Immunomodulatzaile metabolitoak tumore-mikroingurunearen (TME) ezaugarri gakoak dira, baina salbuespen batzuk kenduta, haien identitateak ezezagunak dira oraindik ere. Hemen, kartzinoma seroso gradu altua (HGSC) duten pazienteen tumore eta aszita-zelulak eta T zelulak aztertu ditugu TME konpartimentu desberdin hauen metaboloma agerian uzteko. Aszitek eta tumore-zelulek metabolitoen arteko desberdintasun handiak dituzte. Aszitisarekin alderatuta, tumoreetan infiltratzen diren T zelulak nabarmen aberastuta daude 1-metilnikotinamidan (MNA). T zeluletan MNA maila altua den arren, nikotinamida N-metiltransferasaren adierazpena (S-adenosilmetioninatik nikotinamidara metil taldeen transferentzia katalizatzen duen entzima) fibroblastoetara eta tumore-zeluletara mugatzen da. Funtzionalki, MNAk T zelulak tumorea sustatzen duen tumore-nekrosi faktore alfa zitokina jariatzera bultzatzen ditu. Beraz, TMEtik eratorritako MNAk T zelulen immunitate-erregulazioan laguntzen du eta gizakien minbizia tratatzeko immunoterapia-helburu potentziala da.
Tumoreetatik eratorritako metabolitoek eragin inhibitzaile sakona izan dezakete tumoreen aurkako immunitatean, eta gero eta ebidentzia gehiagok erakusten dute gaixotasunaren progresioaren eragile nagusi gisa ere balio dezaketela (1). Warburg efektuaz gain, azken lanek tumore-zelulen egoera metabolikoa eta tumore-mikroingurunearen (TME) egoera immunologikoarekin duen harremana karakterizatzen hasi dira. Sagu-ereduetan eta gizakien T zeluletan egindako ikerketek erakutsi dute glutaminaren metabolismoak (2), metabolismo oxidatiboak (3) eta glukosaren metabolismoak (4) modu independentean jardun dezaketela hainbat zelula immunologiko azpitaldetan. Bide horietako hainbat metabolitok T zelulen tumoreen aurkako funtzioa inhibitzen dute. Frogatu da tetrahidrobiopterina (BH4) koentzimaren blokeoak T zelulen ugalketa kaltetu dezakeela, eta gorputzean BH4-ren igoerak CD4 eta CD8-k bitartekatutako tumoreen aurkako erantzun immunologikoa hobetu dezakeela. Gainera, kinureninaren efektu immunosupresorea BH4-ren administrazioaren bidez berreskura daiteke (5). Isozitrato deshidrogenasa (IDH) mutante glioblastoman, enantiometabolismoaren (R)-2-hidroxiglutaratoaren (R-2-HG) jariaketak T zelulen aktibazioa, ugalketa eta zitolisi jarduera inhibitzen ditu (6). Duela gutxi, frogatu da metilglioxala, glukolisiaren azpiproduktu bat, jatorri mieloideko zelula zapaltzaileek sortzen dutela, eta metilglioxalaren T zelulen transferentziak efektore T zelulen funtzioa inhibi dezakeela. Tratamenduan, metilglioxalaren neutralizazioak mieloideetatik eratorritako zelula zapaltzaileen (MDSC) jarduera gainditu dezake eta sinergikoki hobetu kontrol-puntuen blokeo terapia sagu-ereduetan (7). Ikerketa hauek guztiek TMEtik eratorritako metabolitoen funtsezko zeregina azpimarratzen dute T zelulen funtzioa eta jarduera erregulatzeko orduan.
T zelulen disfuntzioa obulutegiko minbizian asko jakinarazi da (8). Hau neurri batean hipoxiaren eta tumore-baskulatura anormalaren (9) berezko ezaugarri metabolikoengatik da, eta horrek glukosa eta triptofanoa azido laktikoa eta kinurenina bezalako azpiproduktu bihurtzen ditu. Gehiegizko laktato estrazelularrak interferon-γ (IFN-γ) ekoizpena murrizten du eta azpitalde mielosupresoreen bereizketa bultzatzen du (10, 11). Triptofanoaren kontsumoak zuzenean inhibitzen du T zelulen ugalketa eta T zelulen hartzaileen seinaleztapena inhibitzen du (12-14). Behaketa hauek gorabehera, metabolismo immunologikoari buruzko lan asko egin zen in vitro T zelulen kulturan, ingurune optimizatuak erabiliz, edo in vivo sagu-eredu homologoetara mugatuz, eta horrek ez du guztiz islatzen gizakien minbizien eta ingurune makro eta mikro fisiologikoaren heterogeneotasuna.
