Jariatze-bideko proteinen sailkapena ezinbestekoa da zelulen konpartimentazioa eta homeostasia mantentzeko. Oskolaren bidezko sailkapenaz gain, lipidoen eginkizuna kinesinen sailkapenean jariatze-garraioaren prozesuan aspaldiko oinarrizko galdera bat da, oraindik erantzunik ez duena. Hemen, 3Dko aldibereko bereizmen handiko denbora errealeko irudiak egiten ditugu, in vivo frogatzeko zeramida lipido-zati oso luzeak dituzten glikosilfosfatidilinositol-imobilizatutako proteina berriak multzokatuta eta endoplasma-irteera garbi espezializatuetan sailkatzen direla, mintz-proteinek erabiltzen dutenetik desberdina dena. Horrez gain, erakusten dugu erretikulu endoplasmatikoaren mintzean zeramidaren kate-luzera funtsezkoa dela sailkapen-hautakortasun horretarako. Gure ikerketak in vivo lehen ebidentzia zuzena eskaintzen du proteina-kargak lipido-katearen luzeraren arabera jariatze-bideko esportazio-gune selektiboetan sailkatzeko.
Zelula eukariotoetan, erretikulu endoplasmatikoan (ER) sintetizatutako proteinak jariatze-bidetik sailkatzen dira garraioan zehar, dagokien zelula-helmugara eramateko (1). Estaldura bidezko sailkapenaz gain, aspalditik espekulatu zen lipido batzuek irteera-puntu selektibo gisa ere balio dezaketela, proteina espezifiko horien mintz-domeinu espezifikoetan multzokatuz (2-5). Hala ere, oraindik ez dago in vivo ebidentzia zuzenik lipidoetan oinarritutako mekanismo posible hau frogatzeko. Oinarrizko arazo hau konpontzeko, legamian aztertu genuen nola esportatzen diren glikosilfosfatidilinositolaren (GPI) ainguratutako proteinak (GPI-APak) modu desberdinean ERtik. GPI-APak lipidoekin lotutako zelula-gainazaleko proteina ugari dira (6, 7). GPI-AP proteina jariatua da, plasma-mintzaren kanpoko orriei lotuta glikolipido-zatiaren (GPI aingura) bidez. GPI aingurak onartzen dituzte ER lumenean itzulpen osteko aldaketa kontserbadore gisa (8). Lotu ondoren, GPI-AP Golgi aparatua zeharkatzen du (5, 9) ER-tik mintz plasmatikora. GPI ainguren presentziak GPI-AP mintz transmembranarioko jariatutako proteinetatik (beste mintz plasmatikoko proteinak barne) bereizita garraiatzea eragiten du jariatze bidean zehar (5, 9, 10). Legamia-zeluletan, GPI-APak erretikulu endoplasmatikoan jariatutako beste proteinetatik bereizten dira, eta ondoren II. estaldura-proteina konplexuak (COPII) bildutako besikula berezietan paketatzen dira (6, 7). ER esportazio prozesuan sailkapen-prozesu honen determinatzaileak ez daude argi, baina espekulatzen da mekanismo honek lipidoak behar dituela, batez ere GPI ainguraren lipido-zatiaren egitura-berritzea (5, 8). Legamian, GPI lipidoen birmoldaketa GPI lotu ondoren hasten da, eta kasu askotan, zeramida 26 karbonoko kate luzeko gantz-azido saturatuari (C26:0) lotzea eragiten du (11, 12). C26 zeramida legamia-zelulek orain arte ekoitzi duten zeramida nagusia da. ER-n sintetizatzen da eta gehiena Golgi aparatura esportatzen da COPII besikulen bidez (13). GPI-AP-ren ER esportazioak zeramida-sintesi jarraitua eskatzen du zehazki (14, 15), eta, aldi berean, zeramida inositol fosfato zeramida (IPC) bihurtzea Golgi aparatuan GPI ainguraren sintesiaren mende dago (16). Mintz artifizialekin egindako ikerketa biofisikoek erakutsi dute azil-kate oso luzeko zeramidak bat egin dezaketela propietate fisiko bereziak dituzten domeinu ordenatuak osatzeko (17, 18). Datu hauek hipotesi honetara eramaten dute: C26 zeramidak eta GPI-AP-k C26 zeramidarekin beren propietate fisikoak erabiltzen dituzte eskualde ordenatuetan edo ER mintzeko lipido-ingurune nahiko nahasian eskualde ordenatuetan bat egiteko. Batez ere glizerolipido labur eta asegabez osatuta dago (C16:1 eta C18:1) (19, 20). Eskualde hauek selektiboki ER irteera gune (ERES) espezifikoetan zentratuko dira, non zeramida eta zeramidan oinarritutako GPI-AP Golgi aparatura batera garraiatu daitezkeen COPII besikula dedikatu berean (5).
Ikerketa honetan, lipidoetan oinarritutako mekanismo hau zuzenean probatu dugu super-bereizmeneko denbora errealeko irudi-mikroskopia konfokala (SCLIM) erabiliz, hau da, mikroskopia-teknika aurreratu bat, aldi berean fluoreszenteki markatutako proteinak behatzeko gai dena. Hiru koloreko eta hiru dimentsioko (3D) irudiek bereizmen eta abiadura oso handia dute zelula bizidunetan (21, 22).
Lehenik SCLIM teknologia aplikatu genuen hobeto definitzeko nola bahetzen zen C26 zeramida taldea duen GPI-AP normala S. cerevisiae-n ER utzi ondoren mintz-transakzioko proteinetatik. ERren sailkapena egiaztatzeko, sistema genetiko bat erabili genuen, ERESera sartzen den karga berria in vivo zuzenean bistaratu dezakeena (7, 23). Karga gisa, C26 zeramida-oinarritutako GPI-AP Gas1 aukeratu genuen, proteina fluoreszente berdearekin (GFP) markatua, eta Mid2 proteina fluoreszente infragorri hurbilarekin (iRFP) markatua, biak mintz-transakzioko proteina jariatua, biak mintz plasmatikoa helburu dutenak (24-26). Sec31-1 tenperaturarekiko sentikorra den mutantean, bi karga hauek galaktosak eragindako sustatzaile baten eta ERES markatzaile eratzaile baten pean adierazten dira. Muturreko tenperaturan (37 °C), sec31-1 mutazioak COPII estalduraren Sec31 osagaiaren funtzioan eragiten duenez, COPII ernetzea eta ER esportazioa inhibitzeko, karga berria ER-n pilatzen da (23). Tenperatura baxu batera hoztu ondoren (24 °C), sec31-1 zelula mutanteak jariatze-eremutik suspertu ziren, eta metatutako karga sintetiko berria ERtik esportatzen hasi zen. CLIM bistaratzeak erakutsi zuen sintetizatutako Gas1-GFP eta Mid2-iRFP berri gehienak sec31-1 zelula mutanteen ERan pilatzen zirela oraindik 37 °C-tan inkubatu eta 24 °C-tan 5 minutuz askatu ondoren (1. irudia). Mid2-iRFP ER mintz osoan banatuta dagoenez, eta Gas1-GFP ER mintz-eremu eten batean kontzentratu eta bilduta dagoenez, haien banaketa guztiz desberdina da (1. irudia, A-tik C-ra eta S1 filma). Gainera, 1D irudian erakusten den bezala, Gas1-GFP multzoak ez du Mid2-iRFPrik. Emaitza hauek adierazten dute GPI-AP eta mintz-transmembranoko proteinak ER mintzeko eskualde desberdinetan goiz bereizi zirela. Gas1-GFP multzoa mCherryren COPII estaldura-proteina Sec13-rekin markatutako ERES espezifiko baten ondoan dago (1. irudia, E eta F, eta S1 filma) (23).
