Eskerrik asko Nature.com webgunea bisitatzeagatik. Erabiltzen ari zaren arakatzailearen bertsioak CSSrako laguntza mugatua du. Esperientzia onena lortzeko, arakatzaile eguneratua erabiltzea gomendatzen dizugu (edo Internet Explorer-en bateragarritasun modua desaktibatzea). Bitartean, laguntza jarraitua bermatzeko, gunea estilorik eta JavaScriptik gabe erakutsiko dugu.
Ornodunek ez bezala, uste da intsektuek ez dutela arentzako joera duten sexu-hormona esteroideik. Anopheles gambiae-n, 20-hidroxiekdisona (20E) ekdisona esteroideak eboluzionatu egin duela emeek sintetizatzen dutenean arrautzen garapena kontrolatzeko2 eta arrek sexualki transferitzen dutenean parekatze-aldi errefraktario bat eragiteko3. Arrautzen garapena eta parekatzea funtsezko ugalketa-ezaugarriak direnez, Anopheles eme eltxoek hormona-seinale horiek nola integratzen dituzten ulertzeak malaria kontrolatzeko programa berrien diseinua erraztu dezake. Hemen, agerian uzten dugu ugalketa-funtzio hauek sexu-esteroide desberdinek erregulatzen dituztela ekdisteroideak aktibatzen/inaktibatzen dituzten entzimen sare konplexu baten bidez. Arrentzako oxidatutako ekdisona bat identifikatu dugu, 3-deshidro-20E (3D20E), eta horrek gurasotasuna babesten du sexu-transferentziaren ondoren emeen sexu-harremanak itzaliz eta desfosforilazioaren bidez aktibatuz. Aipagarria da, 3D20E transferentziak Plasmodium infekzioan zehar arrautzen garapena mantentzen duten ugalketa-geneen adierazpena ere eragin zuela, kutsatutako emeen osasuna bermatuz. Emeetatik eratorritako 20E-k ez du sexu-harremanik eragiten. erantzuna, baina 20E inhibitzen duten kinasak inhibitzen direnean ugaltzen diren banakoei arrautzak erruteko aukera ematen die. Intsektu arentzako hormona esteroide espezifiko honen identifikazioak eta emeen sexu-harremanak, ugalkortasuna eta Plasmodium-ekin duen elkarrekintza erregulatzeko duen eginkizunak iradokitzen du malaria transmititzen duten eltxoen ugalketa-arrakasta murrizteko potentziala dagoela.
Malaria kasuak eta heriotzak berriro ere gora egiten ari dira4, Anopheles eltxoetan, gizakien malaria parasitoen bektore bakarra baita, intsektizidekiko erresistentzia zabaldu delako. Eltxo hauen ugaltze-biologia bereziki erakargarria da malaria kontrolatzeko esku-hartze berrietarako, emeak behin bakarrik ugaltzen baitira5; ugaltze-gertaera bakar hau antzu bihurtzeak potentzial handia izango luke eltxoen populazioak murrizteko zelaian.
Emakumeak sexu-ezgaitasunean geratzen dira gizonezkoengandik hormona esteroide kopuru handia jaso ondoren. Ikerketek erakutsi dute ugalketa gehiago zailtzen duen eragilea 20-hidroxiekdisona (20E) dela, larba-fasean ugalketa-zikloaren erregulatzaile gisa ezagunagoa den hormona esteroidea. Arrek 20E sintetizatu eta transferitzeko duten gaitasuna bereziki eboluzionatu egin da Cellia7 azpigeneroaren parte diren Anopheles espezieetan, Afrikan banatzen dena eta malariaren bektore arriskutsuenak barne hartzen dituena, Anopheles gambiae barne. Hau bereziki aipagarria da, espezie hauetan emeek ere 20E sortzen baitute odol-jan bakoitzaren ondoren, eta 20Ek oogenesi-zikloa gidatzen duelako (ikus 8. erreferentzia). Hala ere, gutxi dakigu emeek ekdisonaren bi iturri desberdinetatik (arren transferentzia eta odol-elikaduraren indukzioa) nola integratzen dituzten ugaltzeko gaitasuna arriskuan jarri gabe. Izan ere, emeek sortutako 20Eak sexu-intolerantzia eragiten badu, horrek antzutasuna eragingo du birjina elikatzen diren banakoetan, oso ohikoa den portaera eltxo hauetan5.
Azalpen posible bat da A. gambiae arrek arrentzako ekdisona espezifiko aldatu bat transferitzen dutela, eta horrek emeen ugalketa-aparatuan seinaleztapen-kaskada bat aktibatzen duela, eta horrek parekatze-ezegonkortasuna eragiten duela. Hala ere, ornodunek hormona esteroide ugari dituzten arren, hala nola estrogenoa eta androgenoa (9. erreferentzian berrikusita), dakigunez, androgenikoki joera duten esteroideak ez dira intsektuetan identifikatu.
A. gambiae-ren sexu-heldutasuneko gizonezkoen guruin osagarrian (MAG) dauden hormona esteroideen errepertorioa zehazteari ekin genion, esteroide aldatzaile posibleen bila. Aurretik erabilitako metodo ez hain espezifikoa erabili beharrean, errendimendu handiko kromatografia likidoa erabiliz eta tandem masa-espektrometriarekin (HPLC-MS/MS) batera, ekdisona (E) eta 20E detektatu genituen ehun honetan, aurreko emaitza berretsiz. Hala ere, laginan oxidatutako fosforilatutako esteroideak nagusi ziren, 3-deshidro-20E-22-fosfato (3D20E22P)12 formularekin bat etorriz (1. irudia). Beste forma batzuk 3-deshidro-20E (3D20E) eta 20E-22-fosfato (20E22P) dira. 3D20E22P-ren HPLC-MS/MS seinalearen intentsitatea bere forma desfosforilatua, 3D20E, baino bi magnitude-orden handiagoa zen, eta E eta 20E-rena baino hiru magnitude-orden handiagoa (1. irudia). Gorputzeko beste atal batzuetan eta beheko aldean... ugalketa-aparatua (LRT; Datu Hedatuak 1a irudia). Ekdisteroideak ere aztertu genituen itxi berri diren (<1 egun dituzten) ar eta emeetan, eta 3D20E eta 3D20E22P MAG-n bakarrik detektatu genituen; E, 20E eta 20E22P bi sexuetan zeuden (Datu Hedatuak 1b irudia). Datu hauek iradokitzen dute A. gambiae ar helduek emeek sintetizatzen ez dituzten hormona aldatzaileen titulu altuak sortzen dituztela beren MAG-etan.
MAG eta emeen LRT (aurikulak, besikula seminalak eta parobarioa barne) 4 eguneko (4 eguneko) ar birjinetatik eta eme birjin eta parekatuetatik (0,5, 3 eta 12 hpm) disekzionatu ziren. Ehun hauetan dagoen ekdisona HPLC-MS/MS bidez aztertu zen (batez bestekoa ± sem; t-test parekatu gabea, bi aldeetakoa, aurkikuntza faltsuen tasa (FDR) zuzenduta; NS, ez esanguratsua; *P < 0,05, **P < 0,01. 3D20E: 3 ordu vs. 0,5 ordu, P = 0,035; 12 ordu vs. 3 ordu, P = 0,0015; 12 ordu vs. 0,5 ordu, P = 0,030. 3D20E22P: 3 ordu vs. 0,5 ordu, P = 0,25; 12 ordu vs. 3 ordu, P = 0,0032; 12 ordu vs. 0,5 ordu, P = 0,015). Datuak hiru erreplika biologikotatik datoz. Intereseko ekdisona bakoitzaren gailurraren azalera kalkulatu eta eltxo kopuruaren arabera normalizatu zen. Ekdisona kolorez irudikatzen da honela: E, berdea; 20E, laranja; 20E22P, morea; 3D20E, urdina; 3D20E22P, arrosa. Txertatuak y ardatzeko eskala handitzen du ekdisona maila baxuagoak erakusteko.
