Aurretik jakinarazi genuen hesteetatik eratorritako triptofano metabolitoaren, indol-3-propioniko azidoaren (IPA) serumeko mailak baxuagoak direla gibeleko fibrosia duten pazienteetan. Ikerketa honetan, transkriptoma eta DNA metiloma ikertu ditugu gibel obesoetan serumeko IPA mailekin erlazionatuta, baita IPAk gibeleko zelula izartsuen (HSC) in vitro inaktibazio fenotipikoa eragiteko duen eginkizuna ere.
Ikerketan 2 motako diabetes mellitus (T2DM) gabeko 116 paziente obeso hartu ziren barne (46,8 ± 9,3 urte; GMI: 42,7 ± 5,0 kg/m²), Kuopioko Kirurgia Bariatrikoko Zentroan (KOBS) kirurgia bariatrikoa egin zitzaien. Zirkulazioan dauden IPA mailak kromatografia likido-masa espektrometria bidez (LC-MS) neurtu ziren, gibeleko transkriptomaren analisia RNA sekuentziazio osoaren bidez egin zen, eta DNA metilazio analisia Infinium HumanMethylation450 BeadChip erabiliz egin zen. Giza gibeleko zelula izartsuak (LX-2) erabili ziren in vitro esperimentuetarako.
IPA serumeko mailak gibeleko apoptosi, mitofagia eta iraupen-bideetan parte hartzen duten geneen adierazpenarekin korrelazionatu ziren. AKT serina/treonina kinasa 1 (AKT1) genea izan zen gibeleko transkripzio eta DNA metilazio profiletan elkarreraginean aritzen zen gene ugariena eta nagusiena. IPA tratamenduak apoptosia eragin zuen, mitokondrioen arnasketa gutxitu zuen eta zelulen morfologia eta mitokondrioen dinamika aldatu zituen, fibrosia, apoptosia eta biziraupena erregulatzen dituzten geneen adierazpena modulatuz.
Datu hauek guztiek batera hartuta, IPAk efektu terapeutiko potentzialak dituela eta apoptosia eragin eta HSC fenotipoa egoera inaktibo batera alda dezakeela baieztatzen dute, eta horrela, HSCren aktibazioa eta mitokondrioen metabolismoa oztopatuz gibeleko fibrosia inhibitzeko aukera zabalduz.
Obesitatearen eta sindrome metabolikoaren prebalentzia gibeleko gantz-gaixotasunaren (MASLD) intzidentzia gero eta handiagoarekin lotu da; gaixotasunak biztanleria orokorraren % 25etik % 30era eragiten du [1]. MASLD etiologiaren ondorio nagusia gibeleko fibrosia da, matrize estrazelular fibrosoaren (ECM) etengabeko metaketak ezaugarritzen duen prozesu dinamikoa [2]. Gibeleko fibrosian parte hartzen duten zelula nagusiak gibeleko izar-zelulak (HSC) dira, lau fenotipo ezagun dituztenak: lozorroan, aktibatuan, inaktibatuan eta seneszentean [3, 4]. HSCak aktibatu eta forma lozorrotik energia-eskaera handiko fibroblasto-itxurako zelula proliferatiboetara transdiferentziatu daitezke, α-muskulu leunaren aktina (α-SMA) eta I motako kolagenoaren (Col-I) adierazpena handituz [5, 6]. Gibeleko fibrosiaren alderantzikatzean, HSC aktibatuak apoptosiaren edo inaktibazioaren bidez ezabatzen dira. Prozesu horien artean daude fibrogen geneen beherakada eta biziraupenerako geneen modulazioa (NF-κB eta PI3K/Akt seinaleztapen bideak, adibidez) [7, 8], baita mitokondrioen dinamikan eta funtzioan izandako aldaketak ere [9].
Hesteetan sortutako indol-3-propioniko azidoaren (IPA) triptofano metabolitoaren serumeko mailak gutxitu egin direla ikusi da gizakien gaixotasun metabolikoetan, MASLD barne [10–13]. IPA zuntz dietetikoaren kontsumoarekin lotuta dago, bere efektu antioxidatzaile eta antiinflamatorioengatik da ezaguna, eta dietak eragindako esteatohepatitis ez-alkoholikoaren (NASH) fenotipoa arintzen du in vivo eta in vitro [11–14]. Froga batzuk gure aurreko ikerketa batetik datoz, zeinak erakutsi zuen serumeko IPA mailak txikiagoak zirela gibeleko fibrosia zuten pazienteetan gibeleko fibrosia gabeko paziente obesoetan baino Kuopio Bariatric Surgery Study (KOBS) azterketan. Gainera, erakutsi genuen IPA tratamenduak zelulen atxikimenduaren, zelulen migrazioaren eta zelula hematopoietikoen aktibazio markatzaile klasikoak diren geneen adierazpena murriztu zezakeela gizakien gibeleko zelula izartsu (LX-2) eredu batean eta metabolito hepatobabesle potentziala dela [15]. Hala ere, ez dago argi nola eragiten duen IPAk gibeleko fibrosiaren atzerakada HSC apoptosia eta mitokondrioen bioenergetika aktibatuz.
Hemen, erakusten dugu serumeko IPA apoptosi, mitofagia eta 2 motako diabetesa ez duten pertsonen gibeleko biziraupen bideetan aberastutako geneen adierazpenarekin lotuta dagoela. Gainera, ikusi dugu IPAk zelula ama hematopoietiko aktibatuen (HSC) garbiketa eta degradazioa eragin ditzakeela inaktibazio bidearen bidez. Emaitza hauek IPAren zeregin berri bat agerian uzten dute, gibeleko fibrosiaren atzerakada sustatzeko helburu terapeutiko potentzial bihurtuz.
KOBS kohortean egindako aurreko ikerketa batek erakutsi zuen gibeleko fibrosia zuten pazienteen zirkulazioan IPA maila baxuagoak zituztela gibeleko fibrosia ez zuten pazienteekin alderatuta [15]. 2 motako diabetesaren nahasgarri-efektu potentziala baztertzeko, 2 motako diabetesik gabeko 116 paziente obeso (batez besteko adina ± SD: 46,8 ± 9,3 urte; GMI: 42,7 ± 5,0 kg/m2) (1. taula) KOBS ikerketatik errekrutatu genituen ikerketa-populazio gisa [16]. Parte-hartzaile guztiek idatzizko baimen informatua eman zuten eta ikerketa-protokoloa Ipar Savo Konderriko Ospitaleko Etika Batzordeak onartu zuen Helsinkiko Adierazpenaren arabera (54/2005, 104/2008 eta 27/2010).
Gibeleko biopsia laginak kirurgia bariatrikoan lortu ziren eta patologo esperientziadunek histologikoki ebaluatu zituzten, aurretik deskribatutako irizpideen arabera [17, 18]. Ebaluazio irizpideak S1 taula osagarrian laburbilduta daude eta aurretik deskribatu dira [19].