sec31-1 zelulek galaktosak eragindako jariaketak, azil kate luzeko (C26) zeramida GPI-AP Gas1-GFP (GPI-AP, berdea) eta mintz-transmembranoko proteina Mid2-iRFP (TMP, urdina) adierazten dituzte, eta ERES etiketatze eraikitzaile hau Sec13-mCherry (ERES, magenta) 37 °C-tan inkubatu zen 30 minutuz, 24 °C-ra eraman zen eta 5 minutu geroago SCLIM bidez irudikatu zen. (A-tik C-ra) plano baten 2D irudi bateratu edo bakarra erakusten du (A), 10 z-sekzioren 2D proiekzio irudi bat (B) edo kargaren eta ERES markatzaileen 3D zelula hemisferioaren irudi bat (C). Eskala barra 1 μm (A eta B). Eskala unitatea 0,551 μm da (C). Gas1-GFP ER eskualde edo multzo diskretuetan detektatu zen, eta Mid2-iRFP, berriz, ER mintzean zehar detektatu eta banatu zen (C). (D) Grafikoak Gas1-GFP eta Mid2-iRFP-ren fluoreszentzia intentsitate erlatiboa erakusten du Gas1-GFP klusterrean, gezi zuriaren lerroan (ezkerrean). AU, unitate arbitrarioa. (E eta F) goods eta ERES marka konbinatzen dituen 3D irudia adierazten dute. Gas1-GFP klusterrak ERES espezifikoaren ondoan detektatu ziren. Eskala unitatea 0,551 μm da. (F) Gezi zuri solidoak ERESekin lotutako Gas1-GFP klusterra markatzen du. Erdiko eta eskuineko panelek 3D irudi handitu bateratua eta hautatutako Gas1-GFP klusterraren ikuspegi biratua erakusten dituzte.
Gas1-GFP klusterraren eta ERES espezifiko baten arteko espazio-harreman estua adierazten du Gas1-GFP-ak ERES selektiboan sar daitekeela, eta hori Mid2-iRFP-ak ER uzteko erabiltzen duen selektibitatetik desberdina da. Aukera horri aurre egiteko, ERES ratioa kuantifikatu dugu salgai bat edo birentzat bakarrik (2. irudia, A-tik C-ra). Ikusi dugu ERES gehienek (% 70) karga mota bakarra dutela. 2C irudiaren beheko irudiak ERESen bi adibide tipiko erakusten ditu, Gas1-GFP bakarrik (1. irudia) edo Mid2-iRFP bakarrik (2. irudia). Aitzitik, ERESen % 20 inguruk eremu berean gainjartzen diren bi karga dituzte. Ikusi da ERES batzuek (% 10) bi karga mota zituztela, baina eremu argi eta garbi desberdinetan isolatuta zeudela. Beraz, analisi estatistiko honek erakusten du ER esportatu ondoren, GPI-AP Gas1-GFP eta Mid2-iRFP mintz-zabaleko karga ERES desberdinetan banatzen direla (2D irudia). Sailkapen-eraginkortasun hau oso koherentea da aurreko analisi biokimikoarekin (6) eta determinazio morfologikoarekin (7). Berrogeialdian dagoen kargamentuaren portaera ere ikus dezakegu ERESera sartzen (2E irudia eta S2 filma). 2E irudiak erakusten du Gas1-GFPren (3. panela) edo Mid2-iRFPren (4. panela) zati txiki bat bakarrik sartzen dela ERESera alde batetik eta eremu diskretu batean mugatzen dela. 2E irudiko 5. panelak erakusten du Gas1-GFP eta Mid2-iRFP batzuetan ERES berean aurkitzen direla, baina alde desberdinetatik sartzen direla eta COPII besikula desberdinak ordezka ditzaketen eskualde bereizietan kontzentratzen direla. Halaber, baieztatu dugu C26 zeramida-oinarritutako GPI-AP Gas1en bereizketa eta sailkapen behatua ERES selektibo gisa espezifikoa dela, beste mintz-jariatze kargamentu bat, GFP etiketadun Axl2 mintz plasmatiko proteina (27), Mid2-iRFPren antzeko portaera erakusten duelako. (S1 irudia eta S3 filma). Axl2-GFP sintetizatu berria ER mintzean zehar banatzen da Mid2-iRFP bezala (S1 irudia, A eta B), eta Mid2-iRFP-rekin batera lokalizatuta dago ERES gehienetan (S1 irudia, B-tik D-ra). 1. S1C irudiko 1. eta 2. panelek ERESen bi adibide tipiko erakusten dituzte, non bi karga transmembranario gainjartzen diren. Kasu hauetan, bi ondasunak batera sartzen dira ERESera (S1E irudia, 3. panela eta S3 filma).
Galaktosaren bidezko jariapen induzigarriak adierazten dituzten sec31-1 zelulak, Gas1-GFP (GPI-AP, berdea) eta Mid2-iRFP (TMP, urdina) eta Sec13-mCherry (ERES, magenta) ERES markaketa konstitutiboa 37 °C-tan jarri ziren. 30 minutuz °C-tan inkubatu ondoren, 24 °C-ra mugitu jariapen-blokeoa askatzeko, eta irudia SCLIM-ekin egin 20 minutu igaro ondoren. (A-tik C-ra) Kargaren 2D proiekzio-irudi adierazgarriak (A; eskala-barra, 1 μm) edo 3D zelula-hemisferioen irudiak (B eta C; eskala-unitatea, 0,456 μm) eta ERES-ekin markatutako 10 z-sekzio. (B)-ko beheko panelak eta (C)-ko panelak prozesatutako irudiak erakusten dituzte ERES-en (magenta) dauden ondasunak soilik erakusteko [Gas1-GFP (grisa) eta Mid2-iRFP (urdin argia)]. (C) Gezi irekia: ERES-ek karga-zati bakarra darama (1etik 4ra). Gezi grisa: ERESek karga bereizia dauka (5). Gezi zuri solidoa: Kokapen berean dagoen karga dauka ERES. Behean: Hautatutako ERES bakarrak Gas1-GFP (1) edo Mid2-iRFP (2) baino ez dauka. Eskala-barra, 100 nm. (D) (C)-n deskribatutako fotomikrografiaren kuantifikazioa. Karga bakarra (Gas1-GFP edo Mid2-iRFP), karga bereizia eta gainjarritako karga dituen ERESen batez besteko ehunekoa. Hiru esperimentu independentetan, n=432 54 zelulatan. Errore-barra = SD. Bi isatseko t testa parekatu gabea. *** P = 0,0002. (E) (C)-rekin markatutako berrogeialdian dagoen kargaren hautatutako ERESen 3D irudia. Gas1-GFP (berdea) (3) edo Mid2-iRFP (urdina) (4) alde batetik sartzen da ERESera (magenta) eta ERES barruko eremu txiki batera mugatzen da. Batzuetan, bi karga motak ERES berera (5) sartzen dira alde beretik eta ERES barruko eremu isolatu batera mugatzen dira. Eskala-barra, 100 nm.
