Eskerrik asko nature.com bisitatzeagatik. Erabiltzen ari zaren arakatzailearen bertsioak CSS laguntza mugatua du. Esperientzia onena lortzeko, arakatzailearen azken bertsioa erabiltzea gomendatzen dizugu (edo Internet Explorer-en bateragarritasun modua desaktibatzea). Gainera, laguntza jarraitua bermatzeko, gune honek ez ditu estiloak edo JavaScript-ak izango.
Hidrogeno sulfuroak (H2S) hainbat eragin fisiologiko eta patologiko ditu giza gorputzean. Sodio hidrosulfuroa (NaHS) oso erabilia da tresna farmakologiko gisa H2S-ren efektuak ebaluatzeko esperimentu biologikoetan. NaHS disoluzioetatik H2S galtzeak minutu gutxi batzuk besterik ez baditu ere, NaHS disoluzioak erabili dira edateko uretan H2S-rako konposatu emaile gisa animalia-ikerketa batzuetan. Ikerketa honek ikertu zuen ea arratoi/sagu botiletan prestatutako 30 μM-ko NaHS kontzentrazioa duen edateko ura gutxienez 12-24 orduz egonkor mantendu zitekeen, egile batzuek iradokitzen duten bezala. Prestatu NaHS (30 μM) disoluzio bat edateko uretan eta bota berehala arratoi/sagu ur botiletan. Laginak bildu ziren ur botilaren puntatik eta barrutik 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 12 eta 24 ordutan, metileno urdinaren metodoa erabiliz sulfuro edukia neurtzeko. Horrez gain, arratoi ar eta emeei NaHS (30 μM) injektatu zitzaien bi astez, eta serumeko sulfuro-kontzentrazioak bi egunetik behin neurtu ziren lehenengo astean eta bigarren astearen amaieran. Ur-botilaren puntatik lortutako laginaren NaHS disoluzioa ezegonkorra zen; % 72 eta % 75 jaitsi zen 12 eta 24 ordu igaro ondoren, hurrenez hurren. Ur-botilen barrutik lortutako laginetan, NaHS-ren jaitsiera ez zen esanguratsua izan 2 orduko epean; hala ere, % 47 eta % 72 jaitsi zen 12 eta 24 ordu igaro ondoren, hurrenez hurren. NaHS injekzioak ez zuen eraginik izan arratoi ar eta emeen serumeko sulfuro-mailan. Ondorioz, edateko urarekin prestatutako NaHS disoluzioak ez dira H2S dohaintzarako erabili behar, disoluzioa ezegonkorra baita. Administrazio-bide honek animaliak NaHS kantitate irregular eta espero baino txikiagoak jasango ditu.
Hidrogeno sulfuroa (H2S) toxina gisa erabili izan da 1700etik; hala ere, Abe eta Kimura-k deskribatu zuten 1996an bioseinaleztapen molekula endogeno gisa izan dezakeen balizko eginkizuna. Azken hiru hamarkadetan, H2S-k hainbat funtzio argitu dira giza sistematan, eta horrek H2S emaile molekulek aplikazio klinikoak izan ditzaketela konturatzera eraman du zenbait gaixotasunen tratamenduan edo kudeaketan; ikus Chirino et al.-en azken berrikuspen bat.
Sodio hidrosulfuroa (NaHS) oso erabilia izan da tresna farmakologiko gisa H2S-ren efektuak ebaluatzeko zelula-kultura eta animalien ikerketa askotan5,6,7,8. Hala ere, NaHS ez da H2S emaile aproposa, disoluzioan azkar H2S/HS- bihurtzen baita, erraz kutsatzen baita polisulfuroekin eta erraz oxidatzen eta lurruntzen baita4,9. Esperimentu biologiko askotan, NaHS uretan disolbatzen da, eta horren ondorioz H2S10,11,12-ren lurruntze pasiboa eta galera, H2S11,12,13-ren oxidazio espontaneoa eta fotolisia14 gertatzen dira. Jatorrizko disoluzioko sulfuroa oso azkar galtzen da H2S11-ren lurruntzearen ondorioz. Ontzi ireki batean, H2S-ren erdibizitza (t1/2) 5 minutu ingurukoa da, eta bere kontzentrazioa minutuko % 13 inguru jaisten da10. NaHS disoluzioetatik hidrogeno sulfuroa galtzeak minutu gutxi batzuk besterik ez baditu ere, animalia-ikerketa batzuek NaHS disoluzioak erabili dituzte edateko uretan hidrogeno sulfuroaren iturri gisa 1-21 astez, NaHS duen disoluzioa 12-24 orduro ordezkatuz.15,16,17,18,19,20,21,22,23,24,25,26 Praktika hau ez dator bat ikerketa zientifikoaren printzipioekin, sendagaien dosiak beste espezie batzuetan, batez ere gizakietan, duten erabileran oinarritu behar baitira.27
Biomedikuntzako ikerketa preklinikoek pazienteen arretaren edo tratamenduen emaitzen kalitatea hobetzea dute helburu. Hala ere, animalien ikerketa gehienen emaitzak ez dira oraindik gizakietara itzuli28,29,30. Itzulpen-hutsegite honen arrazoietako bat animalien ikerketen kalitate metodologikoari ematen zaion arreta falta da30. Beraz, ikerketa honen helburua arratoi/sagu ur botiletan prestatutako 30 μM-ko NaHS disoluzioak edateko uretan 12-24 orduz egonkor mantendu zitezkeen ikertzea izan zen, ikerketa batzuetan baieztatu edo iradokitzen den bezala.