Baraualdiko serum laginak kromatografia likido-masa espektrometria bidez (LC-MS) aztertu ziren metabolomikako analisietarako (n = 116). Laginak UHPLC-qTOF-MS sistema bat erabiliz aztertu ziren (1290 LC, 6540 qTOF-MS, Agilent Technologies, Waldbronn, Karlsruhe, Alemania), aurretik deskribatu bezala19. Isopropil alkoholaren (IPA) identifikazioa atxikipen-denboran eta MS/MS espektroaren eta estandar puruen arteko alderaketan oinarritu zen. IPA seinalearen intentsitatea (piko-azalera) ondorengo analisi guztietan kontuan hartu zen [20].
Gibeleko RNA osoaren sekuentziazioa Illumina HiSeq 2500 erabiliz egin zen eta datuak aurretik deskribatutako moduan prozesatu ziren [19, 21, 22]. Mitokondrioen funtzioan/biogenesian eragina duten transkripzioen adierazpen diferentzialaren analisi zuzendua egin genuen, MitoMiner 4.0 datu-basetik hautatutako 1957 gene erabiliz [23]. Gibeleko DNAren metilazio-analisia Infinium HumanMethylation450 BeadChip (Illumina, San Diego, CA, AEB) erabiliz egin zen, aurretik deskribatutako metodologia bera erabiliz [24, 25].
Stefano Romeo irakasleak eman zituen gizakien gibeleko izar-zelulak (LX-2), eta DMEM/F12 ingurunean (Biowest, L0093-500, %1 Pen/Strep; Lonza, DE17-602E, %2 FBS; Gibco, 10270-106) landu eta mantendu ziren. IPAren lan-dosia hautatzeko, LX-2 zelulak IPA kontzentrazio desberdinekin tratatu ziren (10 μM, 100 μM eta 1 mM; Sigma, 220027) DMEM/F12 ingurunean 24 orduz. Gainera, IPAk HSCak inaktibatzeko duen gaitasuna ikertzeko, LX-2 zelulak 5 ng/ml TGF-β1rekin (R&D systems, 240-B-002/CF) eta 1 mM IPArekin batera tratatu ziren serumik gabeko ingurunean 24 orduz. Dagokien kontrol-ibilgailuetarako, % 0,1 BSA duen 4 nM HCL erabili zen TGF-β1 tratamendurako eta % 0,05 DMSO IPA tratamendurako, eta biak elkarrekin erabili ziren konbinazio-tratamendurako.
Apoptosia FITC Annexin V Apoptosis Detection Kit erabiliz ebaluatu zen, 7-AADrekin (Biolegend, San Diego, CA, AEB, Cat# 640922), fabrikatzailearen argibideen arabera. Laburbilduz, LX-2 (1 × 105 zelula/putzu) gau osoan zehar landu ziren 12 putzuko plaketan eta ondoren IPA edo IPA eta TGF-β1 dosi anitzekin tratatu ziren. Hurrengo egunean, zelula flotatzaileak eta atxikiak bildu, tripsinizatu, PBSrekin garbitu, Annexin V lotura-bufferrean berriro eseki eta FITC-Annexin V eta 7-AADrekin inkubatu ziren 15 minutuz.
Zelula bizidunetako mitokondrioak jarduera oxidatiboaren arabera tindatu ziren Mitotracker™ Red CMXRos (MTR) (Thermo Fisher Scientific, Carlsbad, CA) erabiliz. MTR analisietarako, LX-2 zelulak dentsitate berdinetan inkubatu ziren IPA eta TGF-β1-rekin. 24 ordu igaro ondoren, zelula bizidunak tripsinizatu, PBS-rekin garbitu eta, ondoren, 100 μM MTR-rekin inkubatu ziren serumik gabeko ingurunean 37 °C-tan 20 minutuz, aurretik deskribatu bezala [26]. Zelula bizidunen morfologia analisietarako, zelulen tamaina eta zitoplasmaren konplexutasuna aztertu ziren aurreranzko sakabanaketa (FSC) eta alboko sakabanaketa (SSC) parametroak erabiliz, hurrenez hurren.
Datu guztiak (30.000 gertaera) NovoCyte Quanteon (Agilent) erabiliz eskuratu eta NovoExpress® 1.4.1 edo FlowJo V.10 softwarearekin aztertu ziren.
Oxigeno-kontsumo-tasa (OCR) eta zelulaz kanpoko azidotze-tasa (ECAR) denbora errealean neurtu ziren Seahorse Extracellular Flux Analyzer (Agilent Technologies, Santa Clara, CA) bat erabiliz, Seahorse XF Cell Mito Stress batekin hornitua, fabrikatzailearen argibideen arabera. Laburbilduz, 2 × 104 LX-2 zelula/putzu XF96 zelula-kultura-plaketan erein ziren. Gau osoan inkubatu ondoren, zelulak isopropanolarekin (IPA) eta TGF-β1-rekin tratatu ziren (1. metodo osagarria). Datuen analisia Seahorse XF Wave softwarea erabiliz egin zen, eta horrek Seahorse XF Cell Energy Phenotype Test Report Generator barne hartzen du. Hortik abiatuta, Osasun Bioenergetikoko Indizea (BHI) kalkulatu zen [27].
RNA osoa cDNA bihurtu zen transkribatuta. Metodo espezifikoetarako, ikus [15] erreferentzia. Giza 60S erribosoma azidoaren proteina P0 (RPLP0) eta ziklofilina A1 (PPIA) mRNA mailak erabili ziren geneen kontrol konstitutibo gisa. QuantStudio 6 pro Real-Time PCR System (Thermo Fisher, Landsmeer, Herbehereak) TaqMan™ Fast Advanced Master Mix Kit (Applied Biosystems) edo Sensifast SYBR Lo-ROX Kit (Bioline, BIO 94050) erabili zen, eta geneen espresioaren tolestura erlatiboa kalkulatu zen Ct balioaren ziklo-parametro konparatiboak (ΔΔCt) eta ∆∆Ct metodoa erabiliz. Primerren xehetasunak S2 eta S3 tauletan ematen dira.
DNA nuklearra (ncDNA) eta DNA mitokondriala (mtDNA) DNeasy odol eta ehunen kitarekin (Qiagen) erauzi ziren, aurretik deskribatu bezala [28]. mtDNAren kantitate erlatiboa kalkulatzeko, mtDNA eskualde bakoitzaren eta hiru DNA eskualde nuklearren (mtDNA/ncDNA) batez besteko geometrikoaren arteko erlazioa kalkulatu zen, 2. metodo osagarrian zehaztu bezala. mtDNA eta ncDNAren primerren xehetasunak S4 taula osagarrian daude.