Ondoren, ER mintzean dagoen azil-kate luzeko zeramida (C26) Gas1-en multzokatzea eta sailkapen espezifikoa ERES selektibo bihurtzen duen hipotesi bat probatu genuen. Horretarako, GhLag1 legamia-andui aldatu bat erabili genuen, non bi zeramida sintasa endogenoak, Lag1 eta Lac1, GhLag1-ek ordezkatu zituen (kotoiaren Lag1 homologoa), eta ondorioz, zelula-mintzean mota basatia baino laburragoa den zeramida-anduia duen legamia-andui bat sortu zen (3A irudia) (28). Espektrometria masiboaren (MS) analisiak erakutsi zuen mota basatiko anduietan zeramida osoaren % 95a oso kate luzeko (C26) zeramida dela, eta GhLag1-en, berriz, zeramidaren % 85a oso luzekoa dela (C18 eta C16). ), zeramidaren % 2a bakarrik da oso kate luzeko (C26) zeramida. C18 eta C16 zeramidak diren arren orain arte GhLag1 mintzean detektatu diren zeramida nagusiak, MS analisiak ere baieztatu zuen GhLag1 anduian adierazitako Gas1-GFP-ren GPI aingurak C26 zeramida duela, lipido basatiekin alderagarria dena. Kalitatea berdina da (3A irudia) (26). Beraz, horrek esan nahi du Cwh43 zeramida birmoldatzeko entzima oso selektiboa dela C26 zeramidarekiko, 26. irudian erakusten den bezala, lehentasunez GhLag1 anduiko C26 zeramida kantitate txiki batetik datorren GPI aingura barneratzen duela. S2 (29). Hala ere, GhLag1-en zelula mintzak funtsean C18-C16 zeramida baino ez du, Gas1-GFP-k oraindik C26 zeramida duen bitartean. Gertakari honek andui hau tresna aproposa bihurtzen du ER-ko mintzeko zeramidaren azil katearen luzeraren arazoa konpontzeko. Klasearen eta sailkapenaren hipotesi-rola. Ondoren, lehenik C26 Gas1-GFP-ak sec31-1-ren tenperaturarekiko sentikorra den alelo mutante batekin GhLag1-en multzoetan metatzeko duen gaitasuna aztertu genuen fluoreszentzia mikroskopia konbentzionalaren bidez, non kate luzea (C18-C16) bakarrik dagoen ER mintzean Zeramida (3. irudia). Ikusi genuen sec31-1-en Gas1-GFP gehiena multzoetan kontzentratzen zela, eta Gas1-GFP sec31-1 GhLag1-en, zeramida luzea (C18-C16) duen ER mintzean, ez zegoela multzokatuta eta ER mintz osoan banatuta. Zehazki, C26 zeramidan oinarritutako multzokatzea ERES espezifikoekin estuki lotuta dagoenez (1. irudia), ondoren ikertu genuen prozesu honek ER esportazio proteinen mekanismoaren funtzioa ere inplikatu dezakeen. GPI-AP-ak COPII sistema berezi bat erabiltzen du ER esportaziorako, eta hau Ted1-ek GPI ainguraren glikano zatiaren egitura-berrikuntzak aktiboki erregulatzen du (30, 31). GPI-glikano birkonbinatua mintz-transmembranoko karga-hartzailearen p24 konplexuak ezagutzen du, eta honek, aldi berean, Lst1 selektiboki errekrutatzen du, hau da, COPII karga lotura-azunitate nagusiaren Sec24 isoforma espezifiko bat, GPI-AP-an aberatsa den COPII besikulak eratuz. Besikulak beharrezkoak dira (31-33). Hori dela eta, mutante bikoitz bat eraiki genuen, proteina bakar hauen ezabapena (p24 konplexuaren osagaia Emp24, GPI-glikanoa birmoldatzeko entzima Ted1 eta COPII azpiunitate espezifikoa Lst1) sec31-1 mutante-anduiarekin konbinatzen zuena, eta aztertu genituen. Posible al da Gas1-kluster GFP sortzea (3. irudia)? Ikusi genuen sec31-1emp24Δ eta sec31-1ted1Δ-n, Gas1-GFP batez ere multzokatu gabe dagoela eta ER mintzean zehar banatzen dela, lehenago sec31-1 GhLag1-n ikusi zen bezala, eta sec31-1lst1Δ-n, Gas1-GFP sec31-1 bezala. Emaitza hauek adierazten dute ER mintzean C26 zeramidaren presentziaz gain, Gas1-GFPren multzokatzeak p24 konplexuari lotu behar diola ere, eta ez duela Lst1 errekrutatze espezifikorik behar. Ondoren, ER mintzean zeramidaren kate-luzerak Gas1-GFPren p24-ri lotura erregulatzeko aukera aztertu genuen. Hala ere, ikusi genuen mintzean C18-C16 zeramidaren presentziak ez duela eragiten p24 konplexuak berreraikitako GPI-glikanoetan (S3 eta S4, A eta B irudiak) edo GPI-APri loturan eta GPI-AP esportazioan. COPII Lst1 azpimota errekrutatu (S4C irudia). Beraz, C26 zeramidaren menpeko multzokatzeak ez du proteinen interakziorik behar ER esportazio-proteina mekanismo desberdinekin, baina lipidoen luzerak bultzatutako sailkapen-mekanismo alternatibo bat onartzen du. Ondoren, aztertu genuen ER mintzean zeramida azil katearen luzera garrantzitsua den Gas1-GFP ERES selektibo gisa sailkatzeko. GhLag1 anduiko Gas1 zeramida-kate laburrekoak ERtik irten eta mintz plasmatikoan sartzen direnez (S5 irudia), uste dugu sailkapena zeramida-azil katearen luzerak bultzatzen badu, GhLag1 anduiko Gas1 birbideratu eta gurutzatu daitekeela. Mintz berdina duten ERES ondasunak.
(A) GhLag1-en zelula-mintzak batez ere C18-C16 zeramida laburragoak ditu, Gas1-GFP-en GPI aingurak oraindik ere zelula basatiek bezalako C26 IPC bera duen bitartean. Goian: zeramidaren azil-katearen luzeraren analisia mota basatiko (Wt) eta GhLag1p anduien zelula-mintzean, masa-espektrometria bidez (MS). Datuek zeramida osoaren ehunekoa adierazten dute. Hiru esperimentu independenteren batez bestekoa. Errore-barra = SD. Bi isatseko t testa parekatu gabea. **** P <0,0001. Beheko panela: Gas1-GFP (GPI-IPC) GPI ainguran dagoen IPCren azil-katearen luzeraren MS analisia, mota basatiko eta GhLag1p anduietan adierazita. Datuek IPC seinale osoaren ehunekoa adierazten dute. Bost esperimentu independenteren batez bestekoa. Errore-barra = SD. Bi isatseko t testa parekatu gabea. ns, ez da garrantzitsua. P = 0,9134. (B) Galaktosak eragindako Gas1-GFP adierazten duten sec31-1, sec31-1 GhLag1, sec31-1emp24Δ, sec31-1ted1Δ eta sec31-1lst1Δ zelulen fluoreszentzia mikrografiak 37 °C-tan inkubatu ziren 30 minutuz eta 24 °C-tik aurrera fluoreszentzia mikroskopia arrunta egin. Gezi zuria: ER Gas1-GFP multzoa. Gezi irekia: Multzokatu gabeko Gas1-GFP ER mintz osoan banatzen da, ERren ezaugarri den eraztun nuklearraren tindaketa erakutsiz. Eskala barra, 5 μm. (C) (B) puntuan deskribatutako fotomikrografia kuantifikatzea. Gas1-GFP egitura puntuduna duten zelulen batez besteko ehunekoa. Hiru esperimentu independentetan, n≥300 zelula. Errore barra = SD. Bi isatseko t testa parekatu gabea. **** P <0,0001.