3D20E22P eta 3D20E estalketa zehar transferitzen diren ikertzeko, eme LRTak disekzionatu genituen estalketaren ondoren hainbat unetan. Ekdisona ez zen aurkitu birjinetan, baina 3D20E22P kantitate handiak ikusi genituen LRTan estalketaren ondoren berehala (0,5 ordu estalketa ondoren, hpm), denborarekin gutxituz, eta 3D20E mailak nabarmen handitu ziren bitartean (1. irudia). Kimikoki sintetizatutako 3D20E estandar gisa erabiliz, zehaztu genuen hormona esteroide honen mailak estalketa LRTetan 20E baino gutxienez 100 aldiz handiagoak zirela (Datu Hedatuen Taula 1). Beraz, 3D20E22P da estalketa zehar eme LRTra transferitzen den ar ekdisona nagusia, eta bere forma desfosforilatua, 3D20E, oso ugaria bihurtzen da estalketaren ondoren. Horrek iradokitzen du azken ekdisona horrek emeen estalketa osteko biologian duen zeregin garrantzitsua duela.
RNA sekuentziazio (RNA-seq) datu-multzo berri bat sortu ondoren (2a irudia), bioinformatika-hodi pertsonalizatu bat erabiliz, ekdisona kinasa (EcK), ekdisona oxidasa (EO) eta 20E-k aldatutako fosfatasa genea kodetzen duen ekdisona bilatu genituen. EPP) ugalketa-ehunetan adierazten da. EPP gene hautagai bat eta bi EcK gene potentzial identifikatu genituen (EcK1 eta EcK2), baina ez genuen EO gene hautagai onik aurkitu. Aipagarria da EPP gene indibidualak maila altuetan adierazi zirela (pertzentil 98,9) Gambiako MAGetan, baina ez emakumezko LRTetan (2b irudia), gure itxaropenen aurka, 3D20E22P-ren desfosforilazioa emakumezko ehun honetan gertatu baitzen. Beraz, uste dugu gizonezko EPP transferitu daitekeela estalketa-prozesuan. Izan ere, in vivo isotopo egonkorreko markaketa erabili genuen emakumezko proteina estalketaren ondoren maskaratzeko, emakumezko atrioan MS bidez identifikatutako entzima bat (2c irudia eta 1. taula osagarria). EPPren presentzia MAGn eta eme parekatuetan (baina ez birjinetan) LRTn ere baieztatu zen antigorputz espezifikoak erabiliz (2d irudia).
a, Sexu bakoitzaren ugalketa-ehunetan EcK, EO eta EPP kodetzen dituzten geneak bilatzeko bioinformatika-hodi pertsonalizatu bat. Gezien ondoan dauden zenbakiek urrats bakoitzean ar eta emakume hautagaien kopurua adierazten dute. Analisia honek EPP gene bat (EPP) eta EcK gene bat (EcK1) identifikatu zituen, eta bi sexuetan adierazten den baina ez duen EO gene hautagairik ematen. b, Anopheles gambiae eta Anopheles albicans ehun birjinetan (V) eta parekatze-prozesuan (M) gene hautagaien adierazpena alderatzen duen bero-mapa. Spca, ernalketa; MAGak, guruin osagarriak gizonezkoetan; gorputzeko beste atal batzuk, besteak beste, bularrak, hegoak, hankak, gorputz gantzak eta barneko organoak bi sexuetan, eta obulutegiak emeetan. EcK2 oso adierazita dago bai Gambiako MAGn bai aurikuletan, EPP, berriz, MAGn bakarrik aurkitzen da.c, gizonezkoen eiakulatu taldearen translokazioaren analisi proteomikoa emeen aurikuletara 3, 12 eta 24 hpm-tan, 67 proteina ugarienak erakusten dituena. Emeak 15N zuen dieta batekin hazi ziren proteina guztiak etiketatzeko (eta maskaratzeko). Etiketatu gabeko arrak etiketatutako emeekin parekatu ziren, eta eme LRTak 3, 12 eta 24 hpm-tan disekzionatu ziren analisi proteomikorako (ikus 1. taula osagarria eiakulazio proteinen zerrenda osoa ikusteko). Txertatutako irudian, EPP, Eck1 eta EcK2 detektatu ziren ar birjinen MAGn ehun horien analisi proteomiko bidez.d, EPP western blot bidez detektatu zen eme parekatuen MAGn eta LRTn, baina ez eme birjinetan edo ar birjinetan edo emearen gainerakoan. gorputza. Mintzak aldi berean anti-aktina (karga-kontrola) eta anti-EPP antigorputzekin zundatu ziren. Gizonezko guztiak birjinak dira. Ikusi 1. irudi osagarria gel iturriaren datuak ikusteko. Western blot-ak bi aldiz egin ziren antzeko emaitzak lortuz.
EPP-ren ekdisteroide fosfofosfatasa jarduera HPLC-MS/MS bidez inkubatu ondoren egiaztatu zen, MAG-tik isolatutako 3D20E22P-rekin (Datu Hedatuak, 2a irudia). Gainera, EPP RNA bidezko interferentziaren (RNAi) bidez isilarazi genuenean, fosfatasa jardueraren murrizketa handia detektatu genuen ar hauen ugalketa-ehunetan (3a irudia), eta EPP-isilarazitako arrekin parekatu ziren emeek 3D20E desfosforilatuaren proportzio nabarmen txikiagoa erakutsi zuten (3b irudia), geneen isiltze partziala izan arren (Datu Hedatuak, 2b eta c irudiak). Aitzitik, ez genuen 20E22P/20E erlazioan aldaketa esanguratsurik detektatu eltxo berdinetan, eta horrek iradoki lezake entzima 3D20E22P-rentzat espezifikoa dela (3b irudia).
a, MAG-n fosfatasa jarduera gutxitzea EPP isiltzearen ondorioz, EPP RNA bikoitz-kateatua (dsEPP) edo GFP RNA bikoitz-kateatua (dsGFP) kontrolak erabiliz. Hogei MAG multzo erabili ziren erreplika bakoitzean (P = 0,0046, t-test parekatua, bi aldeetakoa), puntu bereiziekin irudikatuta.b, EPP isildutako arrekin parekatu ziren emeek 3D20E desfosforilatuaren proportzio nabarmen txikiagoa zuten 3 hpm-tan (P = 0,0043, t-test parekatu gabea, bi aldeetakoa), 20E mailak, berriz, ez ziren aldatu (P = 0,063, parekatu gabea). t-testa, bi aldekoa). Datuak batez besteko ± sem gisa aurkezten dira, 13, 16 eta 19 emeko hiru multzotatik.c, EPP isilarazitako arrekin parekatu ziren emeek berriro parekatzeko tasak nabarmen handiagoak izan zituzten (P = 0,0002, Fisherren proba zehatza, bi aldekoa). Emeak lehenik parekatzera behartu zituzten beren parekatze-egoera bermatzeko; Bi egun geroago, esperma transgenikoa zeramaten beste ar batzuekin harremanetan jarri ziren, transgenearen PCR kuantitatibo bidezko berriro parekatzeko tasak ebaluatzeko.d, EPP isilarazitako arrekin parekatu ziren odolez elikatutako emeek ugalkortasun nabarmen murriztua izan zuten (P < 0,0001; Mann-Whitney testa, bi aldea) eta arrautza kopurua apur bat murriztua (P = 0,088, Mann-Whitney testa, bi aldea), errunaldi-tasa ez zen aldatu (P = 0,94, Fisherren proba zehatza, bi aldea). Panel guztietan, n-k eltxo-lagin biologikoki independenteen kopurua adierazten du. NS, ez da esanguratsua. *P < 0,05, **P < 0,01, ***P < 0,001, ****P < 0,001.