Obulutegiko minbiziaren ezaugarri ohikoa peritoneoko hedapena eta aszitisaren agerpena da. Aszitisean zelula-fluidoaren metaketa gaixotasun aurreratuarekin eta pronostiko txarrarekin lotuta dago (15). Txostenen arabera, konpartimentu berezi hau hipoxikoa da, hazkunde-faktore endotelial baskularra (VEGF) eta indoleamina 2,3-dioxigenasa (IDO) maila altuak ditu, eta T zelula erregulatzaileek eta zelula inhibitzaile mieloideek infiltratzen dute (15-18). Aszitisaren ingurune metabolikoa tumorearen beraren ingurunetik desberdina izan daiteke, beraz, T zelulen birprogramazioa peritoneoko espazioan ez dago argi. Gainera, tumore-ingurunean dauden aszitisaren eta metabolitoen arteko funtsezko desberdintasunak eta heterogeneotasuna zelula immuneen infiltrazioa eta tumoreetan duten funtzioa oztopatu dezakete, eta ikerketa gehiago behar dira.
Arazo hauek konpontzeko, zelula-bereizketa eta kromatografia likidozko tandem masa-espektrometria (LC-MS/MS) metodo sentikor bat diseinatu genuen zelula mota desberdinak (CD4 + eta CD8 + T zelulak barne) aztertzeko, baita tumoreen barruan eta artean ere. Bere metabolitoek pazientearen aszitis eta tumore-ingurune berean dauden zelulak hartzen dituzte. Metodo hau dimentsio handiko fluxu-zitometriarekin eta zelula bakarreko RNA sekuentziazioarekin (scRNA-seq) batera erabiltzen dugu populazio gako horien egoera metabolikoaren erretratu oso bereiztua emateko. Metodo honek 1-metilnikotinamida (MNA) mailaren igoera nabarmena agerian utzi zuen tumore-T zeluletan, eta in vitro esperimentuek erakutsi zuten MNAk T zelulen funtzioan duen efektu immunomodulatzailea lehenago ezezaguna zela. Oro har, metodo honek tumoreen eta zelula immuneen arteko elkarrekintza metaboliko elkarrekiko agerian uzten ditu, eta immunitate-erregulazioko metabolitoei buruzko ikuspegi bereziak eskaintzen ditu, eta hori erabilgarria izan daiteke T zeluletan oinarritutako obulutegiko minbiziaren immunoterapiaren tratamendurako. Tratamendu-aukerak.