Zelula biziak Mitotracker™ Red CMXRos (MTR)-rekin (Thermo Fisher Scientific, Carlsbad, CA) tindatu ziren zelula arteko eta zelula barneko mitokondrio-sareak bistaratzeko. LX-2 zelulak (1 × 104 zelula/putzu) beirazko laminetan landu ziren dagokien beirazko hondoko hazkuntza-plaketan (Ibidi GmbH, Martinsried, Alemania). 24 ordu igaro ondoren, LX-2 zelula biziak 100 μM MTR-rekin inkubatu ziren 20 minutuz 37 °C-tan eta zelula-nukleoak DAPI-rekin tindatu ziren (1 μg/ml, Sigma-Aldrich) aurretik deskribatu bezala [29]. Mitokondrio-sareak Zeiss Axio Observer alderantzizko mikroskopio bat erabiliz bistaratu ziren (Carl Zeiss Microimaging GmbH, Jena, Alemania), Zeiss LSM 800 modulu konfokal batekin hornitua, 37 °C-tan hezetutako atmosferan, % 5eko CO2-rekin, 63×NA 1.3 objektibo bat erabiliz. Hamar Z serieko irudi eskuratu genituen lagin mota bakoitzerako. Z serie bakoitzak 30 atal ditu, bakoitza 9,86 μm-ko lodierakoa. Lagin bakoitzerako, hamar ikus-eremu ezberdinen irudiak eskuratu ziren ZEN 2009 softwarea erabiliz (Carl Zeiss Microimaging GmbH, Jena, Alemania), eta mitokondrioen morfologia-analisia ImageJ softwarea (v1.54d) [30, 31] erabiliz egin zen, 3. Metodo Osagarrietan zehaztutako parametroen arabera.
Zelulak % 2ko glutaraldehidoarekin finkatu ziren 0,1 M-ko fosfato bufferrean, ondoren % 1eko osmio tetroxido disoluzioarekin finkatu ziren (Sigma Aldrich, MO, AEB), pixkanaka azetonarekin deshidratatu ziren (Merck, Darmstadt, Alemania), eta azkenik epoxi erretxinetan txertatu ziren. Sekzio ultrameheak prestatu eta % 1eko uranil azetatoarekin (Merck, Darmstadt, Alemania) eta % 1eko berun zitratoarekin (Merck, Darmstadt, Alemania) tindatu ziren. Irudi ultraestrukturalak JEM 2100F EXII transmisio-mikroskopio elektroniko bat (JEOL Ltd, Tokio, Japonia) erabiliz lortu ziren, 80 kV-ko azelerazio-tentsioan.
24 orduz IPArekin tratatutako LX-2 zelulen morfologia fase-kontraste mikroskopio bidez aztertu zen, 50x handitze-mailan, Zeiss alderantzizko argi mikroskopio bat erabiliz (Zeiss Axio Vert.A1 eta AxioCam MRm, Jena, Alemania).
Datu klinikoak batez besteko ± desbideratze estandarra edo mediana gisa adierazi ziren (kuartil arteko tartea: IQR). Bariantzaren analisi unidirekzionala (aldagai jarraituak) edo χ² testa (aldagai kategorikoak) erabili ziren hiru ikerketa taldeen arteko desberdintasunak alderatzeko. Positibo faltsuen tasa (FDR) erabili zen proba anitzak zuzentzeko, eta FDR < 0,05 zuten geneak estatistikoki esanguratsutzat jo ziren. Spearman korrelazio analisia erabili zen CpG DNA metilazioa IPA seinalearen intentsitatearekin korrelatzeko, p balio nominalak (p < 0,05) jakinaraziz.
Bide-analisia web bidezko gene-multzoen analisi tresna bat (WebGestalt) erabiliz egin zen, 268 transkripturentzat (p nominala < 0,01), 119 mitokondrioekin lotutako transkripturentzat (p nominala < 0,05) eta 3093 gibeleko transkriptuetatik 4350 CpG-rentzat, zirkulazio-serumeko IPA mailekin lotuta zeudenak. Doako Venny DB tresna (2.1.0 bertsioa) erabili zen gainjarritako geneak aurkitzeko, eta StringDB (11.5 bertsioa) proteina-proteina elkarrekintzak bistaratzeko.
LX-2 esperimenturako, laginen normaltasuna D'Agostino-Pearson testa erabiliz aztertu zen. Datuak gutxienez hiru errepikapen biologikotatik lortu ziren eta ANOVA unidirekzionala egin zitzaien Bonferroni post hoc testarekin. 0,05 baino txikiagoa den p-balioa estatistikoki esanguratsua kontsideratu zen. Datuak batez besteko ± SD gisa aurkezten dira, eta esperimentu kopurua irudi bakoitzean adierazten da. Analisi eta grafiko guztiak GraphPad Prism 8 software estatistikoa erabiliz egin ziren Windows-erako (GraphPad Software Inc., 8.4.3 bertsioa, San Diego, AEB).
Lehenik eta behin, IPA serumeko mailen eta gibeleko, gorputz osoko eta mitokondrioetako transkripzioen arteko lotura ikertu genuen. Transkripzio-profil osoan, IPA serumeko mailekin lotutako gene indartsuena MAPKAPK3 izan zen (FDR = 0,0077; mitogenoak aktibatutako proteina kinasa aktibatutako proteina kinasa 3); mitokondrioekin lotutako transkripzio-profilean, lotutako gene indartsuena AKT1 izan zen (FDR = 0,7621; AKT serina/treonina kinasa 1) (1. fitxategi gehigarria eta 2. fitxategi gehigarria).
Ondoren, transkripzio globalak (n = 268; p < 0,01) eta mitokondrioekin lotutako transkripzioak (n = 119; p < 0,05) aztertu genituen, azkenean apoptosia bide kanoniko esanguratsuena bezala identifikatuz (p = 0,0089). Serumeko IPA mailekin lotutako transkripzio mitokondrialei dagokienez, apoptosian (FDR = 0,00001), mitofagian (FDR = 0,00029) eta TNF seinaleztapen bideetan (FDR = 0,000006) zentratu ginen (1A irudia, 2. taula eta 1A-B irudi osagarriak).
Giza gibeleko transkripzio globalen, mitokondrioekin lotutakoen eta DNA metilazioen gainjartze-analisia, serumeko IPA mailekin lotuta. A-k 268 transkripzio global, 119 mitokondrioekin lotutako transkripzio eta DNA metilatutako transkripzioak adierazten ditu, serumeko IPA mailekin lotutako 3092 CpG guneetan mapatuta (p balioak < 0,01 transkripzio global eta DNA metilatuentzat, eta p balioak < 0,05 mitokondrioetako transkripzioentzat). Gainjartze-transkripzio nagusiak erdian ageri dira (AKT1 eta YKT6). B Beste geneekin interakzio-puntuaziorik altuena (0,900) duten 13 geneen interakzio-mapa eraiki zen serumeko IPA mailekin nabarmen lotuta zeuden 56 gene gainjarrietatik (lerro beltzaren eskualdea) StringDB lineako tresna erabiliz. Berdea: Gene Ontology (GO) zelula-osagaian mapatutako geneak: mitokondrioak (GO:0005739). AKT1 da datuetan oinarrituta (testu-meatzaritzan, esperimentuetan, datu-baseetan eta ko-adierazpenean oinarrituta) beste proteinekin elkarreraginean puntuaziorik altuena (0,900) duen proteina. Sare-nodoek proteinak adierazten dituzte, eta ertzek proteinen arteko konexioak.
