurtu eta bere 75. pertzentilera normalizatu zen R software paketea erabiliz.
Nicotiana espezieen jatorrizko RNA sekuentziazioaren (RNA-seq) datuak NCBI Short Reading Archives (SRA)-tik berreskuratu ziren, proiektuaren zenbakia PRJNA301787 da, Zhou et al.-ek argitaratu zutena (39) eta (56)-n deskribatutako moduan jarraitu zen. Nicotiana espezieei dagozkien W + W, W + OSM eta W + OSS1-ek prozesatutako datu gordinak ikerketa honetan aztertzeko hautatu ziren, eta honela prozesatu ziren: Lehenik, RNA-seq irakurketa gordinak FASTQ formatura bihurtu ziren. HISAT2-k FASTQ SAM bihurtzen du, eta SAMtools-ek SAM fitxategiak BAM fitxategi ordenatuetan bihurtzen ditu. StringTie geneen espresioa kalkulatzeko erabiltzen da, eta bere adierazpen metodoa da sekuentziatutako transkripzio-zati bakoitzeko mila base-zati bakoitzeko zatiak daudela.
Analisian erabilitako Acclaim kromatografia-zutabea (150 mm x 2,1 mm; partikula-tamaina 2,2 μm) eta 4 mm x 4 mm-ko zaindari-zutabea material berdinez eginda daude. Dionex UltiMate 3000 Ultra High Performance Liquid Chromatography (UHPLC) sisteman gradiente bitar hau erabiltzen da: 0tik 0,5 minutura, % 90eko A isokratikoa [ura desionizatua, % 0,1 (v/v) azetonitriloa eta % 0,05 azido formikoa], % 10eko B (Azetonitriloa eta % 0,05 azido formikoa); 0,5etik 23,5 minutura, gradiente-fasea % 10eko A eta % 90eko B da, hurrenez hurren; 23,5etik 25 minutura, % 10eko A eta % 90eko B isokratikoa. Emari-abiadura 400 μl/min da. MS analisi guztietarako, injektatu zutabe-eluentea kuadrupolo eta hegaldi-denbora (qTOF) analizatzaile batean, ionizazio positibo moduan funtzionatzen duen elektroihinztadura iturri batekin hornituta (kapilar tentsioa, 4500 V; kapilarraren irteera 130 V; lehortze-tenperatura 200 °C; lehortze-aire-fluxua 10 litro/min).
Egin datuetatik garrantzirik gabeko edo bereizezinak diren MS/MS zatien analisiak (aurrerantzean MS/MS aipatuko dena), detekta daitekeen profil metaboliko orokorrari buruzko informazio estrukturala lortzeko. MS/MS metodo bereizketarik gabekoaren kontzeptua kuadrupoloak masa-isolamendu leiho oso handia duela oinarritzen da [beraz, kontuan hartu masa-karga erlazioaren (m/z) seinale guztiak zati gisa]. Hori dela eta, Impact II tresnak ezin izan zuenez CE inklinaziorik sortu, hainbat analisi independente egin ziren talkak eragindako disoziazio-talka-energiaren (CE) balio handituak erabiliz. Laburbilduz, lehenik eta behin aztertu lagina UHPLC-elektroihinztadura ionizazio/qTOF-MS bidez, masa-espektrometria modu bakarra erabiliz (iturri barruko zatikatzeak sortutako zatikatze baxuko baldintzak), m/z 50etik 1500era eskaneatuz 5 Hz-ko errepikapen-maiztasunean. Erabili nitrogenoa talka-gas gisa MS/MS analisietarako, eta egin neurketa independenteak honako lau talkak eragindako disoziazio-tentsio desberdin hauetan: 20, 30, 40 eta 50 eV. Neurketa-prozesu osoan zehar, kuadrupoloak du masa-isolamendu leihorik handiena, m/z 50etik 1500era. Aurrealdeko gorputzaren m/z eta isolamendu-zabalera esperimentua 200ra ezartzen denean, masa-tartea automatikoki aktibatzen da tresnaren software eragileak eta 0 Da-k. Eskaneatu masa-zatiak masa bakarreko moduan bezala. Erabili sodio formiatoa (50 ml isopropanol, 200 μl azido formiko eta 1 ml 1M NaOH ur-disoluzio) masa-kalibraziorako. Brukerren zehaztasun handiko kalibrazio-algoritmoa erabiliz, datu-fitxategia kalibratzen da batez besteko espektroa denbora-tarte jakin batean exekutatu ondoren. Erabili Data Analysis v4.0 softwarearen esportazio-funtzioa (Brook Dalton, Bremen, Alemania) datu gordinak NetCDF formatura bihurtzeko. MS/MS datu-multzoa MetaboLights (www.ebi.ac.uk) metabolomika-datu-base irekian gorde da, MTBLS1471 sartze-zenbakiarekin.