Ikerketa honetako esperimentu guztiak Iranen laborategiko animalien zaintza eta erabilerarako argitaratutako jarraibideen arabera egin ziren31. Ikerketa honetako txosten esperimental guztiek ARRIVE jarraibideak jarraitu zituzten32. Shahid Beheshti Medikuntza Zientzien Unibertsitateko Endokrino Zientzien Institutuko Etika Batzordeak ikerketa honetako prozedura esperimental guztiak onartu zituen.
Zink azetato dihidratoa (CAS: 5970-45-6) eta burdin kloruro anhidroa (CAS: 7705-08-0) Biochem, Chemopahrama-tik (Cosne-sur-Loire, Frantzia) erosi ziren. Sodio hidrosulfuro hidratoa (CAS: 207683-19-0) eta N,N-dimetil-p-fenilendiamina (DMPD) (CAS: 535-47-0) Sigma-Aldrich-etik (St. Louis, MO, AEB) erosi ziren. Isofluranoa Piramal-etik (Bethlehem, PA, AEB) erosi zen. Azido klorhidrikoa (HCl) Merck-etik (Darmstadt, Alemania) erosi zen.
Prestatu NaHS disoluzio bat (30 μM) edateko uretan eta bota berehala arratoien/saguen ur botiletan. Kontzentrazio hau aukeratu da H2S iturri gisa NaHS erabiltzen duten hainbat argitalpenetan oinarrituta; ikusi Eztabaida atala. NaHS molekula hidratatua da, hidratazio ur kantitate desberdinak izan ditzakeena (hau da, NaHS•xH2O); fabrikatzailearen arabera, gure ikerketan erabilitako NaHS ehunekoa % 70,7 izan zen (hau da, NaHS•1,3 H2O), eta balio hau kontuan hartu genuen gure kalkuluetan, non 56,06 g/mol-ko pisu molekularra erabili genuen, hau da, NaHS anhidroaren pisu molekularra. Hidratazio ura (kristalizazio ura ere deitua) egitura kristalinoa osatzen duten ur molekulak dira33. Hidratoek propietate fisiko eta termodinamiko desberdinak dituzte anhidratoekin alderatuta34.
NaHS edateko urari gehitu aurretik, neurtu disolbatzailearen pHa eta tenperatura. Berehala bota NaHS disoluzioa arratoi/sagu ur botilara animalia kaiolan. Laginak puntatik eta ur botilaren barrutik bildu ziren 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 12 eta 24 ordutan sulfuro edukia neurtzeko. Sulfuroen neurketak laginketa bakoitzaren ondoren hartu ziren berehala. Hodiaren puntatik lortu genituen laginak, zenbait ikerketek erakutsi baitute ur hodiaren poro-tamaina txikiak H2S lurrunketa minimizatu dezakeela15,19. Badirudi arazo hau botilako disoluzioari ere aplikatzen zaiola. Hala ere, ez zen hori gertatu ur botilaren lepoan zegoen disoluzioarekin, lurruntze-tasa handiagoa baitzuen eta autooxidatzailea baitzen; izan ere, animaliek ur hori edan zuten lehenik.
Wistar arratoi arrak eta emeak erabili ziren ikerketan. Arratoiak polipropilenozko kaioletan eduki ziren (2-3 arratoi kaiola bakoitzeko) baldintza estandarretan (tenperatura 21-26 °C, hezetasuna % 32-40), 12 orduko argitasunarekin (goizeko 7etatik gaueko 7etara) eta 12 orduko iluntasunarekin (gaueko 7etatik gaueko 7etara). Arratoiek iturriko ura eskura zuten eta janari estandarrarekin (Khorak Dam Pars Company, Teheran, Iran) elikatu ziren. Adinaren arabera (6 hilabete) Wistar arratoi emeak (n=10, gorputz-pisua: 190-230 g) eta arrak (n=10, gorputz-pisua: 320-370 g) ausaz banatu ziren kontrol-taldeetan eta NaHS (30 μM) tratatutako taldeetan (n=5 talde bakoitzeko). Laginaren tamaina zehazteko, KISS (Keep It Simple, Stupid) metodoa erabili genuen, aurreko esperientzia eta potentzia-analisia konbinatzen dituena35. Lehenik eta behin, 3 arratoirekin ikerketa pilotu bat egin genuen eta serumeko sulfuro maila totalaren batez bestekoa eta desbideratze estandarra zehaztu genituen (8,1 ± 0,81 μM). Ondoren, % 80ko potentzia kontuan hartuta eta bi aldeetako % 5eko esangura-maila suposatuz, lagin-tamaina aurretiazko bat zehaztu genuen (n = 5, aurreko literaturan oinarrituta), 2,02ko efektu-tamaina estandarizatu bati zegokiona, Festingek animalia esperimentalen lagin-tamaina kalkulatzeko iradokitako balio aurrez definitua erabiliz35. Balio hau SD-z biderkatu ondoren (2,02 × 0,81), aurreikusitako efektu-tamaina detektagarria (1,6 μM) % 20koa izan zen, eta hori onargarria da. Horrek esan nahi du n = 5/taldea nahikoa dela taldeen arteko % 20ko batez besteko aldaketa detektatzeko. Arratoiak ausaz banatu ziren kontrol-taldeetan eta NaSH-rekin tratatutako taldeetan, Excel softwarearen 36 funtzio ausazkoa erabiliz (1. irudi osagarria). Itsutzea emaitzen mailan egin zen, eta neurketa biokimikoak egiten zituzten ikertzaileek ez zekiten taldeen esleipenen berri.