Ondoren, ekdisonaren desfosforilazioa garrantzitsua den emeengan parekatze-erresistentzia eragiteko ebaluatu genuen. Aipagarria da EPP gabeko arrekin parekatu ziren emeak maiztasun askoz handiagoan (% 44,9) berriro parekatu zirela kontrol-emeekin (% 10,4) baino (3c irudia). Ugalkortasunaren jaitsiera nabarmena ere ikusi genuen (3d irudia, ezkerrean) eta eme hauek jarritako arrautzen kopuruaren jaitsiera txiki bat (3d irudia, erdian), emeek jarritako arrautzen ehunekoa (parekatzeak emeetan eragindako beste erantzun bat) ez zen eraginik izan (3d irudia, eskuinean). 3D20E22P-rekiko EPP-ren espezifikotasuna ikusita, emaitza hauek iradokitzen dute parekatzean transferitutako EPP-k 3D20E aktibatzeak zeregin garrantzitsua izan dezakeela emeen parekatze gehiagorako harmena itzaltzeko, lehenago 20E-ren sexu-transferentziari egotzitako portaera bat. Beraz, arentzako hormona espezifiko honek ere eragin handia du emeen ugalkortasunean.
Ondoren, 20E eta 3D20Eren jarduerak alderatu genituen injekzio-esperimentuetan, sexualki helduak diren birjinetan, kimikoki sintetizatutako 3D20E (4a-c irudia) eta komertzialki eskuragarri dagoen 20E erabiliz. Ikusi genuen 3D20E 20E baino nabarmen eraginkorragoa zela emeen parekatze-sentsibilitatea ixteko bi kontzentrazioetan (4d irudia). Aipagarria da, LRT-n 3D20Eren maila fisiologikoaren erdiak (1.066 pg injekzioaren ondoren vs. 2.022 pg parekatze ondoren) eme errefraktarioen proportzio bat eragin zuela, 20Eren maila fisiologikoa baino 20 aldiz handiagoa (361 pg injekzioaren ondoren) injekzioaren ondorengo 24 orduetan kontzentraziorik altuenean, parekatze ondorengo 18 pg; Datu Hedatuen 1. Taula). Emaitza hau bat dator 20E-ren sexu-transferentziak ez duela parekatze-aldi errefraktoriorik eragiten dioen ideiarekin, eta 3D20E guraso-seme-alaben arteko harremana bermatzeko faktore garrantzitsu gisa adierazten du. 3D20E 20E baino nabarmen aktiboagoa izan zen eme birjinen arrautza-erruteen saiakuntzan (4e irudia), eta horrek iradokitzen du EPP isilaraztearen ondoren ikusi genuen arrautza-errute-tasa normala parekatzeak eragindako emakumezko faktoreek oraindik sortutako 3D20E jarduera hondarraren presentziaren ondorio zela.
(a,b) 3D20E kimikoki sintetizatua 20E-tik (a) bihurketa/eraginkortasun oso handiarekin (hiru sintesi-erreakzio independenteren batez besteko ± sem gisa aurkeztutako datuak) (b).c, Masa-espektroa (beheko erdia) eme LRT parekatuetan aurkitutako ekdisonarekin bat dator zehazki.d, 20E-rekin alderatuta (0,63 µg, P = 0,02; 0,21 µg, P < 0,0001; Fisherren proba zehatza, bi aldeetan) eta % 10eko etanolarekin (0,63 µg, P < 0,0001; 0,21 µg, P < 0,0001; Fisherren proba zehatza, bi aldeetan), 20E kontrola baino nabarmen handiagoa izan zen dosi handiagoetan bakarrik (0,63 µg, P = 0,0002; 0,21 µg, P = 0,54; Fisherren proba zehatza, bi aldeetan).e, 3D20E Injekzioak % 10eko etanol kontrol-taldearekin alderatuta errunaldi-tasak nabarmen handiagoak eragin zituen eme birjinetan (0,21 µg, P < 0,0001; 0,13 µg, P = 0,0003; Fisherren proba zehatza, bi aldeetakoa), 20E-k kontrolekin alderatuta dosi handiagoetan bakarrik eragin zuen bitartean (0,21 µg, P = 0,022; 0,13 µg, P = 0,0823; Fisherren proba zehatza, bi aldeetakoa). 3D20E-k errunaldi-tasak nabarmen handiagoak eragin zituen 20E-k baino dosi handiagoetan (0,21 µg, P = 0,0019; 0,13 µg, P = 0,075; Fisherren proba zehatza, bi aldeetakoa). Panel guztietan, n-k eltxo-lagin biologikoki independenteen kopurua adierazten du. NS, ez da esanguratsua. *P < 0,05, **P < 0,01, ***P < 0,001, ****P < 0,001. Datuak hiru errepikapenetatik datoz.
Aurreko ikerketetan, zehaztu genuen hormona esteroideen sexu-transferentziak MISOren (Mating-Induced Stimulator of Oogenesis 11) adierazpena eragiten duela, A. gambiae emeak P. falciparum infekziotik babesten dituen emakumezkoen ugalketa-gene bat. 13k, gizakien malaria parasito hilgarrienak, eragindako osasun-kostuak. MISOk Anophelesen ugalketa-egokitasunerako duen garrantzia kontuan hartuta, malaria endemikoa den eremuetan, 3D20E edo 20E hormonak zeinek eragiten duen gene honen adierazpena zehaztea erabaki genuen. Ikusi genuen 20E injekzioak hormona nuklearren hartzaile batzuk (HR), hala nola HR3 eta HR4, eta beheranzko esteroideen ohiko jomugak, hala nola Vg14, 15, 16 gene yolkogenikoak, espezifikoki edo indartsuago induzitzen zituen arren, MISO indartsuago induzitzen zuela 3D20Ek (Datu Hedatuak 3. irudia). Beraz, hormona esteroide androgeniko honen sexu-transferentziak emeak infekzio parasitoak dakartzan kostuetatik babesten dituzten mekanismoak eragiten dituela dirudi. Gainera, 3D20Ek modu desberdinean eragiten die biei E hartzailearen EcR isoformak, EcR-A eraginez eta EcR-B erreprimituz, eta beste parekatze-eragile gene batzuk indartsuago eraginez, HPX15 barne, emeen ugalkortasunean eragina duena. Horrek azal lezake EPP isilarazitako arrekin parekatu diren emeetan behatutako antzutasun nabarmena (Datu Hedatuak 3. irudia). Datu hauek iradokitzen dute bi ekdisona hormonek lehentasunez aktibatzen dituzten beheranzko bideen existentzia, sexu-funtzio espezifikoaren oinarrian egon daitezkeenak.