MS/MS muntaketa MS1 eta MS/MS kalitate-seinaleen arteko korrelazio-analisi baten bidez gauzatu daiteke, talka-energia baxu eta handikoetarako eta arau berri inplementatuetarako. R script-a erabiltzen da aitzindariaren produktuarekiko banaketaren korrelazio-analisia egiteko, eta C# script-a (https://github.com/MPI-DL/indiscriminant-MS-MS-assembly-pipeline) arauak inplementatzeko.
Atzeko planoaren zaratak eragindako errore faltsu positiboak eta lagin gutxi batzuetan m/z ezaugarri jakin batzuk detektatzeak eragindako korrelazio faltsuak murrizteko, R paketeko XCMS "filled peak" funtzioa erabiltzen dugu (atzeko planoaren zarata zuzentzeko). "NA" (detektatu gabeko gailurra) intentsitatea ordezkatzeko erabili beharko litzateke. Bete gailurraren funtzioa erabiltzen denean, oraindik ere "0" intentsitate balio asko daude datu multzoan, eta horiek korrelazio kalkuluan eragina izango dute. Ondoren, bete gailurraren funtzioa erabiltzen denean eta bete gailurraren funtzioa erabiltzen ez denean lortutako datu prozesamendu emaitzak alderatzen ditugu, eta atzeko planoaren zarataren balioa kalkulatzen dugu batez besteko zuzendutako balio estimatuaren arabera, eta gero 0 intentsitate balio horiek kalkulatutako atzeko planoaren balioarekin ordezkatzen ditugu. Gainera, atzeko planoaren balioa baino hiru aldiz handiagoa zen intentsitatea duten ezaugarriak bakarrik hartu ditugu kontuan eta "benetako gailur" gisa hartu ditugu. PCC kalkuluetarako, laginaren aitzindariaren (MS1) eta gutxienez zortzi benetako gailur dituzten zatien datu multzoen m/z seinaleak bakarrik hartzen dira kontuan.
Lagin osoko aitzindari kalitate-ezaugarriaren intentsitatea talka-energia baxu edo altuari menpe dagoen kalitate-ezaugarri beraren intentsitate murriztuarekin korrelazionatzen bada modu esanguratsuan, eta ezaugarria ez bada isotopo-piko gisa etiketatzen CAMERA-k, gehiago definitu daiteke. Ondoren, 3 segundotan aitzindari-produktu bikote posible guztiak kalkulatuz (pikorraren atxikipenerako atxikipen-denbora-leiho estimatua), korrelazio-analisia egiten da. m/z balioa aitzindari-balioa baino txikiagoa denean eta MS/MS zatikatzea datu-multzoan eratorri den aitzindariaren lagin-kokapen berean gertatzen denean bakarrik, zatitzat hartzen da.
Bi arau sinple hauetan oinarrituta, identifikatutako aitzindariaren m/z baino m/z balio handiagoak dituzten zati zehaztuak baztertzen ditugu, eta aitzindaria agertzen den laginaren posizioan eta zehaztutako zatian oinarrituta. MS1 moduan sortutako iturriko zati askok sortutako kalitate-ezaugarriak hautatzea ere posible da aitzindari hautagai gisa, horrela MS/MS konposatu erredundanteak sortuz. Datuen erredundantzia hori murrizteko, espektroen NDP antzekotasuna 0,6 baino handiagoa bada, eta CAMERAk anotatutako "pcgroup" kromatogramaren barruan badaude, batu egingo ditugu. Azkenik, aitzindariarekin eta zatiekin lotutako lau CE emaitzak azken espektro konposatu dekonboluzionatuan batu ditugu, talka-energia desberdinetan m/z balio bera duten gailur hautagai guztien artean intentsitate handiena duen gailurra hautatuz. Ondorengo prozesatzeko urratsak espektro konposatuaren kontzeptuan oinarritzen dira eta zatikatze-probabilitatea maximizatzeko beharrezkoak diren CE baldintza desberdinak kontuan hartzen dituzte, zati batzuk talka-energia espezifiko baten pean bakarrik detektatu daitezkeelako.
RDPI (30) erabili zen profil metabolikoaren induzigarritasuna kalkulatzeko. Espektro metabolikoaren dibertsitatea (Hj indizea) MS/MS aitzindarien ugaritasunetik eratorria da, Martínez et al.-ek (8) deskribatutako ekuazio hau erabiliz MS/MS maiztasun banaketaren Shannon entropia erabiliz. Hj = −∑i = 1mPijlog2(Pij) non Pij i-garren MS/MS-aren maiztasun erlatiboari dagokion j-garren laginaren (j = 1, 2,…, m) (i = 1, 2,…, m) t).
Espezifikotasun metabolikoa (Si indizea) MS/MS jakin baten adierazpen-identitate gisa definitzen da, kontuan hartzen diren laginen arteko maiztasunarekin erlazionatuta. MS/MS espezifikotasuna Si = 1t (∑j = 1tPijPilog2PijPi) gisa kalkulatzen da.