Bi sexuetako NaHS taldeak edateko uretan prestatutako 30 μM-ko NaHS disoluzioarekin tratatu ziren 2 astez; disoluzio freskoa eman zen 24 orduro, eta denbora horretan gorputzaren pisua neurtu zen. Odol laginak arratoi guztien isats-puntetatik bildu ziren isoflurano anestesiapean, bi egunetik behin, lehenengo eta bigarren asteen amaieran. Odol laginak 3000 g-tan zentrifugatu ziren 10 minutuz, seruma bereizi eta -80 °C-tan gorde zen ondoren serumeko urea, kreatinina (Cr) eta sulfuro totala neurtzeko. Serumeko urea ureasa metodo entzimatikoaren bidez zehaztu zen, eta serumeko kreatinina Jaffe metodo fotometrikoaren bidez zehaztu zen, merkataritzan eskuragarri dauden kitak (Man Company, Teheran, Iran) eta analizatzaile automatiko bat (Selectra E, 0-2124 serie-zenbakia, Herbehereak) erabiliz. Urearen eta Cr-ren aldakuntza-koefiziente intra- eta inter-saiakuntzak % 2,5 baino txikiagoak izan ziren.
Metileno urdinaren (MB) metodoa edateko uretan eta NaHS duen serumean sulfuro totala neurtzeko erabiltzen da; MB da soluzio masiboetan eta lagin biologikoetan sulfuroa neurtzeko metodorik erabiliena11,37. MB metodoa sulfuro multzo osoa kalkulatzeko38 eta sulfuro ez-organikoak neurtzeko erabil daiteke H2S, HS- eta S2 moduan fase urtsuan39. Metodo honetan, sufrea zink sulfuro (ZnS) gisa prezipitatzen da zink azetatoaren aurrean11,38. Zink azetatoaren prezipitazioa da sulfuroak beste kromoforoetatik bereizteko metodorik erabiliena11. ZnS HCl11 erabiliz berriro disolbatu zen baldintza oso azidoetan. Sulfuroak DMPDrekin erreakzionatzen du 1:2ko proportzio estekiometrikoan kloruro burdinikoak katalizatutako erreakzio batean (Fe3+ oxidatzaile gisa jokatzen du) MB koloratzailea osatzeko, eta hau espektrofotometrikoki detektatzen da 670 nm-tan40,41. MB metodoaren detekzio muga 1 μM11 ingurukoa da.
Ikerketa honetan, lagin bakoitzeko 100 μL (soluzioa edo seruma) hodi batera gehitu ziren; ondoren, 200 μL zink azetato (% 1 w/v ur destilatuan), 100 μL DMPD (20 mM 7,2 M HCl-tan) eta 133 μL FeCl3 (30 mM 1,2 M HCl-tan) gehitu ziren. Nahastea 37 °C-tan inkubatu zen iluntasunean 30 minutuz. Soluzioa 10.000 g-tan zentrifugatu zen 10 minutuz, eta gainnadantearen absortzioa 670 nm-tan irakurri zen mikroplaka irakurgailu bat erabiliz (BioTek, MQX2000R2, Winooski, VT, AEB). Sulfuro kontzentrazioak NaHS-ren (0–100 μM) kalibrazio kurba bat erabiliz zehaztu ziren ddH2O-tan (2. irudi osagarria). Neurketetarako erabilitako soluzio guztiak fresko prestatu ziren. Sulfuroen neurketen saiakuntza barruko eta arteko aldakuntza-koefizienteak % 2,8 eta % 3,4 izan ziren, hurrenez hurren. Sodio tiosulfatoa duten edateko uraren eta serumaren laginetatik berreskuratutako sulfuro osoa ere zehaztu genuen, lagin aberastuaren metodoa erabiliz42. Sodio tiosulfatoa duten edateko uraren eta serumaren laginen berreskurapenak % 91 ± 1,1 (n = 6) eta % 93 ± 2,4 (n = 6) izan ziren, hurrenez hurren.
Analisi estatistikoa GraphPad Prism softwarearen 8.0.2 bertsioa erabiliz egin zen Windows-erako (GraphPad Software, San Diego, CA, AEB, www.graphpad.com). T-proba parekatua erabili zen edateko uraren tenperatura eta pHa alderatzeko NaHS gehitu aurretik eta ondoren. NaHS duen disoluzioan H2S-ren galera oinarrizko xurgapenarekiko ehuneko jaitsiera gisa kalkulatu zen, eta galera estatistikoki esanguratsua zen ebaluatzeko, neurri errepikatuen ANOVA bat egin genuen, eta ondoren Dunnett-en konparazio anitzeko proba. Gorputz-pisua, urea serikoa, kreatinina serikoa eta sulfuro seriko osoa denboran zehar alderatu ziren sexu ezberdinetako kontrol- eta NaHS-tratatutako arratoien artean, bi norabideko ANOVA misto bat (barruko bien artean) erabiliz, eta ondoren Bonferroni post hoc proba bat erabiliz. 0,05 baino gutxiagoko P balio bi-aldetakoak estatistikoki esanguratsutzat jo ziren.
