Azido propionikoak (PPA), onddoen aurkako agente eta ohiko gehigarri dietetikoa, neurogarapen anormala eragiten duela frogatu da saguetan, digestio-aparatuaren disfuntzioarekin batera, eta hori hesteetako disbiosiak eragin dezake. PPA dietetikoaren esposizioaren eta hesteetako mikrobiotaren disbiosiaren arteko lotura iradoki da, baina ez da zuzenean ikertu. Hemen, hesteetako mikrobiotaren konposizioan PPArekin lotutako aldaketak ikertu ditugu, disbiosia eragin dezaketenak. Tratatu gabeko dieta bat (n=9) eta PPAz aberastutako dieta bat (n=13) elikatu diren saguen hesteetako mikrobiomak sekuentziatu ziren sekuentziazio metagenomikoa erabiliz, mikrobioen konposizioan eta bakterioen bide metabolikoetan dauden desberdintasunak ebaluatzeko. PPA dietetikoa taxon esanguratsuen ugaritasunaren igoerarekin lotuta zegoen, besteak beste, hainbat Bacteroides, Prevotella eta Ruminococcus espezie, eta horien kideak lehenago PPA ekoizpenean inplikatu izan dira. PPAren eraginpean egon diren saguen mikrobiomek lipidoen metabolismoarekin eta hormona esteroideen biosintesiarekin lotutako bide gehiago ere bazituzten. Gure emaitzek adierazten dute PPAk hesteetako mikrobiota eta harekin lotutako bide metabolikoak alda ditzakeela. Behaketa hauek nabarmentzen dute kontsumorako segurutzat sailkatutako kontserbagarriek hesteetako mikrobiotaren osaeran eta, ondorioz, gizakien osasunean eragina izan dezaketela.
Giza mikrobioma askotan "gorputzeko azken organoa" bezala aipatzen da eta funtsezko zeregina du gizakien osasunean (Baquero eta Nombela, 2012). Bereziki, hesteetako mikrobioma sistema osoan duen eraginagatik eta funtsezko funtzio askotan duen zereginagatik aitortzen da. Bakterio komentsalak ugariak dira hesteetan, hainbat nitxo ekologiko okupatzen dituzte, mantenugaiak erabiltzen dituzte eta patogeno potentzialekin lehiatzen dira (Jandhyala et al., 2015). Hesteetako mikrobiotaren hainbat osagai bakterianok gai dira funtsezko mantenugaiak ekoizteko, hala nola bitaminak, eta digestioa sustatzeko (Rowland et al., 2018). Bakterioen metabolitoek ehunen garapenean eragina dutela eta bide metaboliko eta immunologikoak hobetzen dituztela ere frogatu da (Heijtz et al., 2011; Yu et al., 2022). Giza hesteetako mikrobiomaren osaera oso anitza da eta faktore genetiko eta ingurumenekoen araberakoa da, hala nola dieta, sexua, botikak eta osasun egoera (Kumbhare et al., 2019).
Amaren dieta fetuaren eta jaioberriaren garapenaren osagai kritikoa da, eta garapenean eragina izan dezaketen konposatuen iturri ustezkoa (Bazer et al., 2004; Innis, 2014). Intereseko konposatu horietako bat azido propionikoa (PPA) da, hartzidura bakterianotik lortutako kate laburreko gantz-azido azpiproduktu bat eta elikagaien gehigarri bat (den Besten et al., 2013). PPAk propietate antibakterianoak eta antifungikoak ditu, eta, beraz, elikagaien kontserbagarri gisa eta aplikazio industrialetan erabiltzen da lizunaren eta bakterioen hazkundea inhibitzeko (Wemmenhove et al., 2016). PPAk efektu desberdinak ditu ehun desberdinetan. Gibelean, PPAk efektu antiinflamatorioak ditu, makrofagoetan zitokinen adierazpena eraginez (Kawasoe et al., 2022). Efektu erregulatzaile hau beste zelula immune batzuetan ere ikusi da, hanturaren beherakada eraginez (Haase et al., 2021). Hala ere, kontrako efektua ikusi da garunean. Aurreko ikerketek erakutsi dute PPAren eraginpean egoteak autismoaren antzeko portaera eragiten duela saguetan (El-Ansary et al., 2012). Beste ikerketa batzuek erakutsi dute PPAk gliosia eragin dezakeela eta garuneko hantura-probideak aktibatu ditzakeela (Abdelli et al., 2019). PPA azido ahula denez, hesteetako epiteliotik zehar hedatu daiteke odolera eta, beraz, odol-garuneko hesia eta plazenta bezalako muga-hesiak zeharkatu ditzake (Stinson et al., 2019), eta horrek PPAren garrantzia azpimarratzen du bakterioek sortutako metabolito erregulatzaile gisa. PPAk autismoaren arrisku-faktore gisa duen eginkizun potentziala ikertzen ari den arren, autismoa duten pertsonengan dituen efektuak neurona-bereizketa eragitetik haratago heda daitezke.
Beherakoa eta idorreria bezalako digestio-aparatuaren sintomak ohikoak dira garapen neurologikoaren nahasmenduak dituzten pazienteengan (Cao et al., 2021). Aurreko ikerketek erakutsi dute autismoaren espektroaren nahasmenduak (AEN) dituzten pazienteen mikrobioma pertsona osasuntsuena ez dela berdina, eta horrek hesteetako mikrobiotaren disbiosia iradokitzen du (Finegold et al., 2010). Era berean, hesteetako hanturazko gaixotasunak, obesitatea, Alzheimer gaixotasuna eta abar dituzten pazienteen mikrobiomaren ezaugarriak ere pertsona osasuntsuenak ez direnak dira (Turnbaugh et al., 2009; Vogt et al., 2017; Henke et al., 2019). Hala ere, gaur egun arte, ez da kausa-harremanik ezarri hesteetako mikrobiomaren eta gaixotasun edo sintomen artean (Yap et al., 2021), nahiz eta uste den hainbat bakterio-espeziek zeresana dutela gaixotasun-egoera horietako batzuetan. Adibidez, Akkermansia, Bacteroides, Clostridium, Lactobacillus, Desulfovibrio eta beste genero batzuk ugariagoak dira autismoa duten pazienteen mikrobiotan (Tomova et al., 2015; Golubeva et al., 2017; Cristiano et al., 2018; Zurita et al., 2020). Aipagarria da genero horietako batzuen espezieek PPA ekoizpenarekin lotutako geneak dituztela ezagutzen dela (Reichardt et al., 2014; Yun eta Lee, 2016; Zhang et al., 2019; Baur eta Dürre, 2023). PPAren propietate antimikrobianoak kontuan hartuta, haren ugaritasuna handitzea onuragarria izan daiteke PPA ekoizten duten bakterioen hazkuntzarako (Jacobson et al., 2018). Beraz, PFAz aberatsa den ingurune batek hesteetako mikrobiotan aldaketak eragin ditzake, digestio-aparatoak barne, eta horiek digestio-aparatoen sintomak sor ditzakete.
Mikrobiomaren ikerketan galdera zentral bat da ea mikrobioen konposizioan dauden desberdintasunak azpiko gaixotasunen kausa edo sintoma diren. Dietaren, hesteetako mikrobiomaren eta gaixotasun neurologikoen arteko harreman konplexua argitzeko lehen urratsa dietak mikrobioen konposizioan dituen efektuak ebaluatzea da. Horretarako, irakurketa luzeko metagenomia sekuentziazioa erabili genuen PPA ugariko edo PPA gutxiko dieta bat elikatu zitzaien saguen ondorengoen hesteetako mikrobiomak alderatzeko. Ondorengoei amen dieta bera eman zitzaien. Hipotesia egin genuen PPA ugariko dieta batek hesteetako mikrobioen konposizioan eta mikrobioen funtzio-bideetan aldaketak eragingo zituela, batez ere PPA metabolismoarekin eta/edo PPA ekoizpenarekin lotutakoetan.