Arazo hau zuzenean konpontzeko, Gas1-GFP eta Mid2-iRFP-ren SCLIM bistaratze bidez egin genuen GhLag1-en, sec31-1 tenperaturarekiko sentikorra den alelo mutantearekin (4. irudia eta S4 filma). ER 37 °C-tan mantendu eta ondoren 24 °C-tan askatu ondoren, sintetizatutako Gas1-GFP berriaren gehiengoa ez zen ER mintzean zehar multzokatu eta banatu, mikroskopio konbentzionalek ikusi zuten bezala (4. irudia, A eta B). Gainera, ERESen ehuneko handi batek (% 67) bi karga mota ditu bertan kokatuta (4D irudia). 4C irudiko 1. eta 2. panelek Gas1-GFP eta Mid2-GFP gainjarriekin ERESen bi adibide tipiko erakusten dituzte. Gainera, bi ondasunak ERES berean errekrutatu ziren (4E irudia, 3. panela eta S4 filma). Beraz, gure emaitzek adierazten dute ER mintzeko zeramida azil katearen luzera ER proteinen agregazio eta sailkapenaren determinatzaile garrantzitsua dela.
Galaktosak eragindako jariaketak adierazten dituzten Sec31-1 GhLag1 zelulak, Gas1-GFP (GPI-AP, berdea) eta Mid2-iRFP (TMP, urdina) eta ERES konstitutiboa markatutako Sec13-mCherry (ERES, magenta) Inkubatu 37 °C-tan. Jarraitu 30 minutuz, jaitsi 24 °C-ra jariaketak askatzeko, eta irudia SCLIM-ekin egin 20 minutu igaro ondoren. (A-tik C-ra) Kargak eta ERESek markatutako 10 z-sekzioen 2D proiekzio irudi adierazgarriak (A; eskala barra, 1 μm) edo 3D zelula hemisferio irudiak (B eta C; eskala unitatea, 0,45 μm). (B) beheko panelak eta (C) panelak prozesatutako irudiak erakusten dituzte ERESen (magenta) dauden ondasunak soilik erakusteko [Gas1-GFP (grisa) eta Mid2-iRFP (urdin argia)]. (C) Gezi zuri betea: ERES, ondasunak gainjartzen dira. Gezi irekia: ERESak elementu bakarra dauka. Beheko panela: Hautatutako ERESak gainjarritako ondasunak ditu (1 eta 2) (C) puntuan markatuta. Eskala-barra, 100 nm. (D) (C) puntuan deskribatutako mikrofotografiaren kuantifikazioa. sec31-1 eta sec31-1 GhLag1 unitateetan, karga bakarra (Gas1-GFP edo Mid2-iRFP) sartzen da, eta karga isolatuaren eta gainjarritako kargaren ERESaren batez besteko ehunekoa. Hiru esperimentu independenteetan, n = 432 54 gelaxketan (sec31-1) eta n = 430 47 gelaxketan (sec31-1 GhLag1). Errore-barra = SD. Bi isatseko t testa parekatu gabea. *** P = 0,0002 (sec31-1) eta ** P = 0,0031 (sec31-1 GhLag1). (E) Hautatutako ERESaren 3D irudia, gainjarritako kargarekin (3) (C) puntuan markatuta. Gas1-GFP (berdea) eta Mid2-iRFP (urdina) ERESera (magenta) hurbiltzen dira alde beretik eta ERES eremu mugatu berean geratzen dira. Eskala-barra, 100 nm.
Ikerketa honek in vivo ebidentzia zuzena eskaintzen du lipidoetan oinarritutako proteina-kargak jariatze-bideko esportazio-gune selektiboetan sailkatzen direla, eta azil-katearen luzeraren garrantzia agerian uzten du sailkapen-hautakortasunerako. SCLIM izeneko mikroskopia-teknika indartsu eta aurreratu bat erabiliz, Gas1-GFP sintetizatu berria erakutsi genuen (GPI-AP garrantzitsu bat, azil-kate oso luzeko (C26) zeramida-lipido zatia duena mintz plasmatikoan). ER diskretuetan multzokatutako eskualdeak ERES espezifikoekin lotuta daude, eta mintz-transeko jariatutako proteinak ER mintzean zehar banatzen dira (1. irudia). Gainera, bi ondasun mota hauek ERES desberdinetan sartzen dira selektiboki (2. irudia). Mintzeko zelulen zeramidaren azil-katearen luzera C26tik C18-C16ra murrizten da, Gas1-GFP multzoa ER eskualde diskretura desegiten da, eta Gas1-GFP birbideratzen da ERtik mintz-transeko proteinarekin ERES beraren bidez uzteko (3. irudia eta 3. irudia). 4).
GPI-AP-ak proteina-mekanismo espezializatu bat erabiltzen badu ere ERtik irteteko, ikusi dugu C26 zeramida-menpeko bereizketak ez duela ERES espezializazioa ekar dezaketen proteinen arteko elkarrekintza desberdinetan oinarritzen (S4 eta S5 irudiak). Horren ordez, gure aurkikuntzek lipidoetan oinarritutako proteinen multzokatzeak eta ondorengo beste kargamentuen bazterketak bultzatutako sailkapen-mekanismo alternatibo bat babesten dute. Gure behaketek adierazten dute ERES espezifiko batekin lotutako Gas1-GFP eskualdeak edo multzoak ez duela Mid2-iRFP proteina jariatzaile transmembranarioa, eta horrek adierazten du C26 zeramida-menpeko GPI-AP multzoak ERES egokira sartzea erraztuko duela, eta, aldi berean, jariatze transmembranarioak ERES jakin honetan sartzen direla (1. eta 2. irudiak). Aitzitik, C18-C16 zeramiden presentziak ER mintzean ez du GPI-AP-ak eskualdeak edo multzoak eratzea eragiten, beraz, ez dituzte proteina jariatzaile transmembranarioak ERES berean baztertzen edo ordezkatzen (3. eta 4. irudiak). Beraz, proposatzen dugu C26 zeramidak bereizketa eta sailkapena bultzatzen dituela ERES espezifikoei lotutako proteinen multzokatzea erraztuz.