Ondoren, gure bioinformatika-hodian identifikatutako bi EcK geneen funtzioa probatu genuen. EcK1 edo EcK2 isilarazteak gizonezkoengan hilkortasun esanguratsua eragin zuen (Datu Hedatuak 4a irudia), eta horrek iradokitzen du ekdisonaren fosforilazioa, eta beraz, inaktibazioa, garrantzitsua dela biziraupenerako. EcK2 EcK1 baino maila altuagoetan adierazten zenez eta proteomikaren bidez MAGetan detektatu zenez (2b eta c irudiak eta 2. taula osagarria), bere ekdisteroide kinasa jarduera balioztatu genuen 20E-rekin inkubatuz, eta horrek 20E22P fosforilazioa eragin zuen (Datu Hedatuak 2. irudia).4b). 3D20E substratu gisa erabiltzean, ezin izan genuen 3D20E22P produktu fosforilatua detektatu (Datu Hedatuak 4c irudia), eta horrek iradokitzen du 20E, 3D20E baino, EcK2-ren helburu hobetsia izan daitekeela.
Gure RNA-seq analisiaren arabera, EcK2 eme birjinen LRT-an ere oso adierazita zegoen, non estalketaren ondoren itzali zen (2b irudia). Datu hauek baieztatu genituen eta zehaztu genuen EcK2-ren adierazpena ez zela odol-elikadurak eragiten (Datu Hedatuak 5a irudia). Gure hasierako MS esperimentuak zabalduz, zehaztu genuen 20E22P-ren gailurra 20E-ren gailurrarekin estuki lotuta zegoela (odol-janaren ondorengo 22-26 ordu; Datu Hedatuak 5b irudia). Eme birjinetan EcK2-ren isiltzeak 20E eta 20E22P-ren arteko erlazio erlatiboa 3 aldiz handitzea eragin zuen odol-janaren ondorengo 26 orduetan (Datu Hedatuak 2c eta 5c irudiak), eta horrek baieztatzen du EcK2-k 20E fosforilatzen duela emeetan ere. Aipagarria da EcK2-rik gabeko birjinek sexu-hartzailetasun osoa mantendu zutela (Datu Hedatuak 5d eta e irudiak), eta horrek iradokitzen du emeek 20E-ren ekoizpenak ez duela estalketa-aldi errefraktorioak eragiten. Hala ere, eme hauek... arrautza-errute-tasak nabarmen handitu ziren kontrol-taldearekin alderatuta, birjinen % 30 baino gehiagok arrautzak errun baitzituzten (Datu Hedatuak 5f irudia). Eck2 RNA bikoitz-katedun (dsEcK2) injekzioak odola eman ondoren egin baziren, errunaldia ez zen gertatu, eta une horretan odol-irensteagatik sortutako 20E gailurra jaitsi egin zen. Oro har, emaitza hauek odola xurgatu ondoren sortutako 20E-k errunaldia eragin dezakeela dioen eredu bat babesten dute, baina errunaldi-blokeoa (EcK2 eta agian beste faktore batzuk) estaltzeak itzaltzen duenean bakarrik. Ez 20E ez 3D20E injekzioek ez zuten EcK2-ren espresioa inhibitzen birjinengan (Datu Hedatuak 5g irudia), eta horrek iradokitzen du beste faktore batzuek bitartekatzen dutela kinasa honen inhibizioa. Hala ere, odola eman ondoren lortutako 20E mailak ez ziren nahikoak izan estaltze-deserosotasuna eragiteko, baina sexu-transferitutako 3D20E-ren titulu altuek eragin zituzten eraginkortasunez.
Gure emaitzek A. gambiae-ren ugalketa-arrakasta erregulatzen duten mekanismoei buruzko ikuspegi garrantzitsuak eskaintzen dituzte. Eredu bat sortu da, non arrak 3D20E-ren titulu altuak sintetizatzeko eboluzionatu duten, arentzako ekdisona aldatu bat, emeak ugalketa gehiagorako desensibilizatuz gurasotasuna ziurtatzen duena. Aldi berean, malaria bektore hauek sistema eraginkor bat ere garatu dute emeetan 3D20E aktibatzeko, arentzako EPP espezifikoaren sexu-transferentziari erantzunez. Dakigunez, hau da ar eta emeek menderatutako hormona esteroideen sistema baten lehen adibidea, intsektuetan funtzio berezi eta kritikoa betetzen duena. Arrentzako ekdisonaren funtzio espezifikoa postulatu da, baina ez da behin betiko frogatu. Adibidez, neurri handi batean ezeztatzen den hipotesi bat 18 da funtzio horiek 20E aitzindari E1-ek egin ditzakeela. Jakina da Drosophilan monandria sexu-peptido txikien sexu-transferentziak eragiten duela19,20, sexu-peptidoen hartzaile espezifikoen bidez emakumezkoen ugalketa-aparatua inerbatzen duten neuronekin elkarreragiten dutenak21,22. Lan gehiago behar da beheranzko seinaleztapen-kaskadak zehazteko. 3D20E-k kontrolatutako A. gambiae emeetan eta kaskada hauek eltxoen eta Drosophilaren artean kontserba daitezkeen zehaztea.
Gure ikerketan identifikatutako 3D20E-k emeen ugalkortasunean eta portaeran duen garrantzia kontuan hartuta, 3D20E-ren sintesi eta aktibaziora daramaten bideek etorkizuneko eltxoen kontrol estrategietarako aukera berriak eskaintzen dituzte, hala nola, intsektu esterilen teknologia estrategietan ar antzu lehiakorrak sortzea. Basoan askatzeko edo birjinen jolasean 3D20E imitatzeko erabiltzea. 3D20E-ren ar-espezifiko funtzioa eboluzionatu egin daiteke A. gambiae-k eta beste Cellia espezie batzuek beren semena parekatze-tapoietan koagulatzeko gaitasuna eskuratu zutenean, horrek hormona eta hormona aktibatzen duten entzima kopuru handia modu eraginkorrean transferitzea ahalbidetzen baitu. Era berean, monandria ezartzeko 3D20E-ren eboluzioak emeei (MISOren adierazpen handiaren bidez) mekanismo bat eskaintzen die malaria-prebalentzia handiko eremuetan beren ugalketa-egokitasuna hobetzeko, eta horrek zeharka laguntzen du Plasmodium-aren transmisioan. 20E emeak Anopheles eltxo emeetan P. falciparum-en biziraupenean eta hazkuntzan eragin sakonak dituela frogatu denez,24 bai ar bai emeen hormona esteroideen bideak eltxo-parasitoen interakzioen alderdi nagusiak dira orain.
A. gambiae G3 anduiak intsektuen baldintza estandarretan hazi ziren (26-28 °C, % 65-80 hezetasun erlatiboa, 12:12 orduko argi/iluntasun fotoperiodoa). Larbak arrain-janari hautsarekin elikatu ziren (TetraMin Tropical Flakes, Koi Pellets eta Tetra Pond Sticks 7:7:2 proportzioan). Eltxo helduei % 10eko dextrosa-soluzioa eta astero giza odola eman zitzaien ad libitum (aztertzeko odol-osagaiak). Eltxo birjinak sexuak pupa-fasean bereiziz lortu ziren, muturrak mikroskopia bidez aztertu ondoren. DsRed transgenea daramaten arrak lehenago deskribatu dira.