Edateko uraren pHa 7,60 ± 0,01 zen NaHS gehitu aurretik eta 7,71 ± 0,03 NaHS gehitu ondoren (n = 13, p = 0,0029). Edateko uraren tenperatura 26,5 ± 0,2 zen eta 26,2 ± 0,2ra jaitsi zen NaHS gehitu ondoren (n = 13, p = 0,0128). Prestatu 30 μM-ko NaHS disoluzioa edateko uretan eta gorde ur botila batean. NaHS disoluzioa ezegonkorra da eta bere kontzentrazioa denboran zehar gutxitzen da. Ur botilaren lepotik lagina hartzean, jaitsiera nabarmena (% 68,0) ikusi zen lehenengo orduan, eta disoluzioko NaHS edukia % 72 eta % 75 jaitsi zen 12 eta 24 ordu igaro ondoren, hurrenez hurren. Ur botiletatik lortutako laginetan, NaHS-ren murrizketa ez zen esanguratsua izan 2 ordura arte, baina 12 eta 24 ordu igaro ondoren % 47 eta % 72 jaitsi zen, hurrenez hurren. Datu hauek adierazten dute edateko uretan prestatutako 30 μM-ko disoluzio batean NaHS-ren ehunekoa hasierako balioaren laurden batera jaitsi zela 24 ordu igaro ondoren, laginketa-kokapena edozein dela ere (1. irudia).
NaHS disoluzioaren (30 μM) egonkortasuna arratoi/sagu botiletan edateko uretan. Disoluzioa prestatu ondoren, laginak hartu ziren puntatik eta ur botilaren barrualdetik. Datuak batez besteko ± SD gisa aurkezten dira (n = 6/taldea). * eta #, P < 0,05 0 denborarekin alderatuta. Ur botilaren argazkiak punta (irekidurarekin) eta botilaren gorputza erakusten ditu. Puntaren bolumena gutxi gorabehera 740 μL da.
30 μM-ko disoluzio freskoan NaHS-ren kontzentrazioa 30,3 ± 0,4 μM-koa zen (tartea: 28,7–31,9 μM, n = 12). Hala ere, 24 ordu igaro ondoren, NaHS-ren kontzentrazioa balio baxuago batera jaitsi zen (batez bestekoa: 3,0 ± 0,6 μM). 2. irudian ikusten den bezala, arratoiek jasan zituzten NaHS-ren kontzentrazioak ez ziren konstanteak izan ikerketa-aldian zehar.
Arratoi emeen gorputz-pisua nabarmen handitu zen denboran zehar (205,2 ± 5,2 g-tik 213,8 ​​± 7,0 g-ra kontrol-taldean eta 204,0 ± 8,6 g-tik 211,8 ± 7,5 g-ra NaHS-rekin tratatutako taldean); hala ere, NaHS tratamenduak ez zuen eraginik izan gorputz-pisuan (3. irudia). Arratoi arren gorputz-pisua nabarmen handitu zen denboran zehar (338,6 ± 8,3 g-tik 352,4 ± 6,0 g-ra kontrol-taldean eta 352,4 ± 5,9 g-tik 363,2 ± 4,3 g-ra NaHS-rekin tratatutako taldean); hala ere, NaHS tratamenduak ez zuen eraginik izan gorputz-pisuan (3. irudia).
NaHS (30 μM) eman ondoren arratoi eme eta arren gorputz-pisuaren aldaketak. Datuak batez besteko ± SEM gisa aurkezten dira eta Bonferroni post hoc testarekin egindako bariantzaren bi norabideko analisi mistoa (barruan-artean) erabiliz alderatu ziren. n = 5 sexu bakoitzeko talde bakoitzean.
Urea eta kreatina fosfatoaren serumaren kontzentrazioak antzekoak izan ziren kontrol-taldeko arratoietan eta NaSH-rekin tratatutako arratoietan ikerketa osoan zehar. Gainera, NaSH tratamenduak ez zuen eraginik izan urea eta kreatinakromoaren serumaren kontzentrazioetan (1. taula).
Oinarrizko serumeko sulfuro-kontzentrazio totalak parekoak izan ziren kontrol-taldeko eta NaHSz tratatutako arratoien artean, ar (8,1 ± 0,5 μM vs. 9,3 ± 0,2 μM) eta eme (9,1 ± 1,0 μM vs. 6,1 ± 1,1 μM). NaHS 14 egunez administratzeak ez zuen eraginik izan serumeko sulfuro-maila totaletan, ez ar ez emeetan (4. irudia).
NaHS (30 μM) eman ondoren arratoi ar eta emeen serumeko sulfuro kontzentrazio totalen aldaketak. Datuak batez besteko ± SEM gisa aurkezten dira eta Bonferroni post hoc testarekin egindako bariantzaren bi norabideko analisi mistoa (barruan-barruan) erabiliz alderatu ziren. Sexu bakoitzeko, n = 5/taldea.
Ikerketa honen ondorio nagusia da NaHS duen edateko ura ezegonkorra dela: hasierako sulfuro eduki osoaren laurden bat baino ezin da detektatu arratoien/saguen ur botilen puntatik eta barrutik laginketa hartu eta 24 ordura. Gainera, arratoiak NaHS kontzentrazio ezegonkorren eraginpean egon ziren NaHS disoluzioan H2S galtzeagatik, eta NaHS edateko urari gehitzeak ez zuen eraginik izan gorputzaren pisuan, serumeko urean eta kreatina kromoan, edo serumeko sulfuro osoan.