Nola lortu C26 zeramida-menpeko multzokatzea ER eremu espezifiko batean? Mintzeko zeramidak alboetara bereizteko joerak GPI-AP eta C26 zeramidak lipido txiki eta berehala ordenatuak eratzea eragin dezake ER mintzaren lipido-ingurune irregularragoan, glizerolipido laburragoak eta asegabeak dituena. Kalitatezko multzoak (17, 18). Multzo txiki aldi baterako hauek multzo handiago eta egonkorragoetan fusionatu daitezke p24 konplexuari lotu ondoren (34). Honekin bat etorriz, erakutsi genuen C26 Gas1-GFP-k p24 konplexuarekin elkarreragin behar duela multzo ikusgai handiagoak sortzeko (3. irudia). P24 konplexua legamia-lau p24 proteina transmembranoz osatutako oligomero heterozigotoa da (35), eta horrek lotura multibalentea ematen du, eta horrek GPI-AP multzo txikien lotura gurutzatua sor dezake, eta horrela multzo egonkor handiagoa sortuz (34). GPI-APen proteina ektodominioen arteko elkarrekintzak ere haien agregazioan lagun dezake, ugaztunen zelula epitelial polarizatuen Golgi garraioan erakusten den bezala (36). Hala ere, C18-C16 zeramida ER mintzean dagoenean, p24 konplexua Gas1-GFP-ri lotzen zaionean, ez dira multzo bereizi handirik sortuko. Oinarrizko mekanismoa azil-kate luzeko zeramidaren propietate fisiko eta kimiko espezifikoen araberakoa izan daiteke. Mintz artifizialen ikerketa biofisikoek erakusten dute azil-kate luzeko (C24) zein laburreko (C18-C16) zeramidak faseen bereizketa eragin dezaketen arren, azil-kate luzeko (C24) zeramidak bakarrik sustatu dezaketela kurbadura handia eta filmaren tolestura filma birmoldatzeko. Elkarrekiko erreferentziaren bidez (17, 37, 38). Frogatu da TMED2-ren mintz-helizeak, Emp24-ren homologo humanoak, selektiboki elkarreragiten duela C18 zeramida-oinarritutako esfingomielinarekin zitoplasma-lobuluetan (39). Dinamika molekularreko (MD) simulazioak erabiliz, ikusi dugu C18 eta C26 zeramidak Emp24-ren mintz-helizearen lobulu zitoplasmatikoen inguruan pilatzen direla, eta lehentasun antzekoak dituztela (S6 irudia). Aipatzekoa da honek adierazten duela Emp24-ren mintz-helizeak lipidoen banaketa asimetrikoa ekar dezakeela mintzean. Ugaztunen zeluletan oinarritutako emaitza berria da hau. Antzeko MD simulazioek eter lipidoen presentzia ere erakusten dute (40). Beraz, espekulatzen dugu ER26-ren bi lobuluetako C26 zeramida lokalki aberastuta dagoela. GPI-AP lobulu luminaletan zuzenean p24 multibalenteari lotzen zaionean eta C26 zeramida p24 inguruan metatzen denean zitoplasmako lobuluetan, hatzen bidez proteina agregazioa eta mintzaren kurbadura sor daitezke (41), eta horrek GPI-AP ERESren ondoan dauden eskualde diskretuetan bereiztea eragiten du, eta horrek ER mintzaren eskualde oso kurbatuak ere faboratzen ditu (42). Aurreko txostenek proposatutako mekanismoa babestu zuten (43, 44). Oligolektinen, patogenoen edo antigorputzen zeramida-oinarritutako glikoesfingolipidoen (GSL) lotura multibalenteak plasma-mintzean GSL agregazio handia eragiten du, faseen bereizketa hobetzen du eta mintzaren deformazioa eta barneratzea eragiten ditu (44). Iwabuchi etab. (43) Ikusi zen azil-kate luzeen (C24) baina ez laburren (C16) aurrean, GSL laktosilzeramidari lotutako ligando multibalenteak multzo handien eta mintzaren inbaginazioaren eraketa eragiten zuela, eta zitoplasmaren Lyn-ek bitartekatutako seinale-transdukzioa neutrofilo akoplatuetan azil-kateekin tartekatuta dagoela.
Ugaztunen epitelio-zelula polarizatuetan, anti-Golgi sarearen (TGN) kontzentrazioak plasma-mintz apikalaren mailan GPI-APren bereizketa eta sailkapena kontrolatzen du (10, 45). Agregazio hau GPI-AP oligomerizazioak bultzatzen du (36), baina legamian aurkitzen dugun zeramida-katearen luzeraren araberakoa ere izan daiteke. Ugaztunen GPI-APak eter lipidoetan oinarritutako aingura bat badu ere, eta bere egitura kimikoa oso desberdina den arren azil-kate luzeko zeramidatik, azken ikerketa batek aurkitu du bi lipidoek eboluzionalki antzeko propietate fisiko eta kimikoak eta funtzioa dituztela (40). Beraz, ugaztunen zeluletako eter lipidoen zatia legamiaren C26 zeramidaren antzekoa izan daiteke, eta bere eginkizuna mintzeko kate luzeko zeramidarekin lotzea da GPI-APren agregazioa eta sailkapena sustatzeko. Aukera hau oraindik zuzenean probatu behar den arren, aurreko aurkikuntzek baieztatzen dute azil-kate luzeko zeramida Golgi gorputzera garraiatzea ez dela zitoplasmako transferentzia-proteinen bidez egiten, baizik eta legamiaren antzeko GPI ainguren sintesiaren araberakoa dela. Beraz, badirudi eboluzio-mekanismo kontserbadoreak gai dela azil-kate oso luzeko zeramida eta GPI-AP (13, 16, 20, 46, 47) garraio-besikula berean selektiboki garraiatzeko.
Legamia eta ugaztunen epitelio-zelula polarizatuen sistemetan, GPI-AP agregazioa eta beste mintz plasmatikoko proteinetatik bereiztea zelularen gainazalera iritsi aurretik gertatzen da. Paladino et al. (48) aurkitu zuten ugaztunen epitelio-zelula polarizatuen TGN-an, GPI-AP multzokatzea ez dela beharrezkoa bakarrik GPI-APak mintz plasmatiko apikalean sailkatzeko, baizik eta GPI-APen multzokatze-antolaketa eta haien jarduera biologikoa ere erregulatzen dituela. Zelula-gainazala. Legamian, ikerketa honek erakutsi zuen ER-ko C26 zeramida-menpeko GPI-AP multzoak GPI-AParen multzokatze-antolaketa eta jarduera funtzionala erregulatu dezakeela mintz plasmatikoan (24, 49). Eredu honekin bat etorriz, GhLag1 zelulak alergikoak dira GPI inhibitzaileekiko edo zelula-hormaren osotasunari eragiten dioten sendagaiekiko (28), eta legamia-zelulen parekatzean proiektatutako puntako zeramidaren Gas1-GFP multzo funtzionalen beharrak (49) adierazten du hLag1 zelulen ondorio fisiologiko posibleak. GPI-AP errorea. Hala ere, etorkizuneko ikerketaren gaia izango da ea zelula-gainazalaren antolaketa funtzionala ER-tik programatu den lipidoen luzeran oinarritutako sailkapen-metodo baten bidez.
Lan honetan erabilitako Saccharomyces cerevisiae anduiak S1 taulan zerrendatzen dira. Zelula bizien irudikapenerako SCLIM-en MMY1583 eta MMY1635 anduiak W303-ren atzeko planoan eraiki ziren. Sec13-mCherry proteina fluoreszente batekin adierazten duten andui hauek polimerasa-kate-erreakzioan (PCR) oinarritutako metodo bat erabiliz eraiki ziren, pFA6a plasmidoa txantiloi gisa hartuta (23). GAL1 sustatzailearen kontrolpean proteina fluoreszentearekin markatutako Mid2-iRFP adierazten duen anduia honela eraiki zen. iRFP-KanMx sekuentziaren PCR anplifikazioa pKTiRFP-KAN bektoretik (E. O'Shearen oparia, Addgene plasmido zenbakia 64687; http://n2t.net/addgene: 64687; ikerketa-baliabideen identifikatzailea (RRID): Addgene_64687) eta Mid2 endogenoaren C-muturrean txertatu zen. Mid2-iRFP genomaren sekuentzia anplifikatu eta GAL1 sustatzailean klonatu ondoren, pRS306 integrazio plasmidoaren Not I-Sac I gunean integratu zen. Sortutako pRGS7 plasmidoa Pst I-rekin linealizatu zen URA3 lokusean integratzeko.