Hesteetako mikrobiotaren metabolitoek DNA metilazio bidez epigenesiaren osaera erregulatu dezaketenez [32], serumeko IPA mailak gibeleko DNA metilazioarekin lotuta zeuden ikertu genuen. Ikusi genuen serumeko IPA mailekin lotutako bi metilazio gune nagusiak prolina-serinaz aberatsa den 3. eskualdearen (C19orf55) eta bero-talka proteina familiako B (txikia) 6. kidearen (HSPB6) inguruan zeudela (3. fitxategi gehigarria). 4350 CpG-ren DNA metilazioa (p < 0,01) serumeko IPA mailekin korrelazionatu zen eta iraupen-luzetasun erregulatzaileko bideetan aberastu zen (p = 0,006) (1A irudia, 2. taula eta 1C irudi osagarria).
Giza gibeleko IPA serumeko mailen, transkripzio globalen, mitokondrioekin lotutako transkripzioen eta DNA metilazioen arteko loturaren oinarrian dauden mekanismo biologikoak ulertzeko, aurreko bide-analisian identifikatutako geneen gainjartze-analisi bat egin genuen (1A irudia). Gainjarritako 56 geneen (1A irudiko lerro beltzaren barruan) bide-aberaste-analisiaren emaitzek erakutsi zuten apoptosi-bideak (p = 0,00029) hiru analisietan komunean dauden bi gene nabarmendu zituela: AKT1 eta YKT6 (YKT6 v-SNARE homologoa), Venn diagraman erakusten den bezala (2. eta 1A irudi osagarria). Interesgarria da, AKT1 (cg19831386) eta YKT6 (cg24161647) serumeko IPA mailekin positiboki korrelazionatuta zeudela ikusi dugula (3. fitxategi gehigarria). Gene-produktuen arteko proteinen arteko elkarrekintza potentzialak identifikatzeko, 56 gene gainjarritakoen artean eskualde komuneko puntuaziorik altuena (0,900) duten 13 gene hautatu genituen sarrera gisa eta elkarrekintza-mapa bat eraiki genuen. Konfiantza mailaren arabera (konfiantza marjinala), puntuaziorik altuena (0,900) zuen AKT1 genea zegoen goialdean (1B irudia).
Bideen analisian oinarrituta, apoptosia zela bide nagusia ikusi genuen, beraz, IPA tratamenduak HSCen apoptosian eragingo ote zuen ikertu genuen in vitro. Aurretik frogatu genuen IPA dosi desberdinak (10 μM, 100 μM eta 1 mM) ez zirela toxikoak LX-2 zelulentzat [15]. Ikerketa honek erakutsi zuen 10 μM eta 100 μM-ko IPA tratamenduak zelula bideragarri eta nekrotikoen kopurua handitu zuela. Hala ere, kontrol-taldearekin alderatuta, zelulen bideragarritasuna gutxitu egin zen 1 mM IPA kontzentrazioan, zelulen nekrosi-tasa aldatu gabe mantendu zen bitartean (2A eta B irudiak). Ondoren, LX-2 zeluletan apoptosia eragiteko kontzentrazio optimoa aurkitzeko, 10 μM, 100 μM eta 1 mM IPA probatu genituen 24 orduz (2A-E irudiak eta 3A-B irudi osagarria). Interesgarria da, IPA 10 μM eta 100 μM-k apoptosi-tasa (%) murriztu zutela; hala ere, IPA 1 mM-k apoptosi berantiarra eta apoptosi-tasa (%) handitu zituen kontrol-taldearekin alderatuta, eta, beraz, esperimentu gehiago egiteko aukeratu zen (2A-D irudiak).
IPAk LX-2 zelulen apoptosia eragiten du. Anexina V eta 7-AAD tindaketa bikoitzaren metodoa erabili zen apoptosi-tasa eta zelulen morfologia kuantifikatzeko fluxu-zitometria bidez. BA zelulak 10 μM, 100 μM eta 1 mM IPArekin inkubatu ziren 24 orduz edo F–H TGF-β1 (5 ng/ml) eta 1 mM IPArekin serumik gabeko ingurunean 24 orduz. A: zelula biziak (Annexin V -/ 7AAD-); B: zelula nekrotikoak (Annexin V -/ 7AAD+); C, F: goiztiarra (Annexin V +/ 7AAD-); D, G: berantiarra (Annexin V+/7AAD.+); E, H: apoptosi-tasan dauden zelula goiztiar eta berantiar guztien ehunekoa (%). Datuak batez besteko ± SD gisa adierazten dira, n = 3 esperimentu independente. Konparazio estatistikoak ANOVA norabide bakarrekoa erabiliz egin ziren, Bonferroni post hoc testarekin. *p < 0,05; ****p < 0,0001
Aurretik erakutsi dugun bezala, 5 ng/ml TGF-β1-ek HSC aktibazioa eragin dezake markatzaile gene klasikoen adierazpena handituz [15]. LX-2 zelulak 5 ng/ml TGF-β1 eta 1 mM IPA-rekin tratatu ziren konbinazioan (2E-H irudia). TGF-β1 tratamenduak ez zuen apoptosi-tasa aldatu, hala ere, IPA-rekin batera egindako tratamenduak apoptosi berantiarra eta apoptosi-tasa (%) handitu zituen TGF-β1 tratamenduarekin alderatuta (2E-H irudia). Emaitza hauek adierazten dute 1 mM IPA-k apoptosia sustatu dezakeela LX-2 zeluletan TGF-β1 indukziotik independenteki.
IPAk LX-2 zelulen mitokondrioen arnasketan duen eragina gehiago ikertu genuen. Emaitzek erakutsi zuten 1 mM IPAk oxigeno-kontsumo-tasaren (OCR) parametroak gutxitu zituela: arnasketa ez-mitokondriala, arnasketa basala eta maximoa, protoi-ihesa eta ATP ekoizpena, kontrol-taldearekin alderatuta (3A eta B irudiak), osasun bioenergetikoaren indizea (BHI) ez zela aldatu.
IPAk LX-2 zeluletan mitokondrioen arnasketa murrizten du. Mitokondrioen arnasketa kurba (OCR) mitokondrioen arnasketa parametro gisa aurkezten da (mitokondrioez kanpoko arnasketa, arnasketa basala, arnasketa maximoa, protoi ihesa, ATP sorrera, SRC eta BHI). A eta B zelulak 10 μM, 100 μM eta 1 mM IPArekin inkubatu ziren 24 orduz, hurrenez hurren. C eta D zelulak TGF-β1 (5 ng/ml) eta 1 mM IPArekin inkubatu ziren serumik gabeko ingurunean 24 orduz, hurrenez hurren. Neurketa guztiak DNA edukiaren arabera normalizatu ziren CyQuant kit-a erabiliz. BHI: osasun bioenergetikoko indizea; SRC: arnas erreserba gaitasuna; OCR: oxigeno kontsumo tasa. Datuak batez besteko ± desbideratze estandar (SD) gisa aurkezten dira, n = 5 esperimentu independente. Konparazio estatistikoak ANOVA norabide bakarreko eta Bonferroni post hoc proba erabiliz egin ziren. *p < 0,05; **p < 0,01; eta ***p < 0,001
IPAk TGF-β1-ak aktibatutako LX-2 zelulen profil bioenergetikoan duen eragina hobeto ulertzeko, mitokondrioen fosforilazio oxidatiboa aztertu genuen OCR bidez (3C eta D irudiak). Emaitzek erakutsi zuten TGF-β1 tratamenduak arnasketa maximoa, arnas erreserba gaitasuna (SRC) eta BHI murriztu zitzakeela kontrol taldearekin alderatuta (3C eta D irudiak). Gainera, tratamendu konbinatuak arnasketa basala, protoi ihesa eta ATP ekoizpena murriztu zituen, baina SRC eta BHI nabarmen handiagoak izan ziren TGF-β1-arekin tratatutakoekin alderatuta (3C eta D irudiak).