Behartutako parekatze-esperimentuak aurretik deskribatutako protokoloen arabera egin ziren. Parekatze naturalarentzat, 4 eguneko eme birjinak 1:3 proportzioan mantendu ziren sexualki helduak ziren ar birjinekin bi gauz. Arrak dsEPP injektatu ziren esperimentuetan, kaiolatzea injekzioaren ondorengo 3-4 egunekin bat etorri zen, fosfatasa jarduera gehien isilarazi zenean (Datu Hedatuak 2b irudia).
Eltxoen ehunak, gainerako gorpuak (gorputzaren gainerakoa) edo gorputz osoa % 100eko metanolean disekzionatu eta ale-makinarekin homogeneizatu ziren (2 mm-ko beira-aleak, 2.400 rpm, 90 seg). Ehunen kantitateak eta metanol-bolumenak hauek ziren: gorputzaren gainerakoa, 50 1.000 µl-tan; MAG, 50–100 80 µl; emakumezkoen LRT, 25–50 80 µl. Prezipitatua bigarren metanol-erauzketa baten menpe jarri zen metanol-bolumen berarekin. Zelula-hondakinak zentrifugazio bidez kendu ziren. Bi erauzketetako metanola konbinatu eta nitrogeno-fluxupean lehortu zen, eta ondoren uretan % 80ko metanol-bolumen hauetan berriro eseki zen: gorputzaren gainerakoa, 50 µl; MAGak eta emakumezkoen LRT, 30 µl.
Laginak masa-espektrometro batean (ID-X, Thermo Fisher) aztertu ziren, LC tresna batera (Vanquish, Thermo Fisher) akoplatuta. 5 µl lagin 3 µm-ko, 100 × 4,6 mm-ko zutabe batean (Inspire C8, Dikma) injektatu ziren, 25 °C-tan mantenduta. LCrako fase mugikorrak A (ura, % 0,1 azido formikoa) eta B (azetonitriloa, % 0,1 azido formikoa) izan ziren. LC gradientea honako hau izan zen: % 5 B minutuz, eta gero % 100 B-ra igo zen 11 minututan zehar. % 100ean 8 minutu igaro ondoren, zutabea % 5 B-tan berriro orekatu 4 minutuz. Emari-tasa 0,3 ml min-1 izan zen. MS iturrian ionizazioa berotutako elektroihinztadura ionizazioaren bidez lortzen da, modu positibo eta negatiboetan.
Masa-espektrometroak 350etik 680ra bitarteko m/z tarteko datuak neurtzen ditu 60.000ko bereizmenean MS moduan.MS/MS datuak [M + H]+ (helburu guztiak), [M - H2O + H]+ (helburu guztiak) eta [M - H]- (helburu fosforilatuak) lortu ziren.MS/MS datuak erabili ziren estandarrik ez zegoen helburuen ekdisonaren propietateak berresteko.Ekdisteroide ez-zuzenak identifikatzeko, % 15eko ugaritasun erlatiboa baino handiagoa zuten HPLC gailur guztien MS/MS datuak aztertu ziren.Kuantifikatu estandar puruetatik sortutako kurba estandarrak (20E, 3D20E) erabiliz lagin espezifiko baten kantitate absolutuak edo diluzioak kalkulatzeko (beste helburu guztiak) eta ar batean aurkitutako kantitateekiko baliokidetasuna kalkulatzeko.3D20Erako, kuantifikazioa honako aduktu hauen batura erabiliz egin zen: [M + TFA]-, [M + COOH]-, [M + Na]+, [M + Cl]-, [M + NO3]-.Datuak Tracefinder (4.1 bertsioa) erabiliz erauzi eta kuantifikatu ziren.MS/MS datuak Xcalibur (4.4 bertsioa) erabiliz aztertu ziren.E, 20E eta 3D20E-ren MS espektroak dagokien estandarrekin alderatu ziren.3D20E22P Girard-en erreaktiboarekin deribatuz aztertu zen.20E22P m/z erlazioaren bidez aztertu zen.
3D20E22P MAG-tik purifikatu zen. Purifikazioa eskala analitikoan egin zen kromatografo likido ultra-errendimendu bat (Acquity, Waters) erabiliz, koadrupolo masa-detektagailu batekin (QDa, Acquity, Waters), HPLC-MS/MS analisiak erabilitako LC baldintza berberekin. Frakzioen bilketa abiarazi zen 3D20E22P-ri dagokion m/z aurretik zehaztutako atxikipen-denbora berean detektatu zenean. Ondoren, ateratako konposatuen purutasuna HPLC-MS/MS bidez egiaztatu zen, goian deskribatutako moduan.
RNA osoa 10-12 ugalketa-ehunetatik edo gorputzeko beste atal batzuetatik (bururik gabe) erauzi zen TRI erreaktiboa (Thermo Fisher) erabiliz, fabrikatzailearen argibideak jarraituz.RNA TURBO DNasarekin (Thermo Fisher) tratatu zen.DNA Moloney saguaren leuzemia birusaren alderantzizko transkriptasa (M-MLV RT; Thermo Fisher) erabiliz sintetizatu zen, fabrikatzailearen argibideak jarraituz. Alderantzizko transkripzio PCR kuantitatiborako primerrak (RT-qPCR; 2. Datu Taula Hedatua) lehenago argitaratu ziren24 edo Primer-BLAST26 erabiliz diseinatu ziren, 70-150 bp-ko tamainako eta exon-exon loturak hartzen dituzten produktuak edo primer bikoteko primerrak exon bereiziak hartzen dituztenak lehenetsiz.Hiru edo lau errepikapen biologikoetako DNA laginak lau aldiz diluitu ziren uretan RT-qPCRrako.Kuantifikazioa 15 µl-ko errepikapen erreakzioetan egin zen, 1× PowerUp SYBR Green Master Mix (Thermo Fisher), primerrak eta 5 µl DNA diluitu zituztenak.Erreakzioak QuantStudio 6 Pro batean egin ziren. PCR denbora errealeko sistema (Thermo Fisher) erabili zen eta datuak Design and Analysis (2.4.3 bertsioa) erabiliz bildu eta aztertu ziren. Ikerketa honetan erakutsi den bezala, kantitate erlatiboak RpL19 (AGAP004422) erribosoma-genearekiko normalizatu ziren, eta gene horren adierazpena ez zen nabarmen aldatu odola ematearekin 27 edo parekatzearekin 3.
RNAren kalitatea Agilent Bioanalyzer 2100 Bioanalyzer (Agilent) bat erabiliz egiaztatu zen. Illumina bikoteka mutur liburutegiak prestatu eta MIT eta Harvardeko Broad Institutuan exekutatu ziren. Sekuentziazio irakurketak A. gambiae genomarekin (PEST anduia, 4.12 bertsioa) lerrokatu ziren HISAT2 (2.0.5 bertsioa) erabiliz, parametro lehenetsiekin. Mapeatze kalitatearen (MAPQ) puntuazioak <30 zituzten irakurketak kendu ziren Samtools (1.3.1 bertsioa) erabiliz. Geneetara mapatutako irakurketa kopurua htseq-count (0.9.1 bertsioa) erabiliz zenbatu zen, parametro lehenetsiekin. Irakurketa kontaketa normalizatuak kalkulatu ziren eta geneen adierazpen diferentziala aztertu zen DESeq2 paketea (1.28.1 bertsioa) erabiliz R-n (4.0.3 bertsioa).