Ikerketa honetan, edateko uretan prestatutako 30 μM-ko NaHS disoluzioetatik H2S galera-tasa orduko % 3 ingurukoa izan zen. Soluzio tamponatu batean (100 μM sodio sulfuro 10 mM PBS-tan, pH 7,4), sulfuro-kontzentrazioa % 7 gutxitu zela jakinarazi zen denboran zehar 8 ordutan11. Aurretik defendatu dugu NaHS-ren administrazio intraperitoneala, edateko uretan 54 μM-ko NaHS disoluzio batetik sulfuro-galera-tasa orduko % 2,3 ingurukoa zela jakinaraziz (% 4/ordu lehenengo 12 orduetan eta % 1,4/ordu azken 12 orduetan prestatu ondorengo)8. Aurreko ikerketek43 H2S galera konstantea aurkitu zuten NaHS disoluzioetatik, batez ere lurrunketaren eta oxidazioaren ondorioz. Burbuilak gehitu gabe ere, stock disoluzioko sulfuroa azkar galtzen da H2S lurrunketaren ondorioz11. Ikerketek erakutsi dute 30-60 segundo inguru irauten duen diluzio-prozesuan, H2S-ren % 5-10 inguru galtzen dela lurrunketaren ondorioz6. Disoluziotik H2S-ren lurrunketa saihesteko, ikertzaileek hainbat neurri hartu dituzte, besteak beste, disoluzioa leunki nahastea12, stock disoluzioa plastikozko film batekin estaltzea6 eta disoluzioaren airearekiko esposizioa minimizatzea, H2S-ren lurruntze-tasa aire-likido interfazearen araberakoa baita.13 H2S-ren oxidazio espontaneoa batez ere trantsizio-metalen ioien ondorioz gertatzen da, batez ere burdin ferrikoa, uretan dauden ezpurutasunak direnak.13 H2S-ren oxidazioak polisulfuroak (lotura kobalenteen bidez lotutako sufre atomoak)11 eratzea eragiten du. Oxidazioa saihesteko, H2S duten disoluzioak disolbatzaile desoxigenatuetan prestatzen dira44,45 eta ondoren argon edo nitrogenoarekin purgatzen dira 20-30 minutuz desoxigenazioa bermatzeko.11,12,37,44,45,46 Azido dietilenetriaminpentaazetikoa (DTPA) metal kelatzaile bat da (10-4 M) eta HS-ren autooxidazioa eragozten du disoluzio aerobikoetan. DTPArik ezean, HS-ren autooxidazio-tasa % 50 ingurukoa da, gutxi gorabehera 3 ordutan 25 °C-tan37,47. Gainera, 1e-sulfuroaren oxidazioa argi ultramoreak katalizatzen duenez, disoluzioa izotzean gorde eta argitik babestu behar da11.
5. irudian erakusten den bezala, NaHS Na+ eta HS-6 bihurtzen da uretan disolbatzen denean; disoziazio hau erreakzioaren pK1-ak zehazten du, tenperaturaren menpekoa dena: pK1 = 3.122 + 1132/T, non T 5 eta 30 °C artekoa den eta Kelvin gradutan (K) neurtzen den, K = °C + 273.1548. HS--k pK2 altua du (pK2 = 19), beraz, pH < 96.49-an, S2- ez da sortzen edo kantitate oso txikietan sortzen da. Aldiz, HS--k base gisa jokatzen du eta H+ onartzen du H2O molekula batetik, eta H2O-k azido gisa jokatzen du eta H2S eta OH- bihurtzen da.
NaHS disoluzioan disolbatutako H2S gasaren eraketa (30 µM). aq, ur-disoluzioa; g, gasa; l, likidoa. Kalkulu guztiek uraren pHa = 7.0 eta uraren tenperatura = 20 °C direla suposatzen dute. BioRender.com-ekin sortua.
NaHS disoluzioak ezegonkorrak direla frogatzen duten ebidentziak dauden arren, hainbat animalia-ikerketek NaHS disoluzioak erabili dituzte edateko uretan H2S emaile konposatu gisa15,16,17,18,19,20,21,22,23,24,25,26, 1 eta 21 aste bitarteko esku-hartze iraupenekin (2. taula). Ikerketa hauetan zehar, NaHS disoluzioa 12 orduro, 15, 17, 18, 24, 25 orduro edo 24 orduro, 19, 20, 21, 22, 23 orduro berritu zen. Gure emaitzek erakutsi zuten arratoiak sendagaien kontzentrazio ezegonkorren eraginpean egon zirela NaHS disoluziotik H2S galtzeagatik, eta arratoien edateko uretan zegoen NaHS edukia nabarmen aldatu zela 12 edo 24 ordutan zehar (ikus 2. irudia). Bi ikerketa horietako jakinarazi zuten uretan H2S mailak egonkor mantendu zirela 24 orduz22 edo % 2-3ko H2S galerak baino ez zirela ikusi 12 orduz15, baina ez zuten daturik edo neurketa-xehetasunik eman. Bi ikerketek erakutsi dute ur botilen diametro txikiak H2S lurrunketa minimizatu dezakeela15,19. Hala ere, gure emaitzek erakutsi zuten horrek ur botila batetik H2S galera 2 orduz bakarrik atzeratu dezakeela, 12-24 ordu beharrean. Bi ikerketek adierazten dute edateko uretan NaHS maila ez zela aldatu suposatzen dugula, uretan kolore-aldaketarik ez genuelako ikusi; beraz, aireak H2S oxidatzea ez zen esanguratsua izan19,20. Harrigarria bada ere, metodo subjektibo honek uretan NaHS-ren egonkortasuna ebaluatzen du, denboran zehar bere kontzentrazioaren aldaketa neurtu beharrean.