Ikerketa honek FVB/N-Tg(GFAP-GFP)14Mes/J sagu transgenikoak erabili zituen (Jackson Laboratories), proteina fluoreszente berdea (GFP) gehiegi adierazten dutenak, glia-espezifiko GFAP sustatzailearen kontrolpean, Erdialdeko Floridako Unibertsitateko Animalien Zainketa eta Erabilera Batzordearen (UCF-IACUC) jarraibideei jarraituz (Animalien Erabilera Baimen Zenbakia: PROTO202000002). Titia kendu ondoren, saguak banan-banan kaioletan sartu ziren, sexu bakoitzeko 1-5 sagu kaiola bakoitzeko. Saguak ad libitum elikatu ziren, kontrol-dieta purifikatu batekin (dieta estandar ireki aldatua, % 16 kcal gantz) edo sodio propionatoz osaturiko dieta batekin (dieta estandar ireki aldatua, % 16 kcal gantz, 5.000 ppm sodio propionato duena). Erabilitako sodio propionato kantitatea 5.000 mg PFA/kg janari-pisu osoaren baliokidea izan zen. Hau da elikagaien kontserbagarri gisa erabiltzeko onartutako PPA kontzentrazio handiena. Ikerketa hau prestatzeko, guraso-saguei bi dietak eman zitzaizkien estalketa baino 4 aste lehenago, eta amaren haurdunaldi osoan zehar jarraitu zuten. Kume-saguak [22 sagu, 9 kontrol (6 ar, 3 eme) eta 13 PPA (4 ar, 9 eme)] titia kendu eta amekin egindako dieta bera jarraitu zuten 5 hilabetez. Kume-saguak 5 hilabeterekin sakrifikatu ziren eta haien hesteetako gorotz-edukia bildu eta hasieran 1,5 ml-ko mikrozentrifugazio-hodietan gorde zen -20 °C-tan, eta ondoren -80 °C-ko izozkailu batera eraman ziren ostalariaren DNA agortu eta azido nukleiko mikrobianoak erauzi arte.
Ostalariaren DNA protokolo aldatu baten arabera kendu zen (Charalampous et al., 2019). Laburbilduz, gorotz-edukia 500 µl InhibitEX-era (Qiagen, Cat#/ID: 19593) eraman eta izoztuta gorde zen. Gehienez 1-2 gorotz-pellet prozesatu erauzketa bakoitzeko. Ondoren, gorotz-edukia mekanikoki homogeneizatu zen hodiaren barruan plastikozko pistoi bat erabiliz, nahasketa bat osatzeko. Zentrifugatu laginak 10.000 RCF-tan 5 minutuz edo laginak pelletatu arte, ondoren aspiratu gainnadantea eta berriro eseki pelleta 250 µl 1× PBS-tan. Gehitu 250 µl % 4,4ko saponina disoluzioa (TCI, produktu zenbakia S0019) laginari detergente gisa, zelula eukariotoen mintzak askatzeko. Laginak astiro nahastu ziren leun egon arte eta giro-tenperaturan inkubatu ziren 10 minutuz. Ondoren, zelula eukariotoak apurtzeko, 350 μl nukleasa gabeko ur gehitu zitzaion laginari, 30 segundoz inkubatu zen, eta ondoren 12 μl 5 M NaCl gehitu ziren. Ondoren, laginak 6000 RCF-tan zentrifugatu ziren 5 minutuz. Gainnatzailea aspiratu eta pelleta berriro eseki 100 μl 1X PBS-tan. Ostalariaren DNA kentzeko, gehitu 100 μl HL-SAN bufferrean (12,8568 g NaCl, 4 ml 1M MgCl2, 36 ml nukleasa gabeko ur) eta 10 μl HL-SAN entziman (ArticZymes P/N 70910-202). Laginak ondo nahastu ziren pipeteatuz eta 37 °C-tan inkubatu ziren 30 minutuz 800 rpm-tan Eppendorf™ ThermoMixer C batean. Inkubazioaren ondoren, 6000 RCF-tan zentrifugatu ziren 3 minutuz eta bi aldiz garbitu ziren 800 µl eta 1000 µl 1X PBS-rekin. Azkenik, pelleta berriro eseki zen 100 µl 1X PBS-tan.
Bakterioen DNA osoa New England Biolabs Monarch Genomic DNA Purification Kit (New England Biolabs, Ipswich, MA, Cat# T3010L) erabiliz isolatu zen. Kitarekin batera ematen den funtzionamendu-prozedura estandarra apur bat aldatu da. Inkubatu eta mantendu nukleasarik gabeko ura 60 °C-tan eragiketa egin aurretik, azken eluziorako. Gehitu 10 µl Proteinasa K eta 3 µl RNasa A lagin bakoitzari. Ondoren, gehitu 100 µl Zelulen Lisis Bufferra eta nahastu astiro. Ondoren, laginak Eppendorf™ ThermoMixer C batean inkubatu ziren 56 °C-tan eta 1400 rpm-tan gutxienez ordubetez eta gehienez 3 orduz. Inkubatutako laginak 12.000 RCF-tan zentrifugatu ziren 3 minutuz eta lagin bakoitzeko gainnadantea 1,5 mL-ko mikrozentrifugazio-hodi bereizi batera eraman zen, 400 µL lotura-soluziorekin. Ondoren, hodiak pultsu-zurrunbiloan irabiatu ziren 5-10 segundoz, segundo 1eko tarteetan. Lagin bakoitzaren likido edukia osoa (gutxi gorabehera 600-700 µL) bilketa-hodi batean jarritako iragazki-kartutxo batera transferitu. Hodiak 1.000 RCF-tan zentrifugatu ziren 3 minutuz hasierako DNAren lotura ahalbidetzeko eta ondoren 12.000 RCF-tan zentrifugatu ziren minutuz hondar likidoa kentzeko. Lagin-zutabea bilketa-hodi berri batera transferitu zen eta gero bi aldiz garbitu zen. Lehenengo garbiketarako, gehitu 500 µL garbiketa-bufferreko hodi bakoitzari. Irauli hodia 3-5 aldiz eta gero zentrifugatu 12.000 RCF-tan minutuz. Bota likidoa bilketa-hoditik eta jarri iragazki-kartutxoa berriro bilketa-hodi berean. Bigarren garbiketarako, gehitu 500 µL garbiketa-bufferreko iragazkira, irauli gabe. Laginak 12.000 RCF-tan zentrifugatu ziren minutuz. Iragazkia 1,5 mL-ko LoBind® hodi batera eraman eta 100 µL aurrez berotutako nukleasa gabeko ur gehitu. Iragazkiak giro-tenperaturan inkubatu ziren minutuz eta ondoren 12.000 RCF-tan zentrifugatu ziren minutuz. Elututako DNA -80 °C-tan gorde zen.
DNAren kontzentrazioa Qubit™ 4.0 Fluorometro bat erabiliz kuantifikatu zen. DNA Qubit™ 1X dsDNA High Sensitivity Kit (Kat. zk. Q33231) erabiliz prestatu zen, fabrikatzailearen argibideen arabera. DNA zatien luzeraren banaketa Aglient™ 4150 edo 4200 TapeStation bat erabiliz neurtu zen. DNA Agilent™ Genomic DNA Reagents (Kat. zk. 5067-5366) eta Genomic DNA ScreenTape (Kat. zk. 5067-5365) erabiliz prestatu zen. Liburutegiaren prestaketa Oxford Nanopore Technologies™ (ONT) Rapid PCR Barcoding Kit (SQK-RPB004) erabiliz egin zen, fabrikatzailearen argibideen arabera. DNA sekuentziatzeko, ONT GridION™ Mk1 sekuentziadore bat erabili zen, Min106D fluxu-zelula batekin (R 9.4.1). Sekuentziazio-ezarpenak hauek izan ziren: zehaztasun handiko base-deia, gutxieneko q balioa 9, barra-kodearen konfigurazioa eta barra-kodearen mozketa. Laginak 72 orduz sekuentziatu ziren, eta ondoren oinarri-deien datuak bidali ziren prozesatu eta aztertzeko.