Dimentsio handiko fluxu-zitometria erabili genuen glukosaren xurgapena aldi berean kuantifikatzeko [2-(N-(7-nitrofenil-2-oxa-1,3-diaza-4-il)amino)-2-desoxiglukosa (2-NBDG)) eta mitokondrioen jarduera [MitoTracker Deep Red (MT DR)] (7, 19, 20) zelula immuneak eta tumore-zelulen populazioak bereizten dituzten markatzaile tipikoak dira (S2 taula eta S1A irudia). Analisia honek erakutsi zuen T zelulekin alderatuta, aszitek eta tumore-zelulek glukosaren xurgapen-maila handiagoak dituztela, baina mitokondrioen jardueran alde txikiagoak dituztela. Tumore-zelulen batez besteko glukosaren xurgapena [CD45-EpCAM (EpCAM)+] T zelulena baino hiru edo lau aldiz handiagoa da, eta CD4 + T zelulen batez besteko glukosaren xurgapena CD8 + T zelulena baino 1,2 aldiz handiagoa da, eta horrek adierazten du tumore-infiltratzaile diren linfozitoek (TIL) metabolismo-behar desberdinak dituztela TME berean ere (1A irudia). Aldiz, tumore-zelulen mitokondrioen jarduera CD4 + T zelulen antzekoa da, eta bi zelula moten mitokondrioen jarduera CD8 + T zelulena baino handiagoa da (1B irudia). Oro har, emaitza hauek maila metabolikoa erakusten dute. Tumore-zelulen jarduera metabolikoa CD4 + T zelulena baino handiagoa da, eta CD4 + T zelulen jarduera metabolikoa CD8 + T zelulena baino handiagoa da. Zelula mota desberdinetan efektu hauek izan arren, ez dago desberdintasun koherenterik CD4 + eta CD8 + T zelulen egoera metabolikoan edo haien proportzio erlatiboetan aszitisetan tumoreekin alderatuta (1C irudia). Aldiz, CD45 zelulen frakzioan, EpCAM+ zelulen proportzioa handitu egin zen tumorean aszitisekin alderatuta (1D irudia). Era berean, alde metaboliko argi bat ikusi genuen EpCAM+ eta EpCAM- zelulen osagaien artean. EpCAM+ (tumore) zelulek glukosa-xurgapen eta mitokondrio-jarduera handiagoa dute EpCAM- zelulek baino, eta hori askoz handiagoa da TMEko tumore-zeluletako fibroblastoen jarduera metabolikoa baino (1, E eta F irudia).
(A eta B) Glukosa xurgatzeko fluoreszentzia intentsitatearen (MFI) mediana (2-NBDG) (A) eta CD4 + T zelulen jarduera mitokondriala (MitoTracker gorri iluna) (B) Grafiko adierazgarriak (ezkerrean) eta datu tabulatuak (eskuinean), CD8 + T zelulak eta EpCAM + CD45-tumore zelulak aszitatik eta tumoretik. (C) CD4 + eta CD8 + zelulen (CD3 + T zelulen) erlazioa aszitatik eta tumoretik. (D) EpCAM + tumore zelulen proportzioa aszitatik eta tumoretik (CD45−). (E eta F) EpCAM + CD45-tumore eta EpCAM-CD45-matrizea glukosa xurgatzeko (2-NBDG) (E) eta jarduera mitokondriala (MitoTracker gorri iluna) (F) grafiko adierazgarriak (ezkerrean) eta datu tabulatuak (Eskuinean) Aszitak eta tumore zelulak. (G) CD25, CD137 eta PD1 adierazpenaren grafiko adierazgarriak fluxu zitometriaren bidez. (H eta I) CD25, CD137 eta PD1 adierazpena CD4 + T zeluletan (H) eta CD8 + T zeluletan (I). (J eta K) Fenotipo naif, memoria zentraleko (Tcm), efektore (Teff) eta efektore memoriako (Tem) fenotipoak, CCR7 eta CD45RO adierazpenean oinarrituta. CD4 + T zelulen (J) eta CD8 + T zelulen (K) irudi adierazgarriak (ezkerrean) eta datu tabularrak (eskuinean) aszitis eta tumoreetan. P balioak t-test parekatuaren bidez zehaztuta (*P<0,05, **P<0,01 eta ***P<0,001). Lerroak paziente parekatutakoak adierazten ditu (n = 6). FMO, fluoreszentzia ken bat; MFI, fluoreszentzia intentsitatearen mediana.