NaHS disoluzioan H2S galtzea pH-arekin eta tenperaturarekin erlazionatuta dago. Gure ikerketan adierazi bezala, NaHS uretan disolbatzeak disoluzio alkalino bat sortzen du50. NaHS uretan disolbatzen denean, disolbatutako H2S gasaren eraketa pH balioaren araberakoa da6. Disoluzioaren pH-a zenbat eta txikiagoa izan, orduan eta handiagoa da H2S gas molekula gisa dagoen NaHS proportzioa eta orduan eta sulfuro gehiago galtzen da ur-disoluziotik11. Ikerketa horietako batek ere ez du jakinarazi NaHSrako disolbatzaile gisa erabiltzen den edateko uraren pH-a. OMEren gomendioen arabera, herrialde gehienek onartzen dituztenak, edateko uraren pH-a 6,5-8,55 tartean egon behar da1. pH tarte honetan, H2S-ren oxidazio espontaneoaren tasa hamar aldiz handitzen da gutxi gorabehera13. NaHS uretan pH tarte honetan disolbatzeak 1 eta 22,5 μM arteko H2S gas kontzentrazio disolbatua sortuko du, eta horrek azpimarratzen du uraren pH-a kontrolatzearen garrantzia NaHS disolbatu aurretik. Gainera, goiko ikerketan aipatutako tenperatura-tarteak (18–26 °C) disoluzioan disolbatutako H2S gasaren kontzentrazioan % 10 inguruko aldaketa eragingo luke, tenperatura-aldaketek pK1 aldatzen baitute, eta pK1-en aldaketa txikiek eragin handia izan dezaketelako disolbatutako H2S gasaren kontzentrazioan48. Horrez gain, ikerketa batzuen iraupen luzeak (5 hilabete)22, zeinetan tenperatura-aldakortasun handia espero den, arazo hau areagotzen du.
Bat izan ezik, ikerketa guztiek21 30 μM-ko NaHS disoluzioa erabili zuten edateko uretan. Erabilitako dosia azaltzeko (hau da, 30 μM), egile batzuek adierazi zuten fase urtsuan NaHS-k H2S gasaren kontzentrazio bera sortzen duela eta H2S-ren tarte fisiologikoa 10 eta 100 μM artekoa dela, beraz, dosi hau tarte fisiologikoaren barruan dagoela15,16. Beste batzuek azaldu zuten 30 μM-ko NaHS-k plasmako H2S maila tarte fisiologikoaren barruan mantendu dezakeela, hau da, 5-300 μM19,20. Uretan NaHS-ren kontzentrazioa 30 μM-koa dela hartzen dugu kontuan (pH = 7.0, T = 20 °C), eta hori erabili zen H2S-ren efektuak aztertzeko ikerketa batzuetan. Kalkula dezakegu disolbatutako H2S gasaren kontzentrazioa 14.7 μM dela, hau da, hasierako NaHS kontzentrazioaren % 50 inguru. Balio hau antzekoa da beste egile batzuek baldintza berdinetan kalkulatutako balioarekin13,48.
Gure ikerketan, NaHS administrazioak ez zuen gorputzaren pisua aldatu; emaitza hau bat dator sagu arretan22,23 eta arratoi arretan18 egindako beste ikerketa batzuen emaitzekin; Hala ere, bi ikerketak jakinarazi zuten NaSH-k gorputzaren pisuaren jaitsiera berreskuratu zuela nefrektomizatutako arratoietan24,26, beste ikerketa batzuek ez zuten jakinarazi NaSH administrazioak gorputzaren pisuan zuen eragina15,16,17,19,20,21,25. Gainera, gure ikerketan, NaSH administrazioak ez zuen eraginik izan serumeko urea eta kreatina kromo mailetan, eta hori bat dator beste txosten baten emaitzekin25.
Ikerketak aurkitu zuen NaHS edateko uretan 2 astez gehitzeak ez zuela eraginik arratoi ar eta emeen serumeko sulfuro-kontzentrazio osoan. Aurkikuntza hau Sen et al.-en emaitzekin bat dator (16): edateko uretan 30 μM NaHS-rekin 8 astez egindako tratamenduak ez zuen eraginik izan kontrol-arratoien plasmako sulfuro-mailetan; hala ere, jakinarazi zuten esku-hartze honek nefrektomizatutako saguen plasmako H2S maila murriztuak berreskuratu zituela. Li et al.-ek (22) ere jakinarazi zuten edateko uretan 30 μM NaHS-rekin 5 hilabetez egindako tratamenduak plasmako sulfuro askearen mailak % 26 inguru handitu zituela adineko saguetan. Beste ikerketa batzuek ez dute jakinarazi zirkulazioan dagoen sulfuroan izandako aldaketarik NaHS edateko uretan gehitu ondoren.