Erabili formula hau j lagin bakoitzaren metaboloma-espezifiko δj indizea eta MS/MS espezifikotasunaren batez bestekoa neurtzeko: δj = ∑i = 1mPijSi
MS/MS espektroak binaka lerrokatzen dira, eta antzekotasuna bi puntuazioen arabera kalkulatzen da. Lehenik eta behin, NDP estandarra erabiliz (kosinu korrelazio metodoa bezala ere ezagutzen dena), erabili ekuazio hau espektroen arteko segmentu antzekotasuna puntuatzeko: NDP = (∑iS1 & S2WS1, iWS2, i) 2∑iWS1, i2∑iWS2, i2 non S1 eta S2 diren. Horrenbestez, 1. eta 2. espektroetarako, baita WS1, i eta WS2rako ere, i-k gailurraren intentsitatean oinarritutako pisua adierazten du, non bi espektroen arteko i-garren gailur komunaren aldea 0,01 Da baino txikiagoa den. Pisua honela kalkulatzen da: W = [gailurraren intentsitatea] m [kalitatea] n, m = 0,5, n = 2, MassBank-ek iradokitzen duen bezala.
Bigarren puntuazio-metodo bat ezarri zen, MS/MS arteko NL partekatua aztertzearekin batera. Horretarako, MS zatikatze-prozesuan maiz aurkitzen diren 52 NL zerrendak erabili genituen batera, eta Nepenthes espezie ahulduaren bigarren mailako metabolitoen MS/MS espektrorako aurretik anotatutako NL espezifikoagoa (S1 datu-fitxategia) (9, 26). Sortu 1 eta 0 bektore bitar bat MS/MS bakoitzerako, NL batzuen unekoari eta existitzen ez direnari dagokiona, hurrenez hurren. Distantzia euklidearraren antzekotasunean oinarrituta, NL antzekotasun-puntuazioa kalkulatzen da NL bektore bitar bikote bakoitzerako.
Klusterizazio bikoitza egiteko, DiffCoEx R paketea erabili genuen, Weighted Gene Co-expression Analysis (WGCNA) programaren luzapen batean oinarrituta dagoena. MS/MS espektroen NDP eta NL puntuazio matrizeak erabiliz, DiffCoEx erabili genuen korrelazio matrizea kalkulatzeko. Klusterizazio bitarra "cutreeDynamic" parametroa method = "hybrid", cutHeight = 0.9999, deepSplit = T eta minClusterSize = 10 gisa ezarriz egiten da. DiffCoEx-en R iturburu kodea Tesson et al.-ek 1. fitxategi gehigarritik deskargatu zuten (57); beharrezko R WGCNA software paketea https://horvath.genetics.ucla.edu/html/CoexpressionNetwork/Rpackages/WGCNA helbidean aurki daiteke.
MS/MS sare molekularren analisia egiteko, NDP eta NL antzekotasun moten araberako konektibitate espektral parekatua kalkulatu genuen, eta Cytoscape softwarea erabili genuen sarearen topologia bistaratzeko CyFilescape yFiles diseinu algoritmoaren luzapen aplikazioan diseinu organikoa erabiliz.
Erabili R 3.0.1 bertsioa datuen analisi estatistikoa egiteko. Garrantzi estatistikoa bariantzaren bi norabideko analisia (ANOVA) erabiliz ebaluatu zen, eta ondoren Tukey-ren diferentzia esanguratsu zintzoa (HSD) post-hoc testa erabiliz. Belarjaleen tratamenduaren eta kontrol-taldearen arteko aldea aztertzeko, bariantza bera zuten bi lagin-taldeen banaketa bilaterala aztertu zen Student-en t testa erabiliz.
Artikulu honetarako material osagarriak lortzeko, ikus http://advances.sciencemag.org/cgi/content/full/6/24/eaaz0381/DC1
Artikulu hau Creative Commons Aitortu-EzKomertziala Lizentziaren baldintzen arabera banatzen da, eta edozein euskarritan erabiltzea, banatzea eta erreproduzitzea baimentzen du, betiere azken erabilera ez bada irabazi komertzialik lortzeko eta jatorrizko lana zuzena dela bada premisa. Erreferentzia.
Oharra: Zure helbide elektronikoa ematea baino ez dizugu eskatzen, orrialdera gomendatzen duzun pertsonak mezu elektronikoa ikustea nahi duzula eta spam-a ez dela jakin dezan. Ez dugu helbide elektronikorik hartuko.
Galdera hau bisitaria zaren ala ez egiaztatzeko eta spam bidalketa automatikoa saihesteko erabiltzen da.
Informazioaren teoriak metaboloma bereziak alderatzeko eta proben defentsa-teorien iragarpenerako moneta unibertsala eskaintzen du.
Informazioaren teoriak metaboloma bereziak alderatzeko eta proben defentsa-teorien iragarpenerako moneta unibertsala eskaintzen du.
©2021 Zientziaren Aurrerapenerako Amerikako Elkartea. eskubide guztiak erreserbatuta. AAAS HINARI, AGORA, OARE, CHORUS, CLOCKSS, CrossRef eta COUNTER-en bazkidea da. ScienceAdvances ISSN 2375-2548.