Azterketa gehiagok beste desberdintasun esanguratsu batzuk agerian utzi zituzten T zelulen fenotipu-egoera oso bereizien artean. Tumoreetan aktibatuta (1. irudia, G-tik I-ra) eta efektore-memoria (1. irudia, J eta K) askoz maizagoak dira aszita baino (CD3 + T zelulen proportzioa). Era berean, fenotipoa aztertuz aktibazio-markatzaileen (CD25 eta CD137) eta agortze-markatzaileen [programatutako zelulen heriotza-proteina 1 (PD1)] adierazpenaren bidez, populazio hauen ezaugarri metabolikoak desberdinak diren arren (S1 irudia, B-tik E-ra), ez zen desberdintasun metaboliko esanguratsurik ikusi azpimultzo inozoen, efektoreen edo memoriaren artean (S1 irudia, F-tik I-ra). Emaitza hauek berretsi ziren ikaskuntza automatikoko metodoak erabiliz zelulen fenotipoak automatikoki esleitzeko (21), eta horrek are gehiago agerian utzi zuen hezur-muineko zelula kopuru handia (CD45 + / CD3- / CD4 + / CD45RO +) pazientearen aszitan (S2A irudia). Identifikatutako zelula mota guztien artean, mieloide zelula-populazio honek erakutsi zuen glukosa-xurgapen eta mitokondrio-jarduera handiena (S2 irudia, B-tik G-ra). Emaitza hauek HGSC pazienteen aszitisean eta tumoreetan aurkitutako zelula mota anitzen arteko metaboliko desberdintasun handiak nabarmentzen dituzte.
TILen ezaugarri metabonomikoak ulertzeko erronka nagusia tumoreetatik nahikoa purutasun, kalitate eta kantitate duten T zelulen laginak isolatzeko beharra da. Azken ikerketek erakutsi dute fluxu-zitometrian oinarritutako sailkapen- eta aleen aberaste-metodoek zelulen metabolitoen profiletan aldaketak eragin ditzaketela (22-24). Arazo hau gainditzeko, aleen aberaste-metodoa optimizatu genuen TIL kirurgikoki erauzitako obulutegiko minbizitik isolatzeko eta isolatzeko, LC-MS/MS bidezko analisia egin aurretik (ikus Materialak eta metodoak; 2A irudia). Protokolo honek metabolitoen aldaketetan duen eragin orokorra ebaluatzeko, goiko aleen bereizketa-urratsaren ondoren emaile osasuntsuek aktibatutako T zelulen metabolitoen profilak alderatu genituen aleen bereizketa-urratsaren ondoren, aleen bereizketarik egin ez zuten baina izotzean geratu ziren zelulekin. Kalitate-kontrolaren analisi honek aurkitu zuen korrelazio handia dagoela bi baldintza hauen artean (r = 0,77), eta 86 metabolitoen taldearen errepikagarritasun teknikoak errepikagarritasun handia duela (2B irudia). Beraz, metodo hauek metabolitoen analisi zehatza egin dezakete zelula mota aberasten diren zeluletan, eta horrela, HGSC-n metabolito espezifikoak identifikatzeko lehen bereizmen handiko plataforma eskaintzen dute, eta horrela, jendeak zelulen espezifikotasuna sakonago ulertzen lagundu diezaioke sexu-metabolismoaren programari.
(A) Ale magnetikoen aberastearen diagrama eskematikoa. LC-MS/MS bidezko analisia egin aurretik, zelulek hiru txanda jarraian aberastuko dituzte ale magnetikoekin edo izotzean geratuko dira. (B) Aberaste motak metabolitoen ugaritasunean duen eragina. Aberaste mota bakoitzerako hiru neurketen batez bestekoa ± SE. Lerro grisak 1:1 erlazioa adierazten du. Errepikatutako neurketen klase barruko korrelazioa (ICC) ardatzaren etiketapean ageri da. NAD, nikotinamida adenina dinukleotidoa. (C) Pazienteen metabolitoen analisi-lan-fluxuaren diagrama eskematikoa. Aszitak edo tumoreak pazienteengandik biltzen dira eta kriokontserbatu egiten dira. Lagin bakoitzaren zati txiki bat fluxu-zitometriaren bidez aztertu zen, eta gainerako laginak hiru txanda aberastu ziren CD4+, CD8+ eta CD45- zeluletarako. Zelula-frakzio hauek LC-MS/MS erabiliz aztertu ziren. (D) Metabolitoen ugaritasun estandarizatuaren bero-mapa. Dendrogramak laginen arteko Ward-en distantzien multzokatzea adierazten du. (E) Lagin metabolitoen maparen osagai nagusien analisia (PCA), lagin bakoitzaren hiru errepikapen erakusten dituena, paziente beraren laginak lerro batez lotuta. (F) Pazientearen arabera baldintzatutako laginaren metabolito profilaren PCA (hau da, erredundantzia partziala erabiliz); lagin mota krosko ganbilak mugatzen du. PC1, 1. osagai nagusia; PC2, 2. osagai nagusia.