Seahorse softwareak emandako "Zelula Energiaren Fenotipo Testa" ere egin genuen (4A-D irudi osagarria). 3B irudi osagarrian erakusten den bezala, OCR eta ECAR potentzial metabolikoak gutxitu egin ziren TGF-β1 tratamenduaren ondoren, baina ez zen desberdintasunik ikusi konbinazio eta IPA tratamendu taldeetan kontrol taldearekin alderatuta. Gainera, OCR-ren oinarrizko eta estres mailak gutxitu egin ziren konbinazio eta IPA tratamenduaren ondoren kontrol taldearekin alderatuta (4C irudi osagarria). Interesgarria da, antzeko eredua ikusi zela konbinazio terapiarekin, non ECAR-ren oinarrizko eta estres mailetan ez zen aldaketarik ikusi TGF-β1 tratamenduarekin alderatuta (4C irudi osagarria). HSC-etan, mitokondrioen fosforilazio oxidatiboaren murrizketak eta konbinazio tratamenduak SCR eta BHI leheneratzeko duen gaitasunak TGF-β1 tratamenduaren eraginpean egon ondoren ez zuen potentzial metabolikoa aldatu (OCR eta ECAR). Emaitza hauek guztiak kontuan hartuta, IPAk HSC-en bioenergetika murriztu dezakeela adierazten dute, eta horrek iradokitzen du IPAk energia-profil baxuagoa eragin dezakeela, eta horrek HSC fenotipoa inaktibaziorantz aldatzen duela (4D irudi osagarria).
IPAk mitokondrioen dinamikan duen eragina ikertu zen mitokondrioen morfologiaren eta sareko konexioen hiru dimentsioko kuantifikazioa erabiliz, baita MTR tindaketa ere (4. irudia eta 5. irudi osagarria). 4. irudiak erakusten du, kontrol-taldearekin alderatuta, TGF-β1 tratamenduak batez besteko azalera, adarren kopurua, adarren luzera osoa eta adarren lotura kopurua gutxitu zituela (4A eta B irudiak) eta mitokondrioen proportzioa morfologia esferikotik tartekora aldatu zuela (4C irudia). IPA tratamenduak bakarrik gutxitu zuen mitokondrioen batez besteko bolumena eta mitokondrioen proportzioa morfologia esferikotik tartekora aldatu zuen kontrol-taldearekin alderatuta (4A irudia). Aitzitik, mitokondrioen mintz-potentzialaren araberako MTR bidez ebaluatutako esferizitatea, adarren batez besteko luzera eta mitokondrioen jarduera aldatu gabe mantendu ziren eta parametro hauek ez ziren taldeen artean desberdinak izan. Emaitza hauek guztiak kontuan hartuta, TGF-β1 eta IPA tratamenduak mitokondrioen forma eta tamaina modulatzen dituztela dirudi, baita sarearen konplexutasuna ere LX-2 zelula bizidunetan.
IPAk LX-2 zeluletan mitokondrioen dinamika eta mitokondrioen DNAren ugaritasuna aldatzen ditu. A. LX-2 zelula bizien irudi konfokal adierazgarriak, TGF-β1 (5 ng/ml) eta 1 mM IPArekin 24 orduz serumik gabeko ingurunean inkubatu direnak, Mitotracker™ Red CMXRos-ekin tindatutako mitokondrioen sareak eta DAPIrekin urdinez tindatutako nukleoak erakusten dituztenak. Datu guztiek gutxienez 15 irudi zituzten talde bakoitzeko. 10 Z-pila irudi eskuratu genituen lagin mota bakoitzerako. Z ardatzeko sekuentzia bakoitzak 30 xerra zituen, bakoitza 9,86 μm-ko lodierakoa. Eskala barra: 10 μm. B. Irudiari atalase moldagarria aplikatuz identifikatutako objektu adierazgarriak (mitokondrioak bakarrik). Mitokondrioen sare morfologikoen konexioen analisi kuantitatiboa eta alderaketa egin ziren talde bakoitzeko zelula guztientzat. C. Mitokondrioen forma-erlazioen maiztasuna. 0tik hurbil dauden balioek forma esferikoak adierazten dituzte, eta 1etik hurbil dauden balioek forma filamentosoak. D Mitokondrioen DNAren (mtDNA) edukia Material eta Metodoetan deskribatzen den moduan zehaztu zen. E Mitotracker™ Red CMXRos analisia fluxu-zitometria bidez egin zen (30.000 gertaera), Material eta Metodoetan deskribatzen den bezala. Datuak batez besteko ± SD gisa aurkezten dira, n = 3 esperimentu independente. Konparazio estatistikoak ANOVA norabide bakarrekoa eta Bonferroni post hoc proba erabiliz egin ziren. *p < 0,05; **p < 0,01; ***p < 0,001; ****p < 0,0001
Ondoren, LX-2 zelulen mtDNA edukia aztertu genuen mitokondrio kopuruaren adierazle gisa. Kontrol taldearekin alderatuta, mtDNA edukia handitu egin zen TGF-β1 tratatutako taldean (4D irudia). TGF-β1 tratatutako taldearekin alderatuta, mtDNA edukia gutxitu egin zen tratamendu konbinatuaren taldean (4D irudia), eta horrek iradokitzen du IPAk mtDNA edukia murriztu dezakeela eta, agian, mitokondrio kopurua eta mitokondrioen arnasketa ere (3C irudia). Gainera, badirudi IPAk mtDNA edukia murriztu zuela tratamendu konbinatuan, baina ez zuela eragin MTR-k eragindako mitokondrioen jardueran (4A-C irudiak).