Zazpi ikerketek Sigma NaHS15,16,19,20,21,22,23 erabili zutela jakinarazi zuten, baina ez zuten hidratazio-urari buruzko xehetasun gehiago eman, eta bost ikerketek ez zuten aipatu prestaketa-metodoetan erabilitako NaHS-ren iturria17,18,24,25,26. NaHS molekula hidratatua da eta bere hidratazio-uraren edukia alda daiteke, eta horrek molaritate jakin bateko disoluzio bat prestatzeko behar den NaHS kantitatean eragiten du. Adibidez, gure ikerketan NaHS edukia NaHS•1.3 H2O izan zen. Beraz, ikerketa hauetan benetako NaHS kontzentrazioak jakinarazitakoak baino txikiagoak izan daitezke.
«Nola izan dezake hain iraupen laburreko konposatu batek hain eragin luzea?» Pozgay et al.21-ek galdera hau egin zuten NaHS-k saguen kolitisean dituen efektuak ebaluatzean. Espero dute etorkizuneko ikerketek galdera honi erantzun ahal izatea eta espekulatzea NaHS soluzioek polisulfuro egonkorragoak izan ditzaketela NaHS21-en efektua bitartekatzen duten H2S eta disulfuroez gain. Beste aukera bat da soluzioan geratzen den NaHS kontzentrazio oso baxuek ere eragin onuragarria izan dezaketela. Izan ere, Olson et al.-ek frogatu zuten odoleko H2S-ren maila mikromolarrak ez direla fisiologikoak eta nanomolar tartean egon behar direla edo guztiz ez daudela13. H2S-k proteinen sulfatazioaren bidez jardun dezake, hau da, proteina askoren funtzioan, egonkortasunean eta lokalizazioan eragina duen itzulpen osteko aldaketa itzulgarri bat52,53,54. Izan ere, baldintza fisiologikoetan, gibeleko proteina askoren % 10etik % 25era bitartean sulfilatuta daude53. Bi ikerketek NaHS19,23-ren suntsiketa azkarra onartzen dute, baina harrigarriki adierazten dute "egunero ordezkatuz kontrolatu genuela edateko uretan NaHS-ren kontzentrazioa".23 Ikerketa batek ustekabean adierazi zuen "NaHS H2S emaile estandarra dela eta praktika klinikoan erabili ohi dela H2S bera ordezkatzeko".18
Goiko eztabaidak erakusten du NaHS disoluziotik galtzen dela lurrunketaren, oxidazioaren eta fotolisiaren bidez, eta, beraz, iradokizun batzuk egiten dira disoluziotik H2S galera murrizteko. Lehenik eta behin, H2S-ren lurrunketa gas-likido interfazearen13 eta disoluzioaren pH-aren araberakoa da11; beraz, lurruntze-galera minimizatzeko, ur botilaren lepoa ahalik eta txikiena egin daiteke aurretik deskribatu bezala15,19, eta uraren pH-a goiko muga onargarri batera egokitu daiteke (hau da, 6,5–8,551) lurruntze-galera minimizatzeko11. Bigarrenik, H2S-ren oxidazio espontaneoa oxigenoaren efektuengatik eta edateko uretan trantsizio-metalen ioien presentziagatik gertatzen da13, beraz, edateko ura argon edo nitrogenoarekin desoxigenatzea44,45 eta metal kelatzaileen erabilera37,47 sulfuroen oxidazioa murriztu dezakete. Hirugarrenik, H2S-ren fotodeskonposizioa saihesteko, ur botilak aluminiozko paperarekin bildu daitezke; Praktika hau estreptozotozina bezalako material fotosentikorretan ere aplikatzen da55. Azkenik, sulfuro gatz ez-organikoak (NaHS, Na2S eta CaS) gabaje bidez eman daitezke, edateko uretan disolbatu beharrean, lehenago jakinarazi bezala56,57,58; ikerketek erakutsi dute arratoiei gabaje bidez emandako sodio sulfuro erradioaktiboa ondo xurgatzen dela eta ia ehun guztietara banatzen dela59. Orain arte, ikerketa gehienek sulfuro gatz ez-organikoak intraperitonealki eman dituzte; hala ere, bide hau gutxitan erabiltzen da ingurune klinikoetan60. Bestalde, ahozko bidea da gizakietan administrazio bide ohikoena eta hobetsiena61. Beraz, H2S emaileen efektuak karraskarietan ahozko gabaje bidez ebaluatzea gomendatzen dugu.