Ekdisona aldatzen duten gene hautagaiak identifikatu ziren lehenik A. gambiae genoma bilatuz PSI-BLAST algoritmoa erabiliz (https://ftp.ncbi.nlm.nih.gov/blast/executables/blast+/2.8.1/), parametroen balio lehenetsiak erabiliz, honako kontsulta-proteina-sekuentziak erabiliz: Bombyx mori-tik (Sarbide zk. NP_001038956.1), Musca domestica (Sarbide zk. XP_005182020.1, XP_005175332.1 eta XP_011294434.1) eta Microplitis demolitor-etik (Sarbide zk. XP_008552646.1 eta XP_008552645.1) EcK B. mori-tik (Sarbide zk. NP_001036900), Drosophila melanogaster (Sarbide zk. NP_651202), Apis mellifera (Sarbide zk. XP_394838) eta Acyrthosiphon pisum (Sarbide zk. XP_001947166); eta B. mori-ren EPP (Sarbide zk. XP_001947166) NP_001177919.1 eta NP_001243996.1) eta D. melanogaster-en EO (Sarbide zk. NP_572986.1) (1. urratsa). Ondoren, iragazi emaitzak Gambian ugalketa-ehunean (emeen LRT edo MAG) mRNA adierazpen handian (>100 zati/kilobase exon milioi irakurketa mapatu bakoitzeko (FPKM) edo >% 85) oinarrituta (2. urratsa). Espezifikotasuna hobetzeko, A. albimanus-en ugalketa-ehunean ere adierazten diren entzima hautagaiak hautatu genituen, hau da, estalketa-prozesuan ekdisona sintetizatzen edo transferitzen ez duen anofeles espezie bat. Gene hautagaiak A. albimanus-en ugalketa-ehunean adierazpen baxuan (<100 FPKM edo <85. pertzentila) iragazi ziren (3. urratsa). Azken iragazki gisa (4. urratsa), gene hautagaiek gutxienez honako hauetako bat bete behar dute: (1) estalketaren ondoren nabarmen gora erregulatuta egotea (P < 0,05) modu ezberdinean adierazitako geneen analisiaren arabera eta (2) ugalketa-ehun ez-ehunetan (< % 85 edo <100 FPKM).
Aurretik deskribatutako metodoak 28,29,30 aldatu genituen organismo osoaren isotopiaren etiketatzea lortzeko. Laburbilduz, Saccharomyces cerevisiae II motako (YSC2, Sigma) mota basatia legamiaren nitrogeno-basean (BD Difco, DF0335) probatu zen, % 2 glukosa (G7528, Sigma), % 1,7 aminoazido gabeko eta amonio sulfatoa (hazkuntza-ingurunea) eta % 5 15N amonio sulfatoa (NLM-713, >% 99, Cambridge Isotope Laboratories) nitrogeno-iturri bakar gisa zituena. Legamia zentrifugazio bidez berreskuratu zen eta eltxo-larbak ad libitum elikatu ziren pupatu arte. Arrain-irinarekin osatu (0,5 mg 300 larba bakoitzeko) laugarren izarreko hilkortasuna saihesteko. Ondoren, emeak bakarrik erabili ziren etiketatu gabeko arrekin egindako ugalketa-esperimentuetan, ugalketa-prozesuan transferitutako arraren proteoma aztertzeko.
4-6 eguneko 15N etiketadun eme birjinak adin bereko etiketarik gabeko ar birjinekin parekatzera behartu ziren. Parekatzea arrakastatsua egiaztatu zen epifluoreszentzia mikroskopia bidez parekatze-tapoiak detektatuz. 3, 12 eta 24 hpm-tan, 45-55 eme parekatuen aurikulak 50 µl amonio bikarbonato bufferrean (pH 7,8) disekzionatu eta pistoi batekin homogeneizatu ziren. Homogeneizatua zentrifugatu eta gainnatzailea % 0,1eko RapiGest-ekin (186001860, Waters) nahastu zen 50 mM amonio bikarbonatoan. Lagin bakoitzeko gainnatzailea eta pelleta izotz lehorrean izoztu eta gau osoan Washingtongo Unibertsitateko MacCoss laborategira bidali ziren, non LC-MS/MSrako lagina prestatzea amaitu zen. Berriro eseki pelleta % 0,1eko RapiGest-ekin 50 mM amonio bikarbonatoan eta ur-bainu batean sonikatu. Pelletaren eta gainjarioaren proteina-kontzentrazioa BCA analisi bidez neurtu zen, laginak 5 mM ditiotreitolarekin (DTT; Sigma) murriztu ziren, 15 mM iodoazetamidarekin (Sigma) alkilatu eta 37 °C-tan inkubatu ziren (1:0 50) ordubetez tripsinizazio: tripsina: substratu erlazioarekin). RapiGest 200 mM HCl gehituz lisatu zen, ondoren 37 °C-tan inkubatu zen 45 minutuz eta 14.000 rpm-tan zentrifugatu zen 10 minutuz 4 °C-tan hondakinak kentzeko. Laginak modu bikoitzeko fase solidoko erauzketa bidez garbitu ziren (Oasis MCX kartutxoak, Waters) eta % 0,1eko azido formikoan berriro eseki ziren 0,33 µg µl-1-ko proteina-kontzentrazio finala lortzeko. MAG proteomak markatu gabe aztertu ziren antzera ar birjinetatik. Bi errepikapen analitiko aztertu ziren lagin bakoitzerako. Ondoren, Bakoitzetik 1 µg aztertu zen 25 cm-ko silize urtuzko 75 μm-ko zutabe batekin, Jupiter C12 alderantzizko faseko erretxinarekin (Phenomenex) betetako 4 cm-ko silize urtuzko Kasil1 (PQ) frita-tranpa batekin eta 180 minutuko likido-kromatografia erabiliz. Laginen digerioak – MS/MS Q-Exactive HF masa-espektrometro batean (Thermo Fisher) exekutatu zen nanoACQUITY UPLC Sistema batekin (Waters). Exekuzio bakoitzerako sortutako datuekin lotutako eskuratze-datuak mzML formatura bihurtu ziren Proteowizard (3.0.20287 bertsioa) erabiliz eta Comet31 (3.2 bertsioa) erabiliz, Anopheles gambiae (VectorBase 54 bertsioa), Anopheles coluzzi-ren proteina-sekuentziak dituen FASTA datu-basearen aurka. Bilaketa bat egin zen Mali-NIH (VectorBase 54 bertsioa), Saccharomyces cerevisiae (Uniprot, 2021eko martxoa), A. gambiae RNA-seq eta gizakien kutsatzaile ezagunen hiru markoko itzulpenetan. Peptidoen maparekin bat datozen FDRak Percolator32 (3.05 bertsioa) erabiliz zehaztu ziren, 0,01eko atalasearekin, eta peptidoak proteinen identifikazioetan muntatu ziren Limelight33-n (2.2.0 bertsioa) proteinen parsimonia erabiliz. Proteina erlatiboa Ugaritasuna kalkulatzeko, proteina bakoitzerako kalkulatutako espektro-ugaritasun faktore normalizatua (NSAF) erabili zen, aurretik deskribatu bezala exekuzio bakoitzean. Proteina bakoitzarekiko NSAF bi erreplika biologiko ezberdinetako laginen batez bestekoa egin zen. 15N etiketak eme proteoma maskaratu zuen arrakastaz, nahiz eta etiketatutako birjinetatik etiketatu gabeko proteina kopuru txiki bat detektatu zitekeen. Emeen lagin gordinetan, ar proteina murrizketaren detekzioa (1-5 espektro) erregistratu genuen exekuzio teknikoetan bakarrik, non lagin gordinak ar/parekatze laginen ondoren exekutatu ziren, HPLC "carry over"-aren ondorioz. Etiketatutako birjinetatik "kutsatzaile" gisa aurkitutako proteinak noizbehinka 1. taula osagarrian zerrendatzen dira.