IPAren eta LX-2 zelulen fibrosiarekin, apoptosiarekin, biziraupenean eta mitokondrioen dinamikarekin lotutako geneen mRNA mailekin duen lotura ikertu genuen (5A-D irudia). Kontrol-taldearekin alderatuta, TGF-β1-rekin tratatutako taldeak I motako kolageno α2 katea (COL1A2), α-muskulu leuneko aktina (αSMA), matrizearen metaloproteinasa 2 (MMP2), metaloproteinasa 1-en ehunen inhibitzailea (TIMP1) eta dinamina 1-en antzeko genea (DRP1) bezalako geneen adierazpen handiagoa erakutsi zuen, fibrosi eta aktibazio handiagoa adieraziz. Gainera, kontrol-taldearekin alderatuta, TGF-β1 tratamenduak pregnano nuklearraren X hartzailearen (PXR), kaspasa 8 (CASP8), MAPKAPK3, B-zelulen α inhibitzailearen, faktore nuklearraren κ genearen argi-peptidoaren indartzailearen (NFκB1A) eta faktore nuklearraren κB kinasa azpiunitate β (IKBKB) inhibitzailearen mRNA mailak murriztu zituen (5A-D irudia). TGF-β1 tratamenduarekin alderatuta, TGF-β1 eta IPArekin konbinatutako tratamenduak COL1A2 eta MMP2ren adierazpena murriztu zuen, baina PXR, TIMP1, B-zelulen linfoma-2 (BCL-2), CASP8, NFκB1A, NFκB1-β eta IKBKBren mRNA mailak handitu zituen. IPA tratamenduak MMP2, Bcl-2rekin lotutako X proteina (BAX), AKT1, atrofia optikoaren 1 proteina (OPA1) eta mitokondrioen fusio proteina 2 (MFN2) adierazpena nabarmen murriztu zuen, CASP8, NFκB1A, NFκB1B eta IKBKBren adierazpena, berriz, kontrol taldearekin alderatuta handitu zen. Hala ere, ez zen desberdintasunik aurkitu kaspasa-3 (CASP3), apoptosi peptidasa aktibatzeko faktore 1 (APAF1), mitokondrioen fusio proteina 1 (MFN1) eta fisio proteina 1 (FIS1) adierazpenean. Emaitza hauek, oro har, iradokitzen dute IPA tratamenduak fibrosiarekin, apoptosiarekin, biziraupenean eta mitokondrioen dinamikarekin lotutako geneen adierazpena modulatzen duela. Gure datuek iradokitzen dute IPA tratamenduak LX-2 zeluletan fibrosia murrizten duela; aldi berean, biziraupena estimulatzen du fenotipoa inaktibaziorantz aldatuz.
IPAk fibroblasto, apoptosi, bideragarritasun eta mitokondrio-dinamikako geneen adierazpena modulatzen du LX-2 zeluletan. Histogramek mRNAren adierazpena erakusten dute kontrol endogenoarekiko (RPLP0 edo PPIA) erlatiboan, LX-2 zelulak TGF-β1 eta IPArekin induzitu ondoren serumik gabeko ingurunean 24 orduz. A-k fibroblastoak adierazten ditu, B-k apoptosi diren zelulak adierazten ditu, C-k bizirik iraun duten zelulak adierazten ditu eta D-k mitokondrio-dinamikako geneen adierazpena adierazten du. Datuak batez besteko ± desbideratze estandar (DE) gisa aurkezten dira, n = 3 esperimentu independente. Konparazio estatistikoak ANOVA norabide bakarreko eta Bonferroni post hoc proba erabiliz egin ziren. *p < 0,05; **p < 0,01; ***p < 0,001; ****p < 0,0001
Ondoren, zelulen tamainaren (FSC-H) eta zitoplasma-konplexutasunaren (SSC-H) aldaketak fluxu-zitometriaren bidez ebaluatu ziren (6A eta B irudiak), eta IPA tratamenduaren ondoren zelulen morfologian izandako aldaketak transmisio-mikroskopia elektronikoaren (TEM) eta fase-kontraste-mikroskopiaren bidez ebaluatu ziren (6A eta B irudi osagarriak). Espero bezala, TGF-β1 tratatutako taldeko zelulak tamaina handitu egin ziren kontrol-taldearekin alderatuta (6A eta B irudiak), erretikulu endoplasmatiko zakarraren (ER*) eta fagolisosomen (P) hedapen klasikoa erakutsiz, zelula ama hematopoietikoen (HSC) aktibazioa adieraziz (6A eta B irudi osagarriak). Hala ere, TGF-β1 tratatutako taldearekin alderatuta, zelulen tamaina, zitoplasma-konplexutasuna (6A eta B irudiak) eta ER* edukia gutxitu egin ziren TGF-β1 eta IPA konbinazio-tratamendu-taldean (6A eta B irudi osagarriak). Gainera, IPA tratamenduak zelulen tamaina, zitoplasma-konplexutasuna (6A eta B irudiak), P eta ER* edukia (6A irudi osagarria) murriztu zituen kontrol-taldearekin alderatuta. Horrez gain, apoptosi-zelulen edukia handitu egin zen IPA tratamenduaren 24 ordu igaro ondoren, kontrol-taldearekin alderatuta (gezi zuriak, 6B irudi osagarria). Emaitza hauek, oro har, iradokitzen dute 1 mM IPAk HSC apoptosia estimulatu eta TGF-β1-ek eragindako zelulen parametro morfologikoen aldaketak alderantzikatu ditzakeela, horrela zelulen tamaina eta konplexutasuna erregulatuz, eta hori HSC inaktibazioarekin lotuta egon daiteke.
IPAk zelulen tamaina eta zitoplasma-konplexutasuna aldatzen ditu LX-2 zeluletan. Fluxu-zitometriaren analisiaren irudi adierazgarriak. Analisiak LX-2 zeluletarako berariazko ate-estrategia bat erabili zuen: SSC-A/FSC-A zelulen populazioa definitzeko, FSC-H/FSC-A bikoitzak identifikatzeko, eta SSC-H/FSC-H zelulen tamaina eta konplexutasunaren analisirako. Zelulak TGF-β1 (5 ng/ml) eta 1 mM IPArekin inkubatu ziren serumik gabeko ingurunean 24 orduz. LX-2 zelulak beheko ezkerreko koadrantean (SSC-H-/FSC-H-), goiko ezkerreko koadrantean (SSC-H+/FSC-H-), beheko eskuineko koadrantean (SSC-H-/FSC-H+) eta goiko eskuineko koadrantean (SSC-H+/FSC-H+) banatu ziren zelulen tamaina eta zitoplasma-konplexutasunaren analisirako. B. Zelulen morfologia fluxu-zitometriaren bidez aztertu zen, FSC-H (aurreranzko sakabanaketa, zelularen tamaina) eta SSC-H (alboko sakabanaketa, zitoplasma-konplexutasuna) erabiliz (30.000 gertaera). Datuak batez besteko ± SD gisa aurkezten dira, n = 3 esperimentu independente. Konparazio estatistikoak ANOVA norabide bakarrekoa eta Bonferroni post hoc testa erabiliz egin ziren. *p < 0,05; **p < 0,01; ***p < 0,001 eta ****p < 0,0001
Hesteetako metabolitoak, hala nola IPA, ikerketa-gai bero bihurtu dira, eta horrek iradokitzen du hesteetako mikrobiotan jomuga berriak aurki daitezkeela. Beraz, interesgarria da gizakien gibeleko fibrosiarekin lotu dugun metabolito bat den IPA [15], konposatu antifibrotiko potentziala dela frogatu izana animalia-ereduetan [13, 14]. Hemen, lehen aldiz erakusten dugu serumeko IPAren eta gibeleko transkriptomika globalaren eta DNAren metilazioaren arteko lotura 2 motako diabetesa (T2D) ez duten pertsona obesoetan, apoptosia, mitofagia eta iraupena nabarmenduz, baita gibeleko homeostasia erregulatzen duen AKT1 gene hautagai posible bat ere. Gure ikerketaren beste berritasun bat da IPA tratamenduak apoptosiarekin, zelulen morfologiarekin, mitokondrioen bioenergetikarekin eta dinamikarekin duen elkarrekintza frogatu dugula LX-2 zeluletan, energia-espektro baxuago bat adieraziz, HSC fenotipoa inaktibaziorantz aldatzen duena, eta horrek IPA gibeleko fibrosia hobetzeko hautagai potentzial bihurtzen du.