Bioinformatika prozesamendua aurretik deskribatutako metodoak erabiliz egin zen (Greenman et al., 2024). Sekuentziaziotik lortutako FASTQ fitxategiak lagin bakoitzerako direktorioetan banatu ziren. Bioinformatika analisia egin aurretik, datuak honako hodi hau erabiliz prozesatu ziren: lehenik, laginen FASTQ fitxategiak FASTQ fitxategi bakar batean batu ziren. Ondoren, 1000 bp baino laburragoak ziren irakurketak Filtlong v. 0.2.1 erabiliz iragazi ziren, aldatutako parametro bakarra –min_length 1000 izanik (Wick, 2024). Iragazki gehiago egin aurretik, irakurketaren kalitatea NanoPlot v. 1.41.3 erabiliz kontrolatu zen, honako parametro hauekin: –fastq –plots dot –N50 -o(De Coster eta Rademakers, 2023). Irakurketak GRCm39 saguaren erreferentziazko genomarekin (GCF_000001635.27) lerrokatu ziren minimap2 v. 2.24-r1122 erabiliz, ostalariak kutsatutako irakurketak kentzeko parametro hauekin: -L -ax map-ont(Lee, 2018). Sortutako lerrokatze-fitxategiak BAM formatura bihurtu ziren samtools view -b (Danecek et al., 2021) erabiliz samtools v. 1.16.1-en. Irakurketa lerrokatu gabeak identifikatu ziren samtools view -b -f 4 erabiliz, eta horrek adierazten du irakurketa horiek ez zirela ostalariaren genomarenak. Irakurketa lerrokatu gabeak FASTQ formatura bihurtu ziren berriro samtools bam2fq erabiliz, lehenetsitako parametroekin. NanoPlot berriro exekutatu zen iragazitako irakurketa gehiagorekin, aurretik deskribatutako ezarpenak erabiliz. Iragazi ondoren, metagenomiko datuak bildu ziren metaflye v. 2.8.2-b1689 erabiliz, parametro hauekin: –nano-raw–meta (Kolmogorov et al., 2020). Utzi gainerako parametroak beren balio lehenetsietan. Muntaketaren ondoren, iragazitako irakurketak muntaketara mapatu ziren minimap2 erabiliz, eta -ax map-ont parametroa erabili zen SAM formatuan lerrokatze fitxategi bat sortzeko. Muntaketa lehenik racon v. 1.4.20 erabiliz findu zen parametro hauekin: -m 8 -x -6 -g -8 -w 500 -u (Vaser et al., 2017). Racon amaitu ondoren, medaka v. 1.7.2-rekin findu zen gehiago, medaka_consesus erabiliz, -m parametroa izan ezik parametro guztiak beren balio lehenetsietan utziz. -m parametroa r941_min_hac_g507-ra ezarrita dago gure datuetarako erabilitako fluxu-zelulen kimika eta zehaztasun handiko oinarri-deiak zehazteko (nanoporetech/medaka, 2024). Iragazitako datuak (aurrerantzean datu mikrobianoak) eta azken muntaketa garbitua erabili ziren ondorengo analisietarako.
Sailkapen taxonomikorako, irakurketak eta muntatutako kontigak Kraken2 v. 2.1.2 erabiliz sailkatu ziren (Wood et al., 2019). Sortu txostenak eta irteera fitxategiak irakurketa eta muntaketaetarako, hurrenez hurren. Erabili –use-names aukera irakurketak eta muntaketak aztertzeko. –gzip-compressed eta –paired aukerak zehaztu dira irakurketa segmentuetarako. Taxonen ugaritasun erlatiboa metagenometan Bracken v. 2.8 erabiliz kalkulatu zen (Lu et al., 2017). Lehenik eta behin, 1000 base dituen kmer datu-base bat sortu genuen bracken-build erabiliz, parametro hauekin: -d-k 35 -l 1000 Behin eraikita, bracken kraken2-k sortutako txostenean oinarrituta exekutatzen da eta datuak aukera hauek erabiliz iragazten ditu: -d -I -O-p 1000 -l

Horien artean, P, G edo S hautatzen da aztertutako sailkapen mailaren arabera. Sailkapen faltsu positiboen eragina minimizatzeko, 1e-4ko (1/10.000 irakurketa) gutxieneko ugaritasun erlatiboko atalasea hartu zen. Analisi estatistikoa egin aurretik, Brackenek jakinarazitako ugaritasun erlatiboak (fraction_total_reads) log-erlazio zentratuaren (CLR) eraldaketa erabiliz eraldatu ziren (Aitchison, 1982). CLR metodoa aukeratu zen datuen eraldaketarako, eskala-aldaezina delako eta datu-multzo ez-sakaientzat nahikoa delako (Gloor et al., 2017). CLR eraldaketak logaritmo naturala erabiltzen du. Brackenek jakinarazitako zenbaketa-datuak log-adierazpen erlatiboaren (RLE) bidez normalizatu ziren (Anders eta Huber, 2010). Zifrak matplotlib v. 3.7.1, seaborn v. 3.7.2 eta logaritmo sekuentzialen (Gloor et al., 2017) konbinazio bat erabiliz sortu ziren. 0.12.2 eta stantanotations v. 0.5.0 (Hunter, 2007; Waskom, 2021; Charlier et al., 2022). Bacillus/Bacteroidetes ratioa lagin bakoitzerako kalkulatu zen bakterioen kontaketa normalizatuak erabiliz. Tauletan agertzen diren balioak 4 hamartarretara biribilduta daude. Simpson dibertsitate indizea KrakenTools v. 1.2 paketean (Lu et al., 2022) emandako alpha_diversity.py script-a erabiliz kalkulatu zen. Bracken txostena script-ean ematen da eta Simpson indizea "Si" -an parametrorako ematen da. Ugaritasunean dauden desberdintasun esanguratsuak CLR diferentzia ≥ 1 edo ≤ -1 gisa definitu ziren. ±1eko CLR diferentzia batek lagin mota baten ugaritasunaren 2,7 aldizko igoera adierazten du. Zeinuak (+/-) adierazten du taxoia ugariagoa den PPA laginean eta kontrol laginean, hurrenez hurren. Garrantzitsutasuna Mann-Whitney U testa (Virtanen et al., 2020) erabiliz zehaztu zen. Statsmodels v. 0.14 (Benjamini eta Hochberg, 1995; Seabold eta Perktold, 2010) erabili zen, eta Benjamini-Hochberg prozedura aplikatu zen proba anitzak zuzentzeko. p-balio doitua ≤ 0.05 erabili zen esanguratsutasun estatistikoa zehazteko atalase gisa.