Ondoren, aberaste-metodo hau aplikatu genuen sei HGSC pazienteen aszitis eta tumore primarioetako CD4 +, CD8 + eta CD45-zelulen frakzioetako 99 metabolito aztertzeko (2C irudia, S3A irudia eta S3 eta S4 taulak). Intereseko populazioak zelula bizidunen jatorrizko lagin handiaren % 2tik % 70era bitartekoa da, eta zelulen proportzioa asko aldatzen da pazienteen artean. Aleen bereizketa egin ondoren, intereseko frakzio aberastuak (CD4+, CD8+ edo CD45-) lagineko zelula bizidun guztien % 85 baino gehiago hartzen du batez beste. Aberaste-metodo honek giza tumore-ehunen metabolismoaren zelula-populazioak aztertzeko aukera ematen digu, eta hori ezinezkoa da lagin handiekin egitea. Protokolo hau erabiliz, zehaztu genuen l-kinurenina eta adenosina, bi metabolito immunosupresore ondo karakterizatu hauek, tumore-T zeluletan edo tumore-zeluletan maila altua zutela (S3, B eta C irudia). Beraz, emaitza hauek gure zelulen bereizketa eta masa-espektrometria teknologiaren fideltasuna eta gaitasuna erakusten dute pazienteen ehunetan metabolito biologikoki garrantzitsuak aurkitzeko.
Gure analisiak zelula moten arteko bereizketa metaboliko sendoa ere agerian utzi zuen pazienteen barruan eta artean (2D irudia eta S4A irudia). Bereziki, beste pazienteekin alderatuta, 70. pazienteak ezaugarri metaboliko desberdinak erakutsi zituen (2E irudia eta S4B irudia), eta horrek adierazten du pazienteen artean heterogeneotasun metaboliko handia egon daitekeela. Aipatzekoa da, beste pazienteekin alderatuta (1,2 eta 2 litro artean; S1 taula), 70. pazientean bildutako aszita kopuru osoa (80 ml) txikiagoa izan zela. Osagai nagusien analisian zehar pazienteen arteko heterogeneotasunaren kontrolak (adibidez, erredundantzia partzialeko analisia erabiliz) aldaketa koherenteak erakusten ditu zelula moten artean, eta zelula motak eta/edo mikroinguruneak argi eta garbi agregatzen dira metabolitoen profilaren arabera (2F irudia). Metabolito bakarren analisiak efektu horiek azpimarratu zituen eta zelula moten eta mikroingurunearen arteko desberdintasun esanguratsuak agerian utzi zituen. Aipatzekoa da behatutako desberdintasunik muturrekoena MNA dela, normalean CD45- zeluletan eta tumorean sartzen diren CD4+ eta CD8+ zeluletan aberastua dagoena (3A irudia). CD4 + zeluletan, efektu hau nabarmenena da, eta CD8 + zeluletako MNA ere inguruneak eragin handia duela dirudi. Hala ere, hau ez da garrantzitsua, sei pazienteetatik hiruri bakarrik ebaluatu ahal baitzaie tumoreen CD8+ puntuazioei dagokienez. MNAz gain, aszitis eta tumoreetako zelula mota desberdinetan, TILen gaizki karakterizatutako beste metabolito batzuk ere aberatsak dira (S3 eta S4 irudiak). Beraz, datu hauek ikerketa gehiago egiteko metabolito immunomodulatzaile multzo itxaropentsu bat agerian uzten dute.