Gas1-GFP fusio-genea GAL1 sustatzailearen kontrolpean adierazten da zentromeroaren (CEN) plasmidoan, eta honela eraikitzen da. Gas1-GFP sekuentzia PCR bidez anplifikatu zen pRS416-GAS1-GFP plasmidotik (24) (L. Popoloren oparia) eta CEN plasmidoaren pBEVY-GL LEU2 (Cren oparia) Xma I-Xho I gunean klonatu zen. Miller; Addgene plasmido zenbakia 51225; http://n2t.net/addgene: 51225; RRID: Addgene_51225). Emaitza den plasmidoari pRGS6 izena eman zitzaion. Axl2-GFP fusio-genea ere pBEVY-GL LEU2 bektorearen GAL1 sustatzailearen kontrolpean adierazten da, eta bere eraikuntza honako hau da. Axl2-GFP sekuentzia pRS304-p2HSE-Axl2-GFP plasmidotik (23) anplifikatu zen PCR bidez, eta pBEVY-GL LEU2 bektorearen Bam HI-Pst I gunean klonatu zen. Emaitza den plasmidoari pRGS12 izena eman zitzaion. Ikerketa honetan erabilitako oligonukleotidoen sekuentzia S2 taulan zerrendatzen da.
Anduia % 0,2 adenina eta % 2 glukosa [YP-dextrosa (YPD)], % 2 rafinosa [YP-raffinosa] legamia-estraktu aberatsa duen proteina p (YP) medioarekin (% 1 legamia-estraktu eta % 2 proteina ept). (YPR)] edo % 2 galaktosa [YP-galaktosa (YPG)] karbono-iturri gisa osatu zen, edo medio sintetiko minimo batean (% 0,15 legamia nitrogeno-basea eta % 0,5 amonio sulfatoa) nutriziorako beharrezkoak diren aminoazido eta base egokiak osatzeko, eta % 2 glukosa (glukosa medio sintetiko minimoa) edo % 2 galaktosa (galaktosa medio sintetiko minimoa) karbono-iturri gisa zituena.
Denbora errealeko irudigintzarako, GAL1 sustatzailearen pean konstruktua adierazten duten sec31-1 zelula mutante tenperaturarekiko sentikorrak YPR medioan hazi ziren 24 °C-tan gau osoan zehar, fase logaritmiko ertainera arte. YPG-tan 24 °C-tan ordubetez indukzioa egin ondoren, zelulak SG-tan inkubatu ziren 37 °C-tan 30 minutuz, eta ondoren 24 °C-ra eraman ziren jariatze-bloketik askatzeko. Konkanavalina A erabili zen zelulak beirazko portaobjektu batean finkatzeko eta SCLIM bidez irudikatu ziren. SCLIM Olympus IX-71 alderantzizko fluoreszentzia mikroskopioaren eta UPlanSApo 100×1.4 zenbakizko irekidurako olio-lentearen (Olympus), abiadura handiko eta seinale-zarata erlazio handiko biraketa-disko konfokal eskanerra (Yokogawa Electric), espektrometro pertsonalizatua eta hozte pertsonalizatuaren konbinazioa da. Sistemaren irudi-intensifikatzaileak (Hamamatsu Photonics) ×266.7-ko azken handitzea duen handitze-lente sistema bat eta elektroiak biderkatzen dituen karga-akoplatutako gailu kamera bat (Hamamatsu Photonics) eman ditzake (21). Irudien eskurapena software pertsonalizatu baten bidez egiten da (Yokogawa Electric). 3D irudietarako, neurrira egindako aktuadore piezoelektriko bat erabili dugu lente objektiboa bertikalki bibratzeko, eta zati optikoak 100 nm-ko distantziara bildu ditugu pila batean. Z-pilako irudia 3D voxel datu bihurtzen da, eta biraketa-disko konfokal mikroskopiorako erabilitako puntu-hedapen funtzio teorikoa erabiltzen da dekonboluzio-prozesatzeko Volocity softwarearen bidez (PerkinElmer). Kokapen-analisietarako atalasea automatikoki ezartzeko Volocity softwarea erabiliz, ERES neurtu zen karga barne. Lerro-eskaneatzeko analisia MetaMorph softwarea (Molecular Devices) erabiliz egin zen.
Erabili GraphPad Prism softwarea esangura estatistikoa zehazteko. Bi aldeetako Student-en t-testerako eta ohiko bariantzaren analisi unidirekzionala (ANOVA) probarako, taldeen arteko desberdintasunek P <0,05 (*)-n eragin esanguratsua dutela uste da.
Gas1-GFP-ren fluoreszentzia mikroskopiarako, log faseko zelulak gau osoan YPD-n hazi ziren eta zentrifugazio bidez bildu ziren, bi aldiz garbitu ziren fosfatozko soluzio salinoarekin, eta izotzean inkubatu ziren gutxienez 15 minutuz, eta ondoren mikroskopiopean jarraitu zuten aurretik deskribatutako Check (24) moduan. Leica DMi8 mikroskopioa (HCX PL APO 1003/1.40 oil PH3 CS) erabili zen eskurapenerako, lente objektibo batekin, L5 (GFP) iragazki batekin, Hamamatsu kamerarekin eta Application Suite X (LAS X) softwarearekin hornitua.
Laginak SDS lagin-bufferrean desnaturalizatu ziren 65 °C-tan 10 minutuz, eta ondoren SDS-poliakrilamida gel elektroforesi bidez (PAGE) bereizi ziren. Immunoblotting analisietarako, 10 μl lagin kargatu ziren errei bakoitzeko. Lehen mailako antigorputza: Erabili untxi poliklonal anti-Gas1 1:3000 diluzioan, untxi poliklonal anti-Emp24 1:500 diluzioan eta untxi poliklonal anti-GFP (H. Riezmanen opari bat) 1:3000 diluzioan. Sagu monoklonal anti-Pgk1 antigorputza 1:5000 diluzioan erabili zen (J. de la Cruzen opari bat). Bigarren mailako antigorputza: Errefau peroxidasa (HRP) konjugatuarekin ahuntz untxi immunoglobulina G (IgG) 1:3000 diluzioan erabili zen (Pierce). HRP-konjugatutako ahuntz-anti-sagu IgG erabili zen 1:3000 diluzioan (Pierce). Immunitate-erantzunaren eremua SuperSignal West Pico erreaktiboaren (Thermo Fisher Scientific) kimioluminiszentzia metodoaren bidez behatu zen.
(31)ean deskribatzen den bezala, immunoprecipitazio naturalaren esperimentu bat egin zen ER frakzio aberastuan. Laburbilduz, legamia-zelulak TNE bufferrean garbitu [50 mM tris-HCl (pH 7,5), 150 mM NaCl, 5 mM EDTA, 1 mM fenilmetilsulfonil fluoruroa eta proteasa inhibitzaileen nahasketa) 600 nm-tan (OD600) 100 dentsitate optikoan bi aldiz. Beirazko aleekin hautsi zen, eta ondoren zelula-hondakinak eta beirazko aleak zentrifugazio bidez kendu ziren. Ondoren, gainnatzailea 17.000 g-tan zentrifugatu zen 15 minutuz 4 °C-tan. Pellet-a TNE-n berriro eseki zen eta digitalis saponina gehitu zitzaion % 1eko azken kontzentraziora iritsi arte. Suspentsioa ordubetez inkubatu zen biraketa-sistemarekin 4 °C-tan, eta ondoren osagai disolbaezinak 13.000 g-tan zentrifugatu ziren 4 °C-tan 60 minutuz. Gas1-GFP immunoprezipitaziorako, lehenik eta behin, inkubatu lagina agarosa-ale hutsekin (ChromoTek) 4 °C-tan ordubetez, eta ondoren inkubatu GFP-Trap_A-rekin (ChromoTek) 4 °C-tan 3 orduz. Immunoprezipitatutako aleak bost aldiz garbitu ziren % 0,2 digoxigenina zuen TNE-rekin, SDS lagin-bufferrean eluitu ziren, SDS-PAGE-n bereizi eta immunoblotting bidez aztertu ziren.