Geneen anotazioa eta ugaritasun erlatiboaren estimazioa Maranga et al.-ek deskribatutako protokoloaren bertsio aldatu bat erabiliz egin ziren (Maranga et al., 2023). Lehenik eta behin, 500 bp baino laburragoak ziren kontigak multzo guztietatik kendu ziren SeqKit v. 2.5.1 erabiliz (Shen et al., 2016). Hautatutako multzoak pan-metagenoma batean konbinatu ziren. Irakurketa-marko irekiak (ORF) Prodigal v. 1.0.1 erabiliz identifikatu ziren (Prodigal v. 2.6.3-ren bertsio paraleloa) parametro hauekin: -d-f gff-i -O-T 24 -p meta -C 10000 (Hyett et al., 2012; Jaenicke, 2024). Ondoren, lortutako nukleotido fitxategiak Python erabiliz iragazi ziren gene osatugabe guztiak kentzeko. Ondoren, CD-HIT v. 4.8.1 erabili zen geneak parametro hauekin multzokatzeko: cd-hit-est -i -O-c 0.95 -s 0.85 -aS 0.9 -n 10 -d 256 -M 350000 -T 24 -l 100 -g 1 (Fu et al., 2012). Sortutako gene-katalogo ez-erredundantea erabili zen geneen ugaritasuna eta anotazioa kalkulatzeko. Geneen ugaritasun erlatiboa KMA v. 1.4.9 erabiliz kalkulatu zen (Clausen et al., 2018). Lehenik eta behin, sortu indize-fitxategi bat KMA indizea erabiliz, parametro hauekin: -i -OOndoren, Bioinformatika Hodiaren atalean deskribatutako lagin bakoitzerako irakurketa mikrobianoekin batera sortutako indizea erabiliz, KMA parametro hauekin exekutatu zen: -i -O-t_db-bcNano -bc 0.7 -ef -t 24. Ondoren, geneen kopurua CLR erabiliz normalizatu zen, eta Sci-kit learn-en osagai nagusien analisi (PCA) klasea erabili zen (Pedregosa et al., 2011). Aurreikusitako geneen anotazioa gene ez-erredundanteen katalogoan egin zen, eggNOG v. 2.1.12-ren emapper.py script-a eta eggNOG datu-basearen 5.0.2 bertsioa erabiliz, parametro hauekin: –itype CDS –cpu 24 -i– Datuen katalogoa–go_evident Irteera ez-elektronikoa– Irteerako direktorioa–helburu_ortologo guztiak –hazi_ortologo_balioa 0.001 –hazi_ortologo_puntuazioa 60 –kontsulta_azala 20 –gai_azala 0 –itzultzea –gainidaztea –tenporal_dir(Cantalapiedra et al., 2021). KMA emaitzak aztertu ziren txantiloi-estaldura eta txantiloi-identitate nahikoa (≥ % 90) eta ugaritasuna (sakonera ≥ 3) zuten geneak hautatzeko. KMA sakoneraren emaitzak CLR erabiliz eraldatu ziren, goian deskribatutako moduan. Ondoren, KMA emaitzak anotazio funtzionalaren eta sailkapenaren emaitzetako kontig IDekin alderatu ziren, gene bakoitzerako kontig iturria erabiliz. Taxonekin gertatzen den bezala, geneen ugaritasunean dauden desberdintasun esanguratsuak CLR diferentzia ≥ 1 edo ≤ -1 batez bestekoa zuten gene gisa definitu ziren, (+/-) zeinu batek adierazten zuelarik genea ugariagoa zela PPA edo kontrol laginetan, hurrenez hurren.
Geneak lehenik eta behin, eggNOG-ek esleitutako Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes (KEGG) ortologo (KO) identifikatzaileen arabera multzokatu ziren, gene-bideen ugaritasunak alderatzeko. Knockout gabeko geneak edo knockout anitz dituzten geneak kendu ziren analisia egin aurretik. Ondoren, lagin bakoitzeko KO bakoitzaren batez besteko ugaritasuna kalkulatu zen eta analisi estatistikoa egin zen. PPA metabolismoaren geneak KEGG_Pathway zutabean ko00640 errenkada bat esleituta zuen edozein gene bezala definitu ziren, KEGG-ren arabera propionatoaren metabolismoan duten zeregina adieraziz. PPA ekoizpenarekin lotutako geneak 1. taula osagarrian zerrendatzen dira (Reichardt et al., 2014; Yang et al., 2017). Permutazio probak egin ziren lagin mota bakoitzean nabarmen ugariagoak ziren PPA metabolismo eta ekoizpen geneak identifikatzeko. Mila permutazio egin ziren aztertutako gene bakoitzeko. 0,05eko p-balioa erabili zen muga gisa esangura estatistikoa zehazteko. Funtzio-anotazioak esleitu zitzaizkien kluster bateko gene indibidualei, klusterreko gene adierazgarrien anotazioetan oinarrituta. PPA metabolismoarekin eta/edo PPA ekoizpenarekin lotutako taxonak identifikatu ahal izan ziren Kraken2 irteera fitxategietako kontig IDak eggNOG erabiliz anotazio funtzionalean zehar mantendutako kontig ID berberekin parekatuz. Garrantzi-probak aurretik deskribatutako Mann-Whitney U testa erabiliz egin ziren. Proba anitzen zuzenketa Benjamini-Hochberg prozedura erabiliz egin zen. ≤ 0,05eko p-balioa erabili zen euskarri gisa esangura estatistikoa zehazteko.
Saguen hesteetako mikrobiomaren dibertsitatea Simpson dibertsitate indizea erabiliz ebaluatu zen. Ez zen desberdintasun esanguratsurik ikusi kontrol eta PPA laginen artean genero eta espezie dibertsitateari dagokionez (p-balioa generorako: 0,18, p-balioa espezieetarako: 0,16) (1. irudia). Ondoren, konposizio mikrobianoa osagai nagusien analisia (PCA) erabiliz alderatu zen. 2. irudiak laginen multzokatzea erakusten du beren filumen arabera, eta horrek adierazten du mikrobiomen espezieen konposizioan desberdintasunak zeudela PPA eta kontrol laginen artean. Multzokatzea hau ez zen hain nabarmena izan genero mailan, eta horrek iradokitzen du PPAk bakterio batzuei eragiten diela (1. irudi osagarria).
1. irudia. Saguaren hesteetako mikrobiomaren generoen alfa dibertsitatea eta espezieen osaera. PPA eta kontrol laginetan generoen (A) eta espezieen (B) Simpson dibertsitate indizeak erakusten dituzten kaxa-diagramak. Garrantzitsutasuna Mann-Whitney U testa erabiliz zehaztu zen, eta zuzenketa anizkoitza Benjamini-Hochberg prozedura erabiliz egin zen. ns, p-balioa ez zen esanguratsua izan (p>0,05).
2. irudia. Saguaren hesteetako mikrobiomaren osaeraren osagai nagusien analisiaren emaitzak espezie mailan. Osagai nagusien analisi grafikoak laginen banaketa erakusten du lehen bi osagai nagusietan zehar. Koloreek lagin mota adierazten dute: PPArekin esposizioa duten saguak moreak dira eta kontrol saguak horiak. 1 eta 2 osagai nagusiak x ardatzean eta y ardatzean irudikatzen dira, hurrenez hurren, eta azaldutako bariantza-erlazio gisa adierazten dira.
RLE eraldatutako zenbaketa-datuak erabiliz, Bakteroidetes/Bacilli ratioaren medianaren jaitsiera nabarmena ikusi zen kontrol-saguetan eta PPA saguetan (kontrola: 9,66, PPA: 3,02; p-balioa = 0,0011). Desberdintasun hau Bakteroidetesen ugaritasun handiagoaren ondoriozkoa izan zen PPA saguetan kontrol-saguekin alderatuta, nahiz eta aldea ez zen esanguratsua izan (kontrol-batez besteko CLR: 5,51, PPA batez besteko CLR: 6,62; p-balioa = 0,054), Bakteroidetesen ugaritasuna antzekoa izan zen bitartean (kontrol-batez besteko CLR: 7,76, PPA batez besteko CLR: 7,60; p-balioa = 0,18).
Heste-mikrobiomaren kide taxonomikoen ugaritasunaren analisiak agerian utzi zuen filum 1 eta 77 espezie nabarmen desberdinak zirela PPA eta kontrol laginen artean (2. taula osagarria). PPA laginetan 59 espezieren ugaritasuna kontrol laginetan baino nabarmen handiagoa izan zen, eta kontrol laginetan 16 espezieren ugaritasuna PPA laginetan baino handiagoa izan zen (3. irudia).