(A) MNAren eduki normalizatua aszita eta tumoreetako CD4+, CD8+ eta CD45- zeluletan. Kutxa-diagramak mediana (lerroa), kuartil arteko tartea (markoaren gontza) eta datuen tartea erakusten ditu, kuartil arteko tartearen (markoaren bibotea) 1,5 aldiz arte. Pazientearen Material eta Metodoetan deskribatzen den bezala, erabili pazientearen limma balioa P balioa zehazteko (*P<0,05 eta **P<0,01). (B) MNA metabolismoaren eskema (60). Metabolitoak: S-adenosil-1-metionina; SAH, S-adenosina-1-homozisteina; NA, nikotinamida; MNA, 1-metilnikotinamida; 2-PY, 1-metil-2-piridona-5-karboxamida; 4-PY, 1-metil-4-piridona-5-karboxamida; NR, nikotinamida erribosa; NMN, nikotinamida mononukleotidoa. Entzimak (berdea): NNMT, nikotinamida N-metiltransferasa; SIRT, sirtuinak; NAMPT, nikotinamida fosforibosil transferasa; AOX1, aldehido oxidasa 1; NRK, nikotinamida erribosido kinasa; NMNAT, nikotinamida mononukleotido adenilato transferasa; Pnp1, purina nukleosido fosforilasa. (C) Aszita (grisa) eta tumorearen (gorria; n = 3 paziente) scRNA-seq-aren t-SNE. (D) NNMT adierazpena scRNA-seq erabiliz identifikatutako zelula-populazio desberdinetan. (E) NNMT eta AOX1-en adierazpena SK-OV-3, giza enbrioi-giltzurruneko (HEK) 293T, T zeluletan eta MNAz tratatutako T zeluletan. Tolestutako adierazpena SK-OV-3-rekin alderatuta erakusten da. SEM-arekin adierazpen-eredua erakusten da (n = 6 emaile osasuntsu). 35 baino handiagoak diren Ct balioak detektatu ezin direntzat jotzen dira (UD). (F) SLC22A1 eta SLC22A2-ren adierazpena SK-OV-3, HEK293T, T zeluletan eta 8 mM MNArekin tratatutako T zeluletan. Tolestutako adierazpena SK-OV-3-rekiko erakusten da. SEM-rekin egindako adierazpen-eredua erakusten da (n = 6 emaile osasuntsu). 35etik gorako Ct balioak detektatu ezin direntzat jotzen dira (UD). (G) Zelulen MNA edukia emaile osasuntsu aktibatuetako T zelulan MNArekin 72 orduko inkubazioaren ondoren. SEM-rekin egindako adierazpen-eredua erakusten da (n = 4 emaile osasuntsu).
MNA S-adenosil-1-metionina (SAM)-etik nikotinamidara (NA) metil taldea transferituz sortzen da nikotinamida N-metiltransferasa (NNMT; 3B irudia) bidez. NNMT gehiegi adierazten da hainbat minbizi motatan eta ugalketa, inbasio eta metastasiarekin lotuta dago (25-27). TME-ko T zeluletan MNAren iturria hobeto ulertzeko, scRNA-seq erabili genuen hiru HGSC pazienteen aszita eta tumoreetako zelula mota desberdinetan NNMTren adierazpena karakterizatzeko (S5 taula). Gutxi gorabehera 6.500 zelularen analisiak erakutsi zuen aszita eta tumore inguruneetan NNMTren adierazpena ustezko fibroblasto eta tumore zelulen populazioetara mugatuta zegoela (3. irudia, C eta D). Aipatzekoa da ez dagoela NNMTren adierazpen agerikorik PTPRC (CD45 +) adierazten duen inongo populaziotan (3D irudia eta S5A irudia), eta horrek adierazten du metabolitoen espektroan detektatutako MNA T zeluletan sartu dela. Aldehido oxidasa 1 (AOX1)-en adierazpenak MNA 1-metil-2-piridona-5-karboxamida (2-PYR) edo 1-metil-4-piridona-5-karboxamida (4-PYR) bihurtzen du; 3B irudia) COL1A1 adierazten duten fibroblastoen populaziora ere mugatzen da (S5A irudia), eta horrek batera adierazten du T zelulek ez dutela MNA metabolismo konbentzionalaren gaitasuna. MNArekin lotutako gene hauen adierazpen-eredua egiaztatu zen HGSC gaixoen aszitatik lortutako bigarren zelula-datu multzo independente bat erabiliz (S5B irudia; n = 6) (16). Horrez gain, MNArekin tratatutako T zelula osasuntsuen polimerasa-kate-erreakzio kuantitatibo bidezko (qPCR) analisiak erakutsi zuen SK-OV-3 obulutegiko tumore-zelulekin alderatuta, NNMT edo AOX1 ia ez zela adierazten (3E irudia). Emaitza ustekabeko hauek adierazten dute MNA fibroblastoetatik edo tumoreetatik TME-ko ondoko T zeluletara jaria daitekeela.