Apoptosia, mitofagia eta iraupen-luzera zirela ikusi genuen zirkulazio-serumeko IPArekin lotutako gibeleko geneetan aberastutako bide kanoniko garrantzitsuenak. Mitokondrioen kalitate-kontrolaren (MQC) sistemaren etenak mitokondrioen disfuntzioa, mitofagia eta apoptosia ekar ditzake, eta horrela MASLDren agerpena sustatu [33, 34]. Beraz, espekula dezakegu IPAk zelulen dinamika eta mitokondrioen osotasuna mantentzen parte har dezakeela apoptosiaren, mitofagiaren eta gibeleko iraupen-luzeraren bidez. Gure datuek erakutsi zuten bi gene komunak zirela hiru analisietan: YKT6 eta AKT1. Aipatzekoa da YKT6 zelula-mintzen fusio-prozesuan parte hartzen duen SNARE proteina bat dela. Autofagian eta mitofagian zeregina du, STX17 eta SNAP29rekin hasiera-konplexu bat eratuz autofagosoman, eta horrela autofagosomen eta lisosomen fusioa sustatuz [35]. Gainera, YKT6 funtzioaren galerak mitofagia kaltetzen du [36], eta YKT6-ren erregulazioa goranzkoa hepatozelula-kartzinomaren (HCC) progresioarekin lotuta dago, zelulen biziraupena handituz [37]. Bestalde, AKT1 elkarreragiten duen gene garrantzitsuena da eta gibeleko gaixotasunetan zeregin garrantzitsua du, besteak beste, PI3K/AKT seinaleztapen-bidea, zelula-zikloa, zelulen migrazioa, ugalketa, atxikimendu fokala, mitokondrioen funtzioa eta kolagenoaren jariapena [38–40]. PI3K/AKT seinaleztapen-bide aktibatuak zelula ama hematopoietikoak (HSC) aktiba ditzake, matrize estrazelularraren (ECM) ekoizpenaz arduratzen diren zelulak direnak, eta haren deserregulazioak gibeleko fibrosiaren agerpena eta progresioa lagun dezake [40]. Horrez gain, AKT zelula-biziraupenaren faktore gakoetako bat da, p53-menpeko zelulen apoptosia inhibitzen duena, eta AKT-ren aktibazioa gibeleko zelulen apoptosiaren inhibizioarekin lotuta egon daiteke [41, 42]. Lortutako emaitzek iradokitzen dute IPA gibeleko mitokondrioekin lotutako apoptosian parte hartu dezakeela, hepatozitoek apoptosian sartzearen edo biziraupenaren arteko erabakian eraginez. Efektu hauek AKT eta/edo YKT6 hautagai geneek erregulatu ditzakete, eta hauek funtsezkoak dira gibelaren homeostasiarentzat.
Gure emaitzek erakutsi zuten 1 mM IPAk apoptosia eragin eta mitokondrioen arnasketa gutxitu zuela LX-2 zeluletan, TGF-β1 tratamenduarekiko independenteki. Azpimarratzekoa da apoptosia fibrosiaren ebazpenerako eta zelula ama hematopoietikoen (HSC) aktibaziorako bide nagusia dela, eta baita gibeleko fibrosiaren erantzun fisiologiko itzulgarrian gertaera gakoa ere [4, 43]. Gainera, LX-2 zeluletan BHIren leheneratzeak tratamendu konbinatuaren ondoren ikuspegi berriak eman zituen IPAk mitokondrioen bioenergetikaren erregulazioan duen potentzialaren inguruan. Atseden-baldintza eta baldintza inaktiboetan, zelula hematopoietikoek normalean mitokondrioen fosforilazio oxidatiboa erabiltzen dute ATP ekoizteko eta jarduera metaboliko baxua dute. Bestalde, HSC aktibazioak mitokondrioen arnasketa eta biosintesia hobetzen ditu egoera glukolitikoan sartzeko energia-eskaerak konpentsatzeko [44]. IPAk ez zuela potentzial metabolikoan eta ECAR-ean eraginik izan iradokitzen du bide glukolitikoari lehentasun gutxiago ematen zaiola. Era berean, beste ikerketa batek erakutsi zuen 1 mM IPAk gai zela mitokondrioen arnas katearen jarduera modulatzeko kardiomiozitoetan, gizakien hepatozitoen zelula-lerroan (Huh7) eta gizakien zilbor-zainaren zelula endotelialetan (HUVEC); Hala ere, ez zen IPAren eraginik aurkitu kardiomiozitoen glukolisian, eta horrek iradokitzen du IPAk beste zelula mota batzuen bioenergetikan eragina izan dezakeela [45]. Beraz, espekulatzen dugu 1 mM IPAk desakoplatzaile kimiko arin gisa joka dezakeela, gene fibrogenikoaren adierazpena, zelulen morfologia eta mitokondrioen bioenergetika nabarmen murriztu baitezake mtDNAren kantitatea aldatu gabe [46]. Mitokondrioen desakoplatzaileek kulturak eragindako fibrosia eta HSCren aktibazioa inhibi ditzakete [47] eta proteina batzuek, hala nola desakoplatzaile-proteinek (UCP) edo adenina nukleotido translokasak (ANT), erregulatutako edo induzitutako ATP mitokondrialaren ekoizpena murriztu. Zelula motaren arabera, fenomeno honek zelulak apoptositik babestu eta/edo apoptosia sustatu dezake [46]. Hala ere, ikerketa gehiago behar dira IPAk zelula hematopoietikoen inaktibazioan mitokondrioen desakoplatzaile gisa duen eginkizuna argitzeko.
Ondoren, mitokondrioen arnasketa-aldaketak LX-2 zelula bizidunen mitokondrioen morfologian islatzen diren ikertu genuen. Interesgarria da, TGF-β1 tratamenduak mitokondrioen proportzioa esferikotik tartekora aldatzen duela, mitokondrioen adarkadura gutxituz eta DRP1-en adierazpena handituz, mitokondrioen fisioan funtsezko faktorea dena [48]. Gainera, mitokondrioen zatikatzea sarearen konplexutasun orokorrarekin lotuta dago, eta fusiotik fisiorako trantsizioa funtsezkoa da zelula ama hematopoietikoen (HSC) aktibaziorako, mitokondrioen fisioaren inhibizioak HSC apoptosia eragiten duen bitartean [49]. Beraz, gure emaitzek adierazten dute TGF-β1 tratamenduak mitokondrioen sarearen konplexutasunaren gutxitzea eragin dezakeela adarkadura gutxituz, eta hori ohikoagoa da zelula ama hematopoietiko aktibatuekin (HSC) lotutako mitokondrioen fisioan. Gainera, gure datuek erakutsi zuten IPAk mitokondrioen proportzioa forma esferikotik tartekora alda dezakeela, eta horrela OPA1 eta MFN2-ren adierazpena murriztuz. Ikerketek erakutsi dute OPA1-en beheranzko erregulazioak mitokondrioen mintz-potentzialaren gutxitzea eragin dezakeela eta zelulen apoptosia eragin dezakeela [50]. MFN2-k mitokondrioen fusioa eta apoptosia bitartekatzen dituela ezagutzen da [51]. Lortutako emaitzek iradokitzen dute TGF-β1 eta/edo IPAren bidezko LX-2 zelulen indukzioak mitokondrioen forma eta tamaina modulatzen dituela, baita aktibazio egoera eta sarearen konplexutasuna ere.