3. irudia. Taxonen ugaritasun diferentziala PPA eta kontrol saguen heste-mikrobioman. Sumendi-diagramek generoen (A) edo espezieen (B) ugaritasunean dauden desberdintasunak erakusten dituzte PPA eta kontrol laginen artean. Puntu grisek taxonen ugaritasunean ez dagoela desberdintasun esanguratsurik adierazten dute. Koloretako puntuek ugaritasunean dauden desberdintasun esanguratsuak adierazten dituzte (p-balioa ≤ 0,05). Lagin moten artean ugaritasunean dauden desberdintasun handienak dituzten 20 taxon nagusiak gorriz eta urdin argiz ageri dira (kontrol eta PPA laginak), hurrenez hurren. Puntu hori eta moreak gutxienez 2,7 aldiz ugariagoak ziren kontrol edo PPA laginetan kontroletan baino. Puntu beltzek ugaritasun nabarmen desberdinak dituzten taxonak adierazten dituzte, -1 eta 1 arteko CLR batez besteko desberdintasunekin. P balioak Mann-Whitney U testa erabiliz kalkulatu ziren eta Benjamini-Hochberg prozedura erabiliz zuzendu ziren proba anitzekoetarako. CLR batez besteko desberdintasun lodiek ugaritasunean dauden desberdintasun esanguratsuak adierazten dituzte.
Hesteetako mikrobioen konposizioa aztertu ondoren, mikrobiomaren anotazio funtzionala egin genuen. Kalitate baxuko geneak iragazi ondoren, guztira 378.355 gene bakar identifikatu ziren lagin guztietan. Gene horien ugaritasun eraldatua erabili zen osagai nagusien analisirako (PCA), eta emaitzek lagin moten multzokatze maila altua erakutsi zuten haien profil funtzionalen arabera (4. irudia).
4. irudia. PCAren emaitzak saguaren hesteetako mikrobiomaren funtzionalitate-profila erabiliz. PCA grafikoak laginen banaketa erakusten du lehen bi osagai nagusietan zehar. Koloreek lagin mota adierazten dute: PPArekin esposizioa duten saguak moreak dira eta kontrol-saguak horiak. 1 eta 2 osagai nagusiak x ardatzean eta y ardatzean irudikatzen dira, hurrenez hurren, eta azaldutako bariantza-erlazio gisa adierazten dira.
Ondoren, KEGG knockout-en ugaritasuna aztertu genuen lagin mota desberdinetan. Guztira 3648 knockout bakar identifikatu ziren, eta horietatik 196 nabarmen ugariagoak ziren kontrol-laginetan eta 106 ugariagoak PPA laginetan (5. irudia). Guztira 145 gene detektatu ziren kontrol-laginetan eta 61 gene PPA laginetan, ugaritasun nabarmen desberdinekin. Lipidoen eta aminoazukreen metabolismoarekin lotutako bideak nabarmen aberastuagoak ziren PPA laginetan (3. taula osagarria). Nitrogenoaren metabolismoarekin eta sufrearen errelebo-sistemekin lotutako bideak nabarmen aberastuagoak ziren kontrol-laginetan (3. taula osagarria). Aminoazukre/nukleotidoen metabolismoarekin (ko:K21279) eta inositol fosfatoaren metabolismoarekin (ko:K07291) lotutako geneen ugaritasuna nabarmen handiagoa izan zen PPA laginetan (5. irudia). Kontrol-laginek benzoatoaren metabolismoarekin (ko:K22270), nitrogenoaren metabolismoarekin (ko:K00368) eta glukolisi/glukoneogenesiarekin (ko:K00131) lotutako gene askoz gehiago zituzten (5. irudia).
5. irudia. PPA eta kontrol saguen hesteetako mikrobioman KOen ugaritasun diferentziala. Sumendiaren grafikoak talde funtzionalen (KO) ugaritasunean dauden desberdintasunak erakusten ditu. Puntu grisek lagin moten artean ugaritasun esanguratsurik ez zuten KOak adierazten dituzte (p-balioa > 0,05). Koloretako puntuek ugaritasunean dauden desberdintasun esanguratsuak adierazten dituzte (p-balioa ≤ 0,05). Lagin moten artean ugaritasunean dauden desberdintasun handienak dituzten 20 KOak gorriz eta urdin argiz ageri dira, kontrol eta PPA laginei dagozkienak, hurrenez hurren. Puntu hori eta moreek kontrol eta PPA laginetan gutxienez 2,7 aldiz ugariagoak ziren KOak adierazten dituzte, hurrenez hurren. Puntu beltzek ugaritasun esanguratsu desberdinak zituzten KOak adierazten dituzte, -1 eta 1 arteko CLR batez besteko desberdintasunekin. P balioak Mann-Whitney U testa erabiliz kalkulatu ziren eta Benjamini-Hochberg prozedura erabiliz doitu ziren konparazio anitzekoetarako. NaN-k adierazten du KOa ez dagoela KEGG-ko bide batean. CLR batez besteko desberdintasun balio lodiek ugaritasunean dauden desberdintasun esanguratsuak adierazten dituzte. Zerrendatutako KOek zer bideri dagozkien informazio zehatza lortzeko, ikus 3. taula osagarria.
Anotatutako geneen artean, 1601 genek ugaritasun nabarmen desberdinak zituzten lagin moten artean (p ≤ 0,05), gene bakoitza gutxienez 2,7 aldiz ugariagoa izanik. Gene horietatik, 4 gene ugariagoak ziren kontrol laginetan eta 1597 gene ugariagoak PPA laginetan. PPAk propietate antimikrobianoak dituenez, PPA metabolismoaren eta ekoizpen geneen ugaritasunak aztertu genituen lagin moten artean. 1332 PPA metabolismoarekin erlazionatutako geneen artean, 27 gene nabarmen ugariagoak ziren kontrol laginetan eta 12 gene ugariagoak ziren PPA laginetan. 223 PPA ekoizpenarekin erlazionatutako geneen artean, gene bat nabarmen ugariagoa zen PPA laginetan. 6A irudiak PPA metabolismoan parte hartzen duten geneen ugaritasun handiagoa erakusten du, kontrol laginetan ugaritasun nabarmen handiagoarekin eta efektu tamaina handiekin, eta 6B irudiak, berriz, PPA laginetan ugaritasun nabarmen handiagoa duten gene indibidualak nabarmentzen ditu.
6. irudia. PPArekin lotutako geneen ugaritasun diferentziala saguaren hesteetako mikrobioman. Sumendi-diagramek PPA metabolismoarekin (A) eta PPA ekoizpenarekin (B) lotutako geneen ugaritasunean dauden desberdintasunak erakusten dituzte. Puntu grisek lagin moten artean ugaritasun nabarmen desberdina ez zuten geneak adierazten dituzte (p-balioa > 0,05). Koloretako puntuek ugaritasunean dauden desberdintasun esanguratsuak adierazten dituzte (p-balioa ≤ 0,05). Ugaritasunean dauden desberdintasun handienak dituzten 20 geneak gorriz eta urdin argiz ageri dira (kontrol eta PPA laginak), hurrenez hurren. Puntu hori eta moreen ugaritasuna gutxienez 2,7 aldiz handiagoa izan zen kontrol eta PPA laginetan kontrol laginetan baino. Puntu beltzek ugaritasun nabarmen desberdinak dituzten geneak adierazten dituzte, CLR batez besteko desberdintasunak -1 eta 1 artean izanik. P balioak Mann-Whitney U testa erabiliz kalkulatu ziren eta konparazio anitzekoetarako zuzendu ziren Benjamini-Hochberg prozedura erabiliz. Geneak erredundanteak ez diren geneen katalogoko gene adierazgarriei dagozkie. Geneen izenak KO gene bat adierazten duen KEGG ikurra dute. CLR batez besteko desberdintasun lodiek ugaritasun nabarmen desberdinak adierazten dituzte. Marratxo batek (-) adierazten du genearentzat ez dagoela sinbolorik KEGG datu-basean.