(31)ean deskribatzen den bezala, ER frakzio aberastuan lotura gurutzatuaren determinazioa egin zen. Laburbilduz, ER frakzio aberastua 0,5 mM ditiobis(succinimidil propionato)-rekin inkubatu zen (Pierce, Thermo Fisher Scientific, Rockford, IL, AEB; 20 °C, 20 min). Lotura gurutzatuaren erreakzioa glizina gehituz itzali zen (50 mM kontzentrazio finala, 5 minutu, 20 °C).
Aurretik deskribatu bezala (50), zeramidaren MS analisia egin zen mota basatiko eta GhLag1 anduietan. Laburbilduz, zelulak fase esponentzialera hazi ziren (3 eta 4 OD600 unitate/ml) YPD-n 30 °C-tan, eta 25 × 107 zelula bildu ziren. Haien metabolismoa azido trikloroazetikoarekin itzali zen. Erabili erauzketa-disolbatzailea [etanola, ura, eterra, piridina eta 4,2 N amonio hidroxidoa (15:15:5:1:0,018 v/v)] eta 1,2 nmol barne-estandar C17 zeramida (860517, Avanti polar lipid) kalitatekoa. Erabili monometilamina erreaktiboa [metanola, ura, n-butanola eta metilamina disoluzioa (4:3:1:5 v/v)] erauzkinaren hidrolisi alkalino arina egiteko, eta ondoren erabili ur-asetutako n-butanola gatza kentzeko. Azkenik, erauzkinak modu positiboko disolbatzaile batean berriro eseki zen [kloroformoa/metanola/ura (2:7:1) + 5 mM amonio azetatoa] eta masa-espektrometroan injektatu zen. Erreakzio anitzeko monitorizazioa (MRM) egin zen esfingolipido molekulak identifikatzeko eta kuantifikatzeko. TSQ Vantage hirugarren mailako kuadrupolo masa-espektrometroa (Thermo Fisher Scientific) Nanomate HD (Advion Biosciences, Ithaca, NY) nanofluxu ioi iturri robotiko batekin hornituta dago lipidoen analisietarako. Talka-energia zeramida kategoria bakoitzerako optimizatuta dago. MS datuak modu positiboan lortu ziren. Erreplika biologiko bakoitzerako, lipidoen seinalea hiru neurketa independenteren mediana da.
(31) erreferentzian deskribatzen den bezala, Gas1-GFP adierazten zuten zelulak (800×107) immunoprezipitazio naturala jasan zuten. Gas1-GFP purifikatua SDS-PAGE bidez bereizi eta polibinilideno fluoruro (PVDF) mintz batera transferitu zen. Proteina PVDF amida beltzez tindatuz bistaratu zen. Gas1-GFP banda PVDFtik moztu eta 5 aldiz garbitu zen metanolarekin eta behin kromatografia likido-MS (LC-MS) urarekin. Mintz-zerrenda 500 μl 0,3 M NaOAc (pH 4,0), bufferrean eta 500 μl sodio nitrito nahasketa fresko disolbatuarekin 37 °C-tan 3 orduz inkubatuz, lipidoen frakzioa Gas1-GFPtik askatzen da eta glukosamina eta inositolaren artean lisatzen da (51). Ondoren, mintz-zerrenda lau aldiz garbitu zen LC-MS kalitateko urarekin, giro-tenperaturan lehortu zen eta nitrogeno-atmosferan gorde zen -80 °C-tan analisia egin arte. Kontrol gisa, PVDF mintzaren lagin huts bat erabili zen esperimentu bakoitzerako. Gas1-GFP-tik ateratako lipidoa MS bidez aztertu zen deskribatutako moduan (50). Laburbilduz, GPI-lipidoa zuten PVDF zerrendak 75 μl molde-disolbatzaile negatibotan berriro eseki ziren [kloroformoa/metanola (1:2) + 5 mM amonio azetatoa] eta esfingolipido espezieen elektroihinztadura ionizazio (ESI)-MRM/MS analisia gainditu zuten (TSQ Vantage). Kasu honetan, MS datuak ioi negatibo moduan lortu ziren.
Aurretik aipatu bezala, GPI ainguraren lipido zatia [3H]-inositol-markatutako GPI-AP-tik (16) bereizi zen. Lipidoak geruza fineko kromatografia bidez bereizi ziren disolbatzaile sistema bat erabiliz (55:45:10 kloroformo-metanol-% 0,25 KCl) eta FLA-7000 (Fujifilm) erabiliz bistaratu ziren.
Gas1-GFP (600×107) adierazten zuten zelulak bi aldiz garbitu ziren TNE bufferrean TNE bufferrean, eta beirazko aleekin hautsi ziren, eta ondoren zentrifugatu ziren zelula-hondakinak eta beirazko aleak kentzeko. Ondoren, gainnatzailea 17.000 g-tan zentrifugatu zen ordubetez 4 °C-tan. Pellet-a TNE-tan garbitu zen eta 1 U PI-PLC-rekin (Invitrogen) inkubatu zen % 0,2 digitalis saponina zuen TNE-n ordubetez 37 °C-tan. Entzima-tratamenduaren ondoren, mintza kendu zen 17.000 g-tan zentrifugatuz 4 °C-tan ordubetez. Gas1-GFP immunoprecipitatzeko, gainnatzailea GFP-Trap_A-rekin (ChromoTek) inkubatu zen 4 °C-tan gau osoan zehar. SDS-PAGE bidez bereizitako Gas1-GFP purifikatua Coomassie urdin distiratsuarekin tindatu zen. Gas1-GFP tindaketa-banda akueduktua inguratzen zuen grisetik moztu zen, eta ondoren, iodoazetamidarekin alkilatu eta ditiotreitolarekin erreduzitu ondoren, tripsinarekin gel-barneko digestioa egin zen. Atera eta lehortu triptiko peptidoak eta peptidoak GPI-glikanoekin. Lehortutako peptidoa 20 μl uretan disolbatu zen. Zati bat (8 μl) LC-n injektatu. Oktadezilsilano (ODS) zutabe bat (Develosil 300ODS-HG-5; barne-diametroa 150 mm × 1.0 mm; Nomura Chemical, Aichi Prefektura, Japonia) erabili zen peptidoak gradiente-baldintza espezifikoetan bereizteko. Fase mugikorra A disolbatzailea (% 0,08 azido formikoa) eta B disolbatzailea (% 0,15 azido formikoa % 80 azetonitriloan) dira. Accela HPLC sistema bat (Thermo Fisher Scientific, Boston, Massachusetts) erabili zen zutabea A disolbatzailearekin elutzeko 55 minututan, 50 μl min-1-ko emari-abiaduran 5 minutuz, eta ondoren B disolbatzailearen kontzentrazioa % 40ra igo zen. Eluatua etengabe sartu zen ESI ioi iturrian, eta peptido triptikoak eta GPI-glikanoak dituzten peptidoak LTQ Orbitrap XL bidez aztertu ziren (ioi-tranpa lineal hibridoa-orbitrap masa-espektrometroa; Thermo Fisher Scientific). MS konfigurazioan, kapilar-iturriaren tentsioa 4,5 kV-tan ezarri zen, eta transferentzia-kapilarraren tenperatura 300 °C-tan mantendu zen. Kapilar-tentsioa eta hodi-lentearen tentsioa 15 V eta 50 V-tan ezarri ziren, hurrenez hurren. MS datuak ioi positibo moduan lortu ziren (60.000ko bereizmena; milioiko 10 zatiko masa-zehaztasuna), 300/m/z masa/karga erlazioa (m/z) 3000ko masa-tarte batean. MS/MS datuak LTQ Orbitrap XL-ko ioi-tranparen bidez lortzen dira [datuak oinarritzen diren lehen 3 digituak, talkak eragindako disoziazioa (CID)].