Gure emaitzek adierazten dute TGFβ-1 eta IPAren konbinazio-tratamenduak mtDNA eta zelulen parametro morfologikoak murriztu ditzakeela, fibrosiaren, apoptosiaren eta biziraupenarekin lotutako geneen mRNAren adierazpena erregulatuz apoptosiari ihes egiten dioten zeluletan. Izan ere, IPAk AKT1en eta COL1A2 eta MMP2 bezalako fibrosi-gene garrantzitsuen mRNAren adierazpen-maila gutxitu zuen, baina CASP8ren adierazpen-maila handitu zuen, apoptosiarekin lotuta dagoena. Gure emaitzek erakutsi zuten IPA tratamenduaren ondoren, BAX adierazpena gutxitu egin zela eta TIMP1 familiako azpiunitateen, BCL-2 eta NF-κBren mRNAren adierazpena handitu egin zela, eta horrek iradokitzen du IPAk biziraupen-seinaleak estimula ditzakeela apoptosiari ihes egiten dioten zelula ama hematopoietikoetan (HSC). Molekula hauek biziraupen-proseinale gisa joka dezakete zelula ama hematopoietiko aktibatuetan, eta hori apoptosiaren aurkako proteinen adierazpena handitzearekin (Bcl-2 bezalakoak), BAX proapoptotikoaren adierazpena gutxitzearekin eta TIMP eta NF-κBren arteko elkarrekintza konplexu batekin lotuta egon daitekeela [5, 7]. IPAk PXRren bidez eragiten ditu efektuak, eta ikusi dugu TGF-β1 eta IPArekin konbinatutako tratamenduak PXR mRNAren espresio mailak handitu zituela, HSCren aktibazioaren inhibizioa adieraziz. Jakina da PXR seinaleztapen aktibatuak HSCren aktibazioa inhibitzen duela bai in vivo bai in vitro [52, 53]. Gure emaitzek adierazten dute IPAk HSC aktibatuen garbiketan parte har dezakeela apoptosia sustatuz, fibrosia eta mitokondrioen metabolismoa murriztuz eta biziraupen seinaleak hobetuz, eta horiek dira HSC fenotipo aktibatua inaktibatu bihurtzen duten prozesu tipikoak. IPAk apoptosian duen mekanismo eta eginkizun potentzialaren beste azalpen posible bat da mitokondrio disfuntzionalak batez ere mitofagiaren (bide intrintsekoa) eta TNF seinaleztapen bide estrinsekoaren bidez (1. taula) kentzen dituela, eta hori zuzenean lotuta dago NF-κB biziraupen seinaleztapen bidearekin (7. irudi osagarria). Interesgarria da, IPArekin lotutako gene aberastuek pro-apoptosia eta pro-biziraupen seinaleak eragitea apoptosi bidean [54], eta horrek iradokitzen du IPAk apoptosi bidea edo biziraupena eragin dezakeela gene hauekin elkarreraginez. Hala ere, nola eragiten duen IPAk apoptosia edo biziraupena HSC aktibazioan eta bere bide mekanistikoak ez daude argi oraindik.
IPA hesteetako mikrobiotaren bidez dietako triptofanotik sortzen den metabolito mikrobiano bat da. Ikerketek erakutsi dute propietate antiinflamatorioak, antioxidatzaileak eta epigenetiko erregulatzaileak dituela hesteetako ingurunean.[55] Ikerketek erakutsi dute IPAk hesteetako hesi-funtzioa modulatu eta estres oxidatiboa murriztu dezakeela, eta horrek bere efektu fisiologiko lokaletan lagun dezakeela.[56] Izan ere, IPA zirkulazioaren bidez garraiatzen da organo xedagarrietara, eta IPAk metabolito nagusiaren egitura antzekoa partekatzen duenez triptofano, serotonina eta indol deribatuekin, IPAk ekintza metabolikoak egiten ditu, eta horrek patu metaboliko lehiakorrak eragiten ditu.[52] IPAk triptofanotik eratorritako metabolitoekin lehiatu daiteke entzimetan edo hartzaileetan lotura-guneengatik, eta horrek bide metaboliko normalak eten ditzake. Horrek azpimarratzen du bere farmakokinetika eta farmakodinamikari buruzko ikerketa gehiago egiteko beharra, bere leiho terapeutikoa hobeto ulertzeko.[57] Ikusi behar da ea hau zelula ama hematopoietikoetan (HSC) ere gerta daitekeen.
Gure ikerketak muga batzuk dituela onartzen dugu. IPArekin lotutako loturak zehazki aztertzeko, 2 motako diabetes mellitus (T2DM) duten pazienteak baztertu genituen. Horrek gure aurkikuntzen aplikagarritasun zabala mugatzen duela onartzen dugu 2 motako diabetes mellitus eta gibeleko gaixotasun aurreratua duten pazienteetan. Giza serumean IPAren kontzentrazio fisiologikoa 1-10 μM den arren [11, 20], 1 mM-ko IPA kontzentrazioa aukeratu zen kontzentrazio ez-toxiko altuenean [15] eta apoptosi-tasa altuenean oinarrituta, zelula nekrosikoen populazioaren ehunekoan alderik gabe. Ikerketa honetan IPAren maila suprafisiologikoak erabili diren arren, gaur egun ez dago adostasunik IPAren dosi eraginkorrari buruz [52]. Gure emaitzak esanguratsuak diren arren, IPAren patu metaboliko zabalagoa ikerketa-eremu aktiboa izaten jarraitzen du. Gainera, serumeko IPA mailen eta gibeleko transkripzioen DNA metilazioen arteko loturari buruzko gure aurkikuntzak ez ziren zelula ama hematopoietikoetatik (HSC) bakarrik lortu, baita gibeleko ehunetatik ere. Giza LX-2 zelulak erabiltzea aukeratu genuen transkriptomaren analisietatik lortutako aurreko aurkikuntzetan oinarrituta, zeinetan IPA zelula ama hematopoietikoen (HSC) aktibazioarekin lotuta dagoen [15], eta HSCak gibeleko fibrosiaren progresioan parte hartzen duten zelula nagusiak diren. Gibela zelula mota anitzez osatuta dago, beraz, beste zelula-eredu batzuk kontuan hartu beharko lirateke IPAren eginkizuna eta beste gibeleko zelula motekin duen elkarrekintza aztertzeko, hala nola hepatozito-HSC-zelulen immune ko-kultura sistema, kaspasa aktibazioaren eta DNA zatikatzearen konbinazioa, baita ekintza-mekanismoa ere, proteina maila barne.