PPA metabolismoarekin eta/edo ekoizpenarekin lotutako geneak dituzten taxonak identifikatu ziren kontigen identitate taxonomikoa genearen kontig IDarekin parekatuz. Genero mailan, 130 generok PPA metabolismoarekin lotutako geneak zituztela aurkitu zen eta 61 generok PPA ekoizpenarekin lotutako geneak zituztela (4. taula osagarria). Hala ere, ez zegoen generorik ugaritasunean alde esanguratsurik erakutsiz (p > 0,05).
Espezie mailan, 144 bakterio espeziek PPA metabolismoarekin lotutako geneak zituztela aurkitu zen, eta 68 bakterio espeziek PPA ekoizpenarekin lotutako geneak zituztela (5. taula osagarria). PPA metabolizatzaileen artean, zortzi bakteriok ugaritasun igoera nabarmenak erakutsi zituzten lagin moten artean, eta guztiek eragin aldaketa esanguratsuak erakutsi zituzten (6. taula osagarria). Ugaritasunean alde esanguratsuak zituzten PPA metabolizatzaile identifikatutako guztiak ugariagoak ziren PPA laginetan. Espezie mailako sailkapenak lagin moten artean alde nabarmenik ez zuten generoen ordezkariak agerian utzi zituen, besteak beste, hainbat Bacteroides eta Ruminococcus espezie, baita Duncania dubois, Myxobacterium enterica, Monococcus pectinolyticus eta Alcaligenes polymorpha ere. PPA ekoizten duten bakterioen artean, lau bakteriok ugaritasunean alde esanguratsuak erakutsi zituzten lagin moten artean. Ugaritasunean alde esanguratsuak zituzten espezieen artean Bacteroides novorossi, Duncania dubois, Myxobacterium enteritidis eta Ruminococcus bovis zeuden.
Ikerketa honetan, PPAren eraginak saguen hesteetako mikrobiotan aztertu ditugu. PPAk erantzun desberdinak sor ditzake bakterioetan, espezie batzuek ekoizten dutelako, beste espezie batzuek elikagai-iturri gisa erabiltzen dutelako edo efektu antimikrobianoak dituelako. Beraz, hesteetako ingurunera dieta-osagarrien bidez gehitzeak eragin desberdinak izan ditzake tolerantziaren, sentikortasunaren eta mantenugai-iturri gisa erabiltzeko gaitasunaren arabera. Bakterio-espezie sentikorrak ezabatu eta PPArekiko erresistenteagoak diren edo elikagai-iturri gisa erabiltzeko gai direnekin ordezkatu daitezke, eta horrek hesteetako mikrobiotaren osaeran aldaketak eragin ditzake. Gure emaitzek mikrobioen osaeran alde nabarmenak erakutsi zituzten, baina ez zuten eraginik mikrobioen dibertsitate orokorrean. Eragin handienak espezie-mailan ikusi ziren, 70 taxon baino gehiago ugaritasunean nabarmen desberdinak izanik PPA eta kontrol-laginen artean (2. taula osagarria). PPAren eraginpean egon ziren laginen osaeraren ebaluazio gehiagok mikrobioen espezieen heterogeneotasun handiagoa erakutsi zuen eraginpean egon ez ziren laginekin alderatuta, eta horrek iradokitzen du PPAk bakterioen hazkuntza-ezaugarriak hobetu eta PPA ugariko inguruneetan biziraun dezaketen bakterioen populazioak mugatu ditzakeela. Beraz, PPAk hesteetako mikrobiotaren dibertsitatearen eten orokorra eragin beharrean aldaketak selektiboki eragin ditzake.
Aurretik frogatu da PPA bezalako elikagai-kontserbagarriek hesteetako mikrobiomaren osagaien ugaritasuna aldatzen dutela dibertsitate orokorra eragin gabe (Nagpal et al., 2021). Hemen, Bacteroidetes filumaren barruan (lehen Bacteroidetes bezala ezagutzen zena) Bacteroidetes espezieen arteko desberdintasun nabarmenenak ikusi genituen, PPArekin kontaktuan zeuden saguetan nabarmen aberastu baitziren. Bacteroides espezieen ugaritasuna handitzea mukiaren degradazio handiagoarekin lotuta dago, eta horrek infekzio arriskua handitu eta hantura sustatu dezake (Cornick et al., 2015; Desai et al., 2016; Penzol et al., 2019). Ikerketa batek aurkitu zuen Bacteroides fragilisekin tratatutako sagu ar jaioberriek autismoaren espektroaren nahasmenduaren (AEN) antzeko portaera sozialak erakusten zituztela (Carmel et al., 2023), eta beste ikerketa batzuek erakutsi dute Bacteroides espezieek sistema immunologikoaren jarduera alda dezaketela eta kardiomiopatia inflamatorio autoimmunea eragin dezaketela (Gil-Cruz et al., 2019). Ruminococcus, Prevotella eta Parabacteroides generoetako espezieak ere nabarmen handitu ziren PPAren eraginpean zeuden saguetan (Coretti et al., 2018). Ruminococcus espezie batzuk Crohn-en gaixotasuna bezalako gaixotasunekin lotuta daude zitokina proinflamatorioen ekoizpenaren bidez (Henke et al., 2019), eta Prevotella espezieak, hala nola Prevotella humani, hipertentsioa eta intsulinarekiko sentikortasuna bezalako gaixotasun metabolikoekin lotuta daude (Pedersen et al., 2016; Li et al., 2017). Azkenik, ikusi genuen Bacteroidetes (lehen Firmicutes bezala ezagutzen zirenak) eta Bacteroidetes-en arteko ratioa nabarmen txikiagoa zela PPAren eraginpean zeuden saguetan kontrol-saguetan baino, Bacteroidetes espezieen ugaritasun total handiagoa zegoelako. Aurretik frogatu da proportzio hau hesteetako homeostasiaren adierazle garrantzitsua dela, eta proportzio honetako asaldurak hainbat gaixotasun-egoerarekin lotu dira (Turpin et al., 2016; Takezawa et al., 2021; An et al., 2023), hesteetako hanturazko gaixotasunak barne (Stojanov et al., 2020). Oro har, Bacteroidetes filumeko espezieak PPA dietetiko altuak gehien eragiten dituela dirudi. Hori PPArekiko tolerantzia handiagoagatik edo PPA energia-iturri gisa erabiltzeko gaitasunagatik izan daiteke, eta hori egia dela frogatu da gutxienez espezie batentzat, Hoylesella enocea-rentzat (Hitch et al., 2022). Bestela, amaren PPAren esposizioak fetuaren garapena hobetu dezake, saguaren ondorengoen hesteak Bacteroidetes kolonizazioarekiko sentikorrago bihurtuz; hala ere, gure ikerketaren diseinuak ez zuen ebaluazio hori ahalbidetu.