MD simulazioak GROMACS (52) softwarea eta MARTINI 2 indar-eremua (53-55) erabiliz egin ziren. Ondoren, CHARMM GUI Mintz Eraikitzailea (56, 57) erabili zen dioleoilfosfatidilkolina (DOPC) eta Cer C18 edo DOPC eta Cer C26 dituen bigeruza bat eraikitzeko. Cer C26-ren topologia eta koordenatuak DXCE-tik eratorriak dira, esfingosina isatseko ale gehigarriak kenduz. Erabili behean deskribatutako prozesua geruza bikoitza orekatzeko eta exekutatzeko, eta ondoren erabili sistemaren azken koordenatuak Emp24 duen sistema bat eraikitzeko. Emp24 legamia-domeinu transmembranoa (173tik 193ra bitarteko hondakinak) α-helize gisa eraiki zen MD bisualaren (VMD) tresnaren egitura molekularra erabiliz (58). Ondoren, gainjarritako lipidoak kendu ondoren, proteina granulatu eta bigeruzan sartu zen CHARMM GUI erabiliz. Azken sistemak 1202 DOPC eta 302 Cer C26 edo 1197 DOPC eta 295 Cer C18 eta Emp24 ditu. Ionizatu sistema 0,150M-ko kontzentraziora. Lau errepikapen independente egin ziren bi geruza bikoitzeko konposizioetarako.
Lipidoen bikapa CHARMM GUI prozesua erabiliz orekatzen da, eta horrek 405.000 urrats minimizatu eta gero orekatzea dakar, non posizio-murrizketak pixkanaka murriztu eta ezabatzen diren, eta denbora-urratsa 0,005 ps-tik 0,02 ps-ra handitzen den. Orekatzea lortu ondoren, 6 µs sortzen ditu 0,02 ps-ko denbora-urratsarekin. Emp24 txertatu ondoren, erabili CHARMM GUI prozesu bera sistema minimizatu eta orekatzeko, eta gero exekutatu 8 segundoz ekoizpenean.
Sistema guztientzat, orekatze-prozesuan zehar, presioa Berendsen barostatoak (59) kontrolatzen du, eta ekoizpen-prozesuan zehar, presioa Parrinello-Rahman barostatoak (60) kontrolatzen du. Kasu guztietan, batez besteko presioa 1 bar da eta presio-akoplamendu eskema erdi-isotropikoa erabiltzen da. Orekatze eta ekoizpen-prozesuan, abiadura-berkalibrazioa duen termostato bat (61) erabiltzen da proteina, lipido eta disolbatzaile partikulen tenperatura akoplatzeko, hurrenez hurren. Eragiketa osoan zehar, helburu-tenperatura 310K da. Loturarik gabeko elkarrekintza kalkulatzen da parekatze-zerrenda bat sortuz Verlet eskema erabiliz, 0,005eko buffer-tolerantziarekin. Coulomb terminoa erreakzio-eremua eta 1,1 nm-ko mozketa-distantzia erabiliz kalkulatzen da. Vander Waals terminoak 1,1 nm-ko mozketa-distantzia duen mozketa-eskema bat erabiltzen du, eta Verlet mozketa-eskema erabiltzen da potentzial-desbideratzerako (62).
VMD erabiliz, DOPC fosfato aleen edo zeramida AM1 aleen eta proteinaren arteko mozketa-uhin-luzera 0,7 nm da, eta proteinarekin elkarreragiten duten lipidoen kopurua kalkulatzen da. Formula honen arabera, kalkulatu agortze-aberaste (DE) faktorea (63) adierazpenean bezala: DE faktorea = (proteinan dauden lipido guztien kopurua 0,7) proteinan 0,7 (lipido guztien artean dagoen Cer kopurua)
Jakinarazitako balioa batez besteko gisa lortzen da, eta errore-barrak SE-ren lau kopia independente dira. DE faktorearen esangura estatistikoa t probaren bidez kalkulatzen da [(batez bestekoDE-faktorea-1)/SE]. Kalkulatu P balioa banaketa unilateraletik.
GROMACS tresna erabili zen trazaren azken 250 ns-tan Emp24 duen sistemaren 2D dentsitate lateralaren mapa kalkulatzeko. Zeramidaren aberastasun/agortze mapa lortzeko, Cer-en dentsitate mapa Cer eta DOPC maparen baturarekin zatitzen da, eta gero gorputzean dagoen Cer-en kontzentrazioarenarekin zatitzen da. Kolore-maparen eskala bera erabiltzen da.
Artikulu honetarako material osagarriak lortzeko, ikus http://advances.sciencemag.org/cgi/content/full/6/50/eaba8237/DC1
Artikulu hau Creative Commons Aitortu-EzKomertziala Lizentziaren baldintzen arabera banatzen da, eta edozein euskarritan erabiltzea, banatzea eta erreproduzitzea baimentzen du, betiere azken erabilera ez bada irabazi komertzialik lortzeko eta jatorrizko lana zuzena dela bada premisa. Erreferentzia.
Oharra: Zure helbide elektronikoa ematea baino ez dizugu eskatzen, orrialdera gomendatzen duzun pertsonak mezu elektronikoa ikustea nahi duzula eta spam-a ez dela jakin dezan. Ez dugu helbide elektronikorik hartuko.
Galdera hau bisitaria zaren ala ez egiaztatzeko eta spam bidalketa automatikoa saihesteko erabiltzen da.
Sofia Rodriguez-Gallardo, Kazuo Kurokawa, Susana Sabido-Bozo, Alejandro Cortez · Gomez (Alejandro Cortes-Gomez), Atsuko Ikeda (Atsuko Ikeda), Valeria Zoni (Valeria Zoni), Auxiliadora Aguilera-Romero, Ana Maria Perez -Linero), Sergio Lopez (Sergio Lopez), Ar Miho Waga (Miako Ar Miho Waga), Misako Ar Miho Waga Miyako Riman (Miyako Riman), Prow Akira, Stefano Fanny, Akihiko Nakano, Manuel Muniz
3Dko bereizmen handiko denbora errealeko irudiek zeramida-katearen luzeraren garrantzia agerian uzten dute irteera-gune selektiboetan proteinak sailkatzeko.
Sofia Rodriguez-Gallardo, Kazuo Kurokawa, Susana Sabido-Bozo, Alejandro Cortez · Gomez (Alejandro Cortes-Gomez), Atsuko Ikeda (Atsuko Ikeda), Valeria Zoni (Valeria Zoni), Auxiliadora Aguilera-Romero, Ana Maria Perez -Linero), Sergio Lopez (Sergio Lopez), Ar Miho Waga (Miako Ar Miho Waga), Misako Ar Miho Waga Miyako Riman (Miyako Riman), Prow Akira, Stefano Fanny, Akihiko Nakano, Manuel Muniz
3Dko bereizmen handiko denbora errealeko irudiek zeramida-katearen luzeraren garrantzia agerian uzten dute irteera-gune selektiboetan proteinak sailkatzeko.
©2020 Zientziaren Aurrerapenerako Amerikako Elkartea. eskubide guztiak erreserbatuta. AAAS HINARI, AGORA, OARE, CHORUS, CLOCKSS, CrossRef eta COUNTER-en bazkidea da. ScienceAdvances ISSN 2375-2548.