Muga bat da sulfuroa ur-disoluzioetan eta serumean MB metodoa erabiliz neurtu dugula. Sulfuroa neurtzeko metodoen artean daude iodoaren titrazioa, espektrofotometria, metodo elektrokimikoa (potentziometria, amperometria, metodo kulumetrikoa eta metodo amperometrikoa) eta kromatografia (gas-kromatografia eta errendimendu handiko likido-kromatografia), eta horien artean, metodo erabiliena MB espektrofotometria-metodoa da62. Lagin biologikoetan H2S neurtzeko MB metodoaren muga bat da sufrea duten konposatu guztiak neurtzen dituela eta ez H2S63 librea, baldintza azidoetan egiten baita, eta horrek sufrea iturri biologikotik erauzten duelako64. Hala ere, Amerikako Osasun Publikoaren Elkartearen arabera, MB da uretan sulfuroa neurtzeko metodo estandarra65. Beraz, muga honek ez du eragiten NaHS duten disoluzioen ezegonkortasunari buruzko gure emaitza nagusietan. Gainera, gure ikerketan, NaHS duten ur eta serum laginetan sulfuroen neurketen berreskurapena % 91 eta % 93 izan zen, hurrenez hurren. Balio hauek aurretik jakinarazitako tarteekin bat datoz (77–92)66, eta horrek zehaztasun analitiko onargarria adierazten du42. Azpimarratzekoa da arratoi arrak eta emeak erabili ditugula Osasun Institutu Nazionalen (NIH) jarraibideen arabera, aurrekliniko ikerketan animalia arrarekin bakarrik egindako ikerketetan gehiegi fidatzea saihesteko67 eta ahal den guztietan arratoi arrak eta emeak sartzeko68. Puntu hau beste batzuek azpimarratu dute69,70,71.
Ondorioz, ikerketa honen emaitzek adierazten dute edateko urarekin prestatutako NaHS disoluzioak ezin direla erabili H2S sortzeko, haien ezegonkortasunagatik. Administrazio bide honek animaliak NaHS maila ezegonkor eta espero baino baxuagoetara eramango lituzke; beraz, aurkikuntzak agian ez dira gizakientzat aplikagarriak izango.
Uneko ikerketan erabilitako eta/edo aztertutako datu-multzoak egilearengandik eskuragarri daude arrazoizko eskaera eginez gero.
Szabo, K. Hidrogeno sulfuroaren (H2S) ikerketaren kronologia: ingurumen-toxinatik bitartekari biologikora. Biokimika eta Farmakologia 149, 5–19. https://doi.org/10.1016/j.bcp.2017.09.010 (2018).
Abe, K. eta Kimura, H. Hidrogeno sulfuroaren balizko eginkizuna neuromodulatzaile endogeno gisa. Journal of Neuroscience, 16, 1066–1071. https://doi.org/10.1523/JNEUROSCI.16-03-01066.1996 (1996).
Chirino, G., Szabo, C. eta Papapetropoulos, A. Hidrogeno sulfuroaren eginkizun fisiologikoa ugaztunen zeluletan, ehunetan eta organoetan. Reviews in Physiology and Molecular Biology 103, 31–276. https://doi.org/10.1152/physrev.00028.2021 (2023).
Dillon, KM, Carrazzone, RJ, Matson, JB, eta Kashfi, K. Oxido nitriko eta hidrogeno sulfuroaren zelula-banaketa sistemen promesa eboluzionatzen ari da: medikuntza pertsonalizatuaren aro berri bat. Biochemistry and Pharmacology 176, 113931. https://doi.org/10.1016/j.bcp.2020.113931 (2020).
Sun, X., et al. Askatze moteleko hidrogeno sulfuro emaile baten epe luzeko administrazioak miokardioko iskemia/berperfusio lesioa prebenitu dezake. Txosten zientifikoak 7, 3541. https://doi.org/10.1038/s41598-017-03941-0 (2017).
Sitdikova, GF, Fuchs, R., Kainz, W., Weiger, TM eta Hermann, A. BK kanalaren fosforilazioak hidrogeno sulfuroarekiko (H2S) sentikortasuna erregulatzen du. Frontiers in Physiology 5, 431. https://doi.org/10.3389/fphys.2014.00431 (2014).
Sitdikova, GF, Weiger, TM eta Hermann, A. Hidrogeno sulfuroak kaltzioak aktibatutako potasio (BK) kanalaren jarduera hobetzen du arratoien hipofisi tumore-zeluletan. Archit. Pfluegers. 459, 389–397. https://doi.org/10.1007/s00424-009-0737-0 (2010).
Jeddy, S., et al. Hidrogeno sulfuroak nitritoaren efektu babeslea hobetzen du miokardioko iskemia-berperfusio lesioaren aurka 2 motako diabetesa duten arratoietan. Oxido nitrikoa 124, 15–23. https://doi.org/10.1016/j.niox.2022.04.004 (2022).
Corvino, A., et al. H2S emaileen kimikaren joerak eta gaixotasun kardiobaskularrengan duen eragina. Antioxidatzaileak 10, 429. https://doi.org/10.3390/antiox10030429 (2021).
DeLeon, ER, Stoy, GF, eta Olson, KR (2012). Hidrogeno sulfuroaren galera pasiboak esperimentu biologikoetan. Analytical Biochemistry 421, 203–207. https://doi.org/10.1016/j.ab.2011.10.016 (2012).
Nagy, P., et al. Hidrogeno sulfuroaren neurketen alderdi kimikoak lagin fisiologikoetan. Biochimica et Biophysical Acta 1840, 876–891. https://doi.org/10.1016/j.bbagen.2013.05.037 (2014).
Kline, LL.D. Hidrogeno sulfuroaren espektrofotometria bidezko determinazioa ur naturaletan. Limnol. Oceanogr. 14, 454–458. https://doi.org/10.4319/lo.1969.14.3.0454 (1969).
Olson, KR (2012). Hidrogeno sulfuroaren kimika eta biologian prestakuntza praktikoa. “Antioxidatzaileak”. Redox Seinalizazio. 17, 32–44. https://doi.org/10.1089/ars.2011.4401 (2012).