Metagenomaren edukiaren ebaluazioak PPAren metabolismoarekin eta ekoizpenarekin lotutako geneen ugaritasunean alde nabarmenak erakutsi zituen, PPAren eraginpean zeuden saguek PPAren ekoizpenaz arduratzen diren geneen ugaritasun handiagoa erakutsi baitzuten, eta PPAren eraginpean ez zeuden saguek, berriz, PAAren metabolismoaz arduratzen diren geneen ugaritasun handiagoa erakutsi zuten (6. irudia). Emaitza hauek iradokitzen dute PPAk mikrobioen konposizioan duen eragina ez dela soilik bere erabileraren ondorioa, bestela, PPAren metabolismoarekin lotutako geneen ugaritasunak ugaritasun handiagoa erakutsi beharko zukeen PPAren eraginpean zeuden saguen hesteetako mikrobioman. Azalpen bat da PPAk bakterioen ugaritasuna bitartekatzen duela batez ere bere efektu antimikrobianoen bidez, bakterioek mantenugai gisa erabiltzen dutenaren bidez baino. Aurreko ikerketek erakutsi dute PPAk Salmonella Typhimurium-en hazkundea inhibitzen duela dosiaren araberako moduan (Jacobson et al., 2018). PPAren kontzentrazio handiagoen eraginpean egoteak bere propietate antimikrobianoekiko erresistenteak diren bakterioak hauta ditzake, eta baliteke ez izatea zertan metabolizatu edo ekoiztu gai. Adibidez, Parabacteroides espezie batzuek ugaritasun nabarmen handiagoa erakutsi zuten PPA laginetan, baina ez zen PPA metabolismoarekin edo ekoizpenarekin lotutako generik detektatu (2, 4 eta 5 taula osagarriak). Gainera, hartzidura azpiproduktu gisa PPA ekoizpena oso banatuta dago hainbat bakterioren artean (Gonzalez-Garcia et al., 2017). Bakterioen dibertsitate handiagoa izan daiteke kontrol laginetan PPA metabolismoarekin lotutako geneen ugaritasun handiagoaren arrazoia (Averina et al., 2020). Gainera, 1332 geneetatik 27 (% 2,14) bakarrik aurreikusi ziren PPA metabolismoarekin soilik lotutako geneak zirela. PPA metabolismoarekin lotutako gene asko beste bide metaboliko batzuetan ere parte hartzen dute. Horrek are gehiago erakusten du PPA metabolismoan parte hartzen duten geneen ugaritasuna handiagoa zela kontrol laginetan; gene hauek PPA azpiproduktu gisa erabiltzea edo eratzea eragiten ez duten bideetan funtziona dezakete. Kasu honetan, PPA sorkuntzarekin lotutako gene bakarrak erakutsi zituen ugaritasun desberdintasun esanguratsuak lagin moten artean. PPA metabolismoarekin lotutako geneekin alderatuta, PPA ekoizpenerako markatzaile-geneak hautatu ziren, PPA ekoizpenerako bakterioen bidean zuzenean parte hartzen dutelako. PPAren eraginpean egon ziren saguetan, espezie guztiek nabarmen handitu zirela ikusi zen PPA ekoizteko ugaritasuna eta gaitasuna. Horrek PPAk PPA ekoizleak hautatuko lituzketela dioen iragarpena babesten du eta, beraz, PPA ekoizpen-ahalmena handituko litzatekeela aurreikusten du. Hala ere, geneen ugaritasunak ez du zertan korrelaziorik izan geneen adierazpenarekin; beraz, PPA metabolismoarekin lotutako geneen ugaritasuna handiagoa den arren kontrol-laginetan, adierazpen-tasa desberdina izan daiteke (Shi et al., 2014). PPA ekoizten duten geneen prebalentziaren eta PPA ekoizpenaren arteko erlazioa berresteko, PPA ekoizpenean parte hartzen duten geneen adierazpenaren azterketak behar dira.
PPA eta kontrol metagenomen anotazio funtzionalak zenbait desberdintasun agerian utzi zituen. Geneen edukiaren PCA analisiak PPA eta kontrol laginen arteko multzo diskretuak agerian utzi zituen (5. irudia). Lagin barruko multzokatzeak kontrol geneen edukia anitzagoa zela agerian utzi zuen, PPA laginak elkarrekin multzokatu ziren bitartean. Geneen edukiaren araberako multzokatzea espezieen konposizioaren araberako multzokatzearekin konparagarria zen. Beraz, bideen ugaritasunean dauden desberdintasunak espezie eta andui espezifikoen ugaritasunean izandako aldaketekin bat datoz. PPA laginetan, ugaritasun nabarmen handiagoa zuten bi bide aminoazukre/nukleotido azukre metabolismoarekin (ko:K21279) eta lipidoen metabolismo bide anitzekin (ko:K00647, ko:K03801; 3. taula osagarria) erlazionatuta zeuden. ko:K21279 generoarekin lotutako geneak Bacteroides generoarekin lotuta daudela ezagutzen da, PPA laginetan espezie kopuru nabarmen handiagoa duen generoetako batekin. Entzima honek immunitate-erantzuna saihestu dezake kapsula-polisakaridoak adieraziz (Wang et al., 2008). Honek azal lezake PPAren eraginpean dauden saguetan ikusitako Bacteroidetesen igoera. Honek PPA mikrobioman behatutako gantz-azidoen sintesiaren igoera osatzen du. Bakterioek FASIIko:K00647 (fabB) bidea erabiltzen dute gantz-azidoak ekoizteko, eta horrek ostalariaren bide metabolikoetan eragina izan dezake (Yao eta Rock, 2015; Johnson et al., 2020), eta lipidoen metabolismoan izandako aldaketek neurogarapenean eragina izan dezakete (Yu et al., 2020). PPA laginetan ugaritasun handiagoa erakutsi duen beste bide bat hormona esteroideen biosintesia izan da (ko:K12343). gero eta ebidentzia gehiago dago hesteetako mikrobiotak hormona-mailetan eragiteko duen gaitasunaren eta hormonen eraginpean egoteko duen gaitasunaren artean alderantzizko erlazioa dagoela, eta horrela esteroideen maila altuek ondorioak izan ditzakete osasunean (Tetel et al., 2018).
Ikerketa honek baditu mugak eta gogoetak. Desberdintasun garrantzitsu bat da ez ditugula animalien ebaluazio fisiologikorik egin. Beraz, ezin da zuzenean ondorioztatu mikrobiomaren aldaketak gaixotasunekin lotuta dauden ala ez. Beste kontu bat da ikerketa honetako saguei amen dieta bera eman zitzaiela. Etorkizuneko ikerketek zehaztu dezakete PPA ugariko dieta batetik PPA gabeko dieta batera aldatzeak mikrobioman dituen efektuak hobetzen dituen ala ez. Gure ikerketaren muga bat, beste askoren antzera, laginaren tamaina mugatua da. Ondorio baliozkoak atera daitezkeen arren, lagin-tamaina handiago batek potentzia estatistiko handiagoa emango luke emaitzak aztertzerakoan. Kontuz ibiltzen gara, halaber, hesteetako mikrobiomaren aldaketen eta gaixotasunen arteko loturari buruzko ondorioak ateratzerakoan (Yap et al., 2021). Nahasteko faktoreek, hala nola adina, sexua eta dieta, eragin handia izan dezakete mikroorganismoen konposizioan. Faktore hauek azal ditzakete literaturan hesteetako mikrobiomaren eta gaixotasun konplexuen arteko loturari buruz ikusitako inkoherentziak (Johnson et al., 2019; Lagod eta Naser, 2023). Adibidez, Bacteroidetes generoko kideak handitu edo gutxitu egin direla frogatu da ASD duten animalietan eta gizakietan (Angelis et al., 2013; Kushak et al., 2017). Era berean, hesteetako hanturazko gaixotasunak dituzten pazienteen heste-konposizioari buruzko ikerketek igoerak eta jaitsierak aurkitu dituzte taxon berdinetan (Walters et al., 2014; Forbes et al., 2018; Upadhyay et al., 2023). Genero-alborapenaren eragina mugatzeko, sexuen ordezkaritza berdina ziurtatzen saiatu ginen, desberdintasunak ziurrenik dietak eraginda izan zitezen. Anotazio funtzionalen erronka bat gene-sekuentzia erredundanteak kentzea da. Gure geneen multzokatze-metodoak % 95eko sekuentzia-identitatea eta % 85eko luzera-antzekotasuna behar ditu, baita % 90eko lerrokatze-estaldura ere multzokatze faltsuak ezabatzeko. Hala ere, kasu batzuetan, anotazio berdinak zituzten COGak ikusi genituen (adibidez, MUT) (6. irudia). Ikerketa gehiago behar dira ortologo hauek desberdinak diren, genero espezifikoekin lotuta dauden edo geneen multzokatzearen ikuspegiaren muga bat den zehazteko. Funtzio-anotazioaren beste muga bat sailkapen oker potentziala da; mmdA bakterioen genea propionatoaren sintesian parte hartzen duen entzima ezaguna da, baina KEGG-k ez du propionatoaren bide metabolikoarekin lotzen. Aitzitik, scpB eta mmcD ortologoak erlazionatuta daude. Knockout izendaturik gabeko gene kopuru handiak PPArekin lotutako geneak identifikatzeko ezintasuna eragin dezake geneen ugaritasuna ebaluatzerakoan. Etorkizuneko ikerketek metatranskriptomaren analisia onuragarria izango dute, hesteetako mikrobiotaren ezaugarri funtzionalen ulermen sakonagoa eman eta geneen adierazpena ondorengo efektu potentzialekin lotu baitezake. Garapen neurologikoko nahasmendu edo hesteetako hanturazko gaixotasun espezifikoei buruzko ikerketetarako, animalien ebaluazio fisiologiko eta portaerazkoak behar dira mikrobiomaren konposizioaren aldaketak nahasmendu hauekin lotzeko. Hesteetako mikrobioma sagu germenik gabekoetan transplantatzeko ikerketa gehigarriak ere erabilgarriak izango lirateke mikrobioma gaixotasunaren eragile edo ezaugarri den zehazteko.