Bi peptido antigeniko, QTTDRVAPAPDQQQ (PA isotipoaren barruan) eta MESDGTTPSGDSEQ (PA eta PB isotipoaren barruan) Genscript-en. Bi peptidoak konbinatu, ondoren KLH garraiatzaile proteinarekin konjugatu eta Zeelanda Berriko untxiei injektatu zitzaizkien. Untxiak laugarren injekzioaren ondoren sakrifikatu ziren, eta IgG osoa afinitate-purifikazio bidez isolatu zen. EPP-rekiko espezifikoena zen untxiaren IgG erabili zen western blotting gehiago egiteko.
Western blot-etarako, MAG (n = 10, non n-k eltxo lagin biologikoki independenteen kopurua adierazten duen) eta eme LRT (n = 30) 4 eguneko ar birjinetatik eta eme birjinetatik edo indarrez parekatuetatik (parekatu ondoren <10) gehitu ziren bereizita. Proteina erauzketa bufferra (50 mM Tris, pH 8.0; % 1 NP-40; % 0.25 sodio desoxikolato; 150 mM NaCl; 1 mM EDTA; 1× proteasa inhibitzaileen koktela (Roche)) gehitu zen. Laginak disekzioaren ondoren berehala homogeneizatu ziren ale-makinarekin (2 mm-ko beirazko aleak, 2.400 rpm, 90 seg). Hondakin disolbaezinak 20.000 g-tan zentrifugatuz kendu ziren 4 °C-tan. Proteinak Bradford analisi bidez kuantifikatu ziren (Bio-Rad). Ondoren, 20 µg MAG proteina, 40 µg LRT proteina eta 20 µg proteina soberakin gehitu ziren. % 10eko Bis-Tris NuPAGE bidez desnaturalizatu eta bereizi ziren MOPS bufferra erabiliz. Proteinak polibinilideno fluorurozko mintzetara transferitu ziren iBlot2 transferentzia sistema erabiliz (Thermo Fisher). Mintzak bi aldiz garbitu ziren 1× PBS-T-tan (% 0,1 Tween-20 PBS-tan) eta ondoren Odyssey blokeatze bufferrean (Li-Cor) blokeatu ziren ordubetez 22 °C-tan. Mintzak gau osoan astindu ziren 4 °C-tan untxiaren aurkako EPP poliklonal primario antigorputz pertsonalizatuarekin (1:700 blokeatze bufferrean) eta arratoiaren aurkako aktina monoklonal primario MAC237 (Abeam; 1:4.000). Mintzak PBS-T-rekin garbitu eta ondoren bigarren mailako antigorputzekin inkubatu ziren (astoaren aurkako untxi 800CW eta ahuntzaren aurkako arratoi 680LT (Li-Cor), biak 1:20.000) % 0,01 SDS eta % 0,2 Tween-20 zituen blokeatze bufferrean ordubetez. ordubetez 22 °C-tan. Mintzak PBS-T-rekin garbitu eta Odyssey CLx eskaner batekin irudikatu ziren. Irudiak Image Studio-n bildu eta prozesatu ziren (5.2 bertsioa). EPP-RA isoformari (82 kDa) dagokion banda espezifikorik ez zen detektatu.
EPPren (AGAP002463-RB isoforma, histidina fosfatasa domeinua duena, NCBI domeinu kontserbatuaren bilaketa 34) eta EcK2ren (AGAP002181) kodetze eskualdeak pET-21a(+) plasmidoan (Novagen Millipore Sigma) klonatu ziren; Primerrak 2. Datu Hedatuen Taulan zerrendatzen dira. Zortzi GS4 lotura (tandemean) txertatu ziren pET-21a(+)-EcK2 eraikuntzaren C-terminal 6xHis etiketaren aurretik. Proteina birkonbinatuak NEBExpress zelula-gabeko E. coli proteinen sintesi erreakzioa erabiliz ekoitzi ziren (New England BioLabs). Proteina birkonbinatuak NEBExpress Ni spin zutabeak erabiliz purifikatu ziren (New England BioLabs). Dihidrofolato erreduktasa (DHFR) kontrol proteina NEBExpress Cell-Free E. coli Protein Synthesis Kit-eko DNA txantiloia erabiliz ekoitzi zen. Proteinak % 50eko glizeroletan gorde ziren PBS-n -20 °C-tan 3 hilabetez gehienez.
EPPren eta ehun-estraktuen fosfatasa-jarduera 4-nitrofenil fosfatoa (pNPP; Sigma-Aldrich) erabiliz neurtu zen. Erreakzio-bufferrak 25 mM Tris, 50 mM azido azetiko, 25 mM Bis-Tris, 150 mM NaCl, 0,1 mM EDTA eta 1 mM DTT zituen. Ehuna erreakzio-bufferrean homogeneizatu zen eta zelula-hondakinak zentrifugazio bidez kendu ziren. Erreakzioa hasi entzima edo ehun-estraktua 2,5 mg ml-1 pNPP duen erreakzio-bufferrean gehituz. Erreakzio-nahasketa giro-tenperaturan inkubatu zen iluntasunean, eta pNPPtik bihurtutako pNP kantitatea kuantifikatu zen 405 nm-tan hainbat unetan xurgapena neurtuz.
In vitro EcK jarduerarako, proteina 0,2 mg 20E edo 3D20E-rekin inkubatu zen 200 µl bufferrean (pH 7,5), 10 mM HEPES–NaOH, % 0,1 BSA, 2 mM ATP eta 10 mM MgCl2 zituena 2 orduz 27 °C-tan. Erreakzioa 800 µl metanol gehituz gelditu zen, ondoren -20 °C-tan hoztu zen ordubetez, eta ondoren 20.000 g-tan zentrifugatu zen 10 minutuz 4 °C-tan. Gainnatzailea HPLC-MS/MS bidez aztertu zen. Kontrol-taldean erabilitako proteinak bero-inaktibatzeko, proteinak % 50eko glizeroletan inkubatu ziren PBS-tan 20 minutuz 95 °C-tan.
In vitro EPP jarduerarako, proteina 3D20E22P-rekin inkubatu zen (18 MAG bikotetan aurkitutako kantitatearen baliokidea, HPLC-MS/MS bidez purifikatua) 100 µl bufferrean (pH 7.5), 25 mM Tris, 50 mM azido azetiko, 25 mM Bis-Tris, 150 mM NaCl, 0.1 mM EDTA eta 1 mM DTT zituena 3 orduz 27 °C-tan. Erreakzioa 400 µl metanol gehituz gelditu zen eta -20 °C-tan hoztu zen ordubetez, ondoren 20.000 g-tan zentrifugatu zen 10 minutuz 4 °C-tan. Gainnatzailea HPLC-MS/MS bidez aztertu zen.