Laburbilduz, frogatu dugu PPA dietetikoak hesteetako mikrobiotaren osaera aldatzeko faktore gisa jokatzen duela. PPA FDAk onartutako kontserbagarria da, hainbat elikagaitan oso zabalduta dagoena, eta epe luzeko esposizioaren ondoren, hesteetako flora normala eten dezakeena. Hainbat bakterioren ugaritasunean aldaketak aurkitu ditugu, eta horrek iradokitzen du PPAk hesteetako mikrobiotaren osaeran eragina izan dezakeela. Mikrobiotaren aldaketek bide metaboliko jakin batzuen mailetan aldaketak eragin ditzakete, eta horrek ostalariaren osasunerako garrantzitsuak diren aldaketa fisiologikoak ekar ditzake. Ikerketa gehiago behar dira PPA dietetikoak konposizio mikrobianoan duen eraginak disbiosia edo beste gaixotasun batzuk ekar ditzakeen zehazteko. Ikerketa honek oinarriak ezartzen ditu etorkizuneko ikerketetarako, hesteetako konposizioan duen eraginak gizakien osasunean nola eragin dezakeen aztertzeko.
Ikerketa honetan aurkeztutako datu-multzoak lineako biltegietan daude eskuragarri. Biltegiaren izena eta sartze-zenbakia hauek dira: https://www.ncbi.nlm.nih.gov/, PRJNA1092431.
Animaliekin egindako ikerketa hau Floridako Erdialdeko Unibertsitateko Animalien Zaintza eta Erabilera Batzorde Instituzionalak (UCF-IACUC) onartu zuen (Animalien Erabilera Baimen Zenbakia: PROTO202000002). Ikerketa honek tokiko legeak, araudiak eta erakundearen eskakizunak betetzen ditu.
NG: Kontzeptualizazioa, Datuen kudeaketa, Analisi formala, Ikerketa, Metodologia, Softwarea, Bistaratzea, Idazketa (jatorrizko zirriborroa), Idazketa (berrikuspena eta edizioa). LA: Kontzeptualizazioa, Datuen kudeaketa, Metodologia, Baliabideak, Idazketa (berrikuspena eta edizioa). SH: Analisi formala, Softwarea, Idazketa (berrikuspena eta edizioa). SA: Ikerketa, Idazketa (berrikuspena eta edizioa). Epaile nagusia: Ikerketa, Idazketa (berrikuspena eta edizioa). SN: Kontzeptualizazioa, Proiektuen administrazioa, Baliabideak, Gainbegiratzea, Idazketa (berrikuspena eta edizioa). TA: Kontzeptualizazioa, Proiektuen administrazioa, Gainbegiratzea, Idazketa (berrikuspena eta edizioa).
Egileek adierazi dute ez dutela inolako laguntza ekonomikorik jaso artikulu honen ikerketarako, egiletzarako eta/edo argitalpenerako.
Egileek adierazten dute ikerketa interes-gatazka potentzial gisa interpretatu zitekeen inolako merkataritza- edo finantza-harremanik gabe egin dela. ez da aplikagarria.
Artikulu honetan adierazitako iritzi guztiak egileenak dira soilik eta ez dute zertan islatu beren erakundeen, argitaletxeen, editoreen edo berrikusleen ikuspuntuak. Artikulu honetan ebaluatutako produktuak edo haien fabrikatzaileek egindako baieztapenak ez daude argitaletxearen berme edo babespean.
Artikulu honen material osagarria sarean aurki daiteke: https://www.frontiersin.org/articles/10.3389/frmbi.2024.1451735/full#supplementary-material
Abdelli LS, Samsam A, Nasser SA (2019). Azido propionikoak gliosia eta neuroinflamazioa eragiten ditu autismoaren espektroaren nahasteetan PTEN/AKT bidea erregulatuz. Txosten zientifikoak 9, 8824–8824. doi: 10.1038/s41598-019-45348-z
Aitchison, J. (1982). Konposizio-datuen analisi estatistikoa. JR Stat Soc Ser B Methodol. 44, 139–160. doi: 10.1111/j.2517-6161.1982.tb01195.x
Ahn J, Kwon H, Kim YJ (2023). Firmicutes/Bacteroidetes ratioa bularreko minbiziaren arrisku-faktore gisa. Journal of Clinical Medicine, 12, 2216. doi: 10.3390/jcm12062216
Anders S., Huber W. (2010). Sekuentzia-zenbaketa datuen adierazpen diferentzialaren analisia. Nat Prev. 1–1, 1–10. doi: 10.1038/npre.2010.4282.1
Angelis, MD, Piccolo, M., Vannini, L., Siragusa, S., Giacomo, AD, Serrazanetti, DI, et al. (2013). Gorozki-mikrobiota eta metaboloma autismoa eta bestelakorik zehaztu gabeko garapen-nahasmendu orokorra duten haurrengan. PloS One 8, e76993. doi: 10.1371/journal.pone.0076993
Averina OV, Kovtun AS, Polyakova SI, Savilova AM, Rebrikov DV, Danilenko VN (2020). Autismoaren espektroaren nahasteak dituzten haur txikien hesteetako mikrobiotaren bakterioen neurometabolismo ezaugarriak. Journal of Medical Microbiology 69, 558–571. doi: 10.1099/jmm.0.001178
Baquero F., Nombela K. (2012). Mikrobioma giza organo gisa. Mikrobiologia Klinikoa eta Infekzioak 18, 2–4. doi: 10.1111/j.1469-0691.2012.03916.x
Baur T., Dürre P. (2023). Azido propionikoa ekoizten duten bakterioen fisiologiari buruzko ikuspegi berriak: Anaerotignum propionicum eta Anaerotignum neopropionicum (lehen Clostridium propionicum eta Clostridium neopropionicum). Microorganisms 11, 685. doi: 10.3390/microorganismes11030685
Bazer FW, Spencer TE, Wu G, Cudd TA, Meininger SJ (2004). Amaren elikadura eta fetuaren garapena. J Nutr. 134, 2169–2172. doi: 10.1093/jn/134.9.2169
Benjamini, Y., eta Hochberg, J. (1995). Positibo faltsuen tasa kontrolatzea: hainbat proba egiteko ikuspegi praktiko eta eraginkorra. JR Stat Soc Ser B Methodol. 57, 289–300. doi: 10.1111/j.2517-6161.1995.tb02031.x