EPP (362 bp), EcK1 (AGAP004574, 365 bp) eta EcK2 (556 bp) PCR zatiak sexu anitzeko bururik gabeko eltxoen gorpuetatik prestatutako cDNAtik anplifikatu ziren. eGFP kontrol-aren PCR zatia (495 bp) aurretik deskribatutako pCR2.1-eGFP-tik anplifikatu zen; PCR primerrak 2. Datu Hedatuen Taulan zerrendatzen dira. PCR zatia pL4440 plasmidoko T7 promotore alderantzikatuen artean txertatu zen. Plasmido eraikuntzak NEB 5-α konpetentea den E. coli-tik (New England Biolabs) berreskuratu eta DNA sekuentziazioaren bidez egiaztatu ziren erabili aurretik (ikus 1. Datu Osagarria txertatze sekuentziarako). T7 promotorearekin bat datozen primerrak (2. Datu Hedatuen Taula) erabili ziren pL4440-n oinarritutako plasmidotik txertatzea anplifikatzeko. PCR produktuaren tamaina agarosa gel elektroforesi bidez baieztatu zen. dsRNA PCR txantiloietatik transkribatu zen Megascript T7 Transkripzio Kit-a (Thermo Fisher) erabiliz eta fabrikatzailearen argibideen arabera purifikatu zen aurretik deskribatutako aldaketekin.
dsRNA injekziorako, 1.380 ng dsRNA (dsGFP, dsEcK1, dsEcK2, dsEPP) injektatu ziren 10 ng nl-1 kontzentrazioan ar edo eme helduen toraxean (Nanoject III, Drummond), eklosioaren ondorengo egun batean. Geneen beherakada mailak gutxienez hiru erreplika biologikotan zehaztu ziren RNA erauzketaren, cDNA sintesiaren eta RT-qPCR bidez. Ekdisona injekziorako, 4 eguneko edo 6 eguneko odolez elikatutako eme birjinei 0,13, 0,21 edo 0,63 µg 20E edo 3D20E (Nanoject III, Drummond) injektatu zitzaizkien, 1,3, 2,1 kontzentrazioetan, hurrenez hurren, diseinu esperimentalaren arabera, edo 6,3 ng nl-1. Injektatu 100 nl % 10eko (bol/bol) etanol uretan; 100 nl 3D20E22P % 10eko etanolean (MAG pare batean aurkitutako kantitatearen % 75aren baliokidea). Eltxoak ausaz esleitu ziren injekzio taldeari.
Errute-analisietarako, 3 eguneko emeak ad libitum gizakien odolez elikatu ziren. Kendu erdi elikatu gabeko edo elikatu gabeko eltxoak. Tratamenduaren arabera, emeak errute-kopa bereizietan jarri ziren lau gauz, odol-janaren ondorengo gutxienez 48 orduz. Arrautzak estereoskopio batekin zenbatu ziren (Stemi 508, Zeiss); eme parekatuen kasuan, larba bihurtu ziren arrautzak emankortzat hartu ziren.
Parekatze-probetarako, emeei gutxienez 2 egun eman zitzaizkien, parekatze-erresistentzia garatzeko tratamenduaren arabera, eta ondoren, adin bereko arrak basatiak kaiola berean sartu ziren. Bi gau geroago, eme ernaldutako besikulak disekzionatu ziren eta DNA genomikoa askatu zen izozte-desizozte eta sonikazioaren bidez, 10 mM Tris-HCl, 1 mM EDTA eta 25 mM NaCl (pH 8,2) zituen bufferrean. Laginak Proteinasa K-rekin (0,86 µg µl-1) inkubatu ziren 15 minutuz 55 °C-tan, eta ondoren 10 minutuz 95 °C-tan. DNA genomiko gordinaren prestakinak 10 aldiz diluitu ziren eta Y kromosoma sekuentzien qPCR detekziopean jarri ziren; primerrak 2. Datu Hedatuen Taulan zerrendatzen dira. Y kromosoma sekuentziaren faltak ez dagoela parekatzerik adierazten du.
Berriro parekatzeko saiakuntzak egiteko, indarrez parekatu ziren emeak aztertu ziren parekatze-tapoirik ote zuten ikusteko, parekatze-egoera berresteko, eta 2 egun utzi ziren arrik ezean parekatzearekiko erresistentzia garatzen, aurretik deskribatu bezala 36. DsRed esperma transgenikoa zeramaten arrak emeen kaioletan sartu ziren. Bi gau geroago, ernaltze-besikula emeetatik disekzionatu ziren, eta DNA genomikoa prestatu zen goian deskribatu bezala eta DsRed transgenearen qPCR detekzioari men egin zitzaion; primerrak 2. Datu Hedatuen Taulan zerrendatzen dira. DsRed transgenearen gabeziak adierazi zuen ez zela berriro parekatzerik gertatu.
3D20E aurretik deskribatu bezala sintetizatu zen 37. Laburbilduz, 10 mg 20E (Sigma-Aldrich) 10 ml uretan disolbatu ziren, eta ondoren 30 mg platino beltz gehitu ziren (hauts forman, Sigma-Aldrich). O2 korronte leun bat etengabe burbuilatu zen erreakzio-nahastean, eta giro-tenperaturan irabiatu zen. 6 ordu igaro ondoren, 30 mL metanol gehitu ziren erreakzioa geldiarazteko. Nahastea zentrifugatu zen katalizatzaile-partikulak kentzeko. Gainnatzailea lehortu egin zen hutsean giro-tenperaturan. Erreakzio-produktu lehortua % 10eko etanolean eta metanolean disolbatu zen HPLC-MS/MS analisietarako injekziorako. Bihurketa-tasa (20E-tik 3D20E-ra) % 97 ingurukoa izan zen (4b irudia), eta sintetizatutako 3D20E-ren MS espektroa eme parekatuetan aurkitutakoarekin bat etorri zen (4c irudia).
Legendak egindako estatistika-probak zehazten ditu. GraphPad (9.0 bertsioa) erabili zen Fisherren proba zehatza, Mantel-Cox testa eta Student-en t-testa egiteko. Cochran-Mantel-Haenszel probak R script pertsonalizatu bat erabiliz egin ziren (https://github.com/duopeng/mantelhaen.test helbidean eskuragarri). Datuen banaketaren normaltasuna Shapiro-Wilk testa erabiliz probatu zen, 0,05eko esangura-atalasearekin. Datuek normaltasun-proba gainditzen ez zutenean, Mann-Whitney testa egin zen. Biziraupen-datuak Mantel-Cox testa erabiliz aztertu ziren. DESeq2 paketea (1.28.1 bertsioa) erabili zen RNA-seq gene-mailako espresio diferentzialaren analisia egiteko. Grafikoko barra horizontalak mediana adierazten du. P = 0,05eko esangura-balioa erabili zen proba guztien atalase gisa.
Ikerketaren diseinuari buruzko informazio gehiago lortzeko, ikus artikulu honekin lotutako Nature Research Report laburpena.
MS proteomikoen datuak ProteomeXchange Consortium-en (http://proteomecentral.proteomexchange.org) sartu ziren PRIDE Partner Repository-ren (https://www.ebi.ac.uk/pride/) bidez, PXD032157 datu-multzoaren identifikatzailearekin.
RNA-seq datu-multzoa Gene Expression Comprehensive Library-n (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/) gordailatu da, GSE198665 serie-erregistroaren pean.
Uneko ikerketan zehar sortutako eta/edo aztertutako datu-multzo gehigarriak dagokien egileengandik lor daitezke arrazoizko eskaera eginez gero. Artikulu honek jatorrizko datuak ematen ditu.
De Loof, A. Ekdisteroideak: Intsektuen sexu-esteroideak ahaztuta? Gizonezkoa: Black Box. Insect Science. 13, 325–338 (2006).
Redfern, CPF 20-hidroxiekdisona eta obulutegien garapena Anopheles stephens-en.J. Insect Physiology.28, 97–109 (1982).