Hautagaien artean 1etik 3ra bitarteko katioi organikoen garraiatzaileen familia (OCT1, OCT2 eta OCT3) daude, 22. garraiatzaile disolbagarriaren familiak (SLC22) (SLC22A1, SLC22A2 eta SLC22A3) kodetuta, baina MNAren garraiatzaile potentzialak oraindik zehaztu gabe daude (28). Emaile osasuntsuko T zelulaetatik lortutako mRNAren QPCR-ak SLC22A1-en adierazpen maila baxuak erakutsi zituen, baina SLC22A2-ren maila detektaezinak, eta horrek baieztatu zuen literaturan lehenago jakinarazi zela (3F irudia) (29). Aldiz, SK-OV-3 obulutegiko tumore-zelula lerroak bi garraiatzaileen maila altuak adierazi zituen (3F irudia).
Zelulek MNA arrotza xurgatzeko gaitasuna duten ala ez probatzeko, emaile osasuntsuetako T zelulak 72 orduz landu ziren MNA kontzentrazio desberdinetan. MNA exogenorik ezean, MNAren zelulen edukia ezin da detektatu (3G irudia). Hala ere, MNA exogenoarekin tratatutako T zelula aktibatuek zelulen MNA edukiaren dosi-menpeko igoera erakutsi zuten, 6 mM MNAraino (3G irudia). Emaitza honek adierazten du garraiatzaileen adierazpen maila baxua eta zelula barruko MNA metabolismoaz arduratzen den entzima nagusiaren falta izan arren, TILek oraindik ere MNA xurgatu dezakeela.
Pazienteen T zeluletako metabolitoen espektroak eta in vitro MNA xurgapen esperimentuek areagotzen dute minbiziarekin lotutako fibroblastoek (CAF) MNA jariatzeko aukera, eta tumore-zelulek TILen fenotipoa eta funtzioa erregulatu ditzakete. MNAk T zeluletan duen eragina zehazteko, emaile osasuntsuen T zelulak aktibatu ziren in vitro MNAren presentzian edo gabezian, eta haien ugalketa eta zitokinen ekoizpena ebaluatu ziren. MNA dosi altuenean gehitu eta 7 egun igaro ondoren, populazioaren bikoizketa kopurua neurriz murriztu zen, indarra mantendu zen dosi guztietan (4A irudia). Gainera, MNA exogenoaren tratamenduak tumoreen nekrosi faktorea-α (TNFα; 4B irudia) adierazten zuten CD4 + eta CD8 + T zelulen proportzioa handitu zuen. Aldiz, IFN-γ-ren ekoizpen intrazelularra nabarmen murriztu zen CD4 + T zeluletan, baina ez CD8 + T zeluletan, eta ez zen aldaketa esanguratsurik egon interleukina 2-n (IL-2; 4, C eta D irudia). Beraz, MNAz tratatutako T zelulen kultura hauen gainnadanteen entzima-lotutako immunosorbente-analisiak (ELISA) TNFα-ren igoera nabarmena, IFN-γ-ren jaitsiera eta IL-2-ren aldaketarik ez erakutsi zuen (4. irudia, E-tik G-ra). IFN-γ-ren jaitsierak adierazten du MNAk T zelulen tumoreen aurkako jarduera inhibitzen zeregina izan dezakeela. MNAk T zelulek eragindako zitotoxikotasunean duen eragina simulatzeko, proteina fluoreszente berdeak (GFP) (CAR-T) zelulak erregulatutako folato hartzailea duten antigeno kimerikoaren T (FRα-CAR-T) zelulak ekoizten dituzte emaile osasuntsuetako odol periferikoko mononuklear-zelulek (PBMC). CAR-T zelulak 24 orduz landu ziren MNAren aurrean, eta ondoren, folato hartzailea α adierazten duten SK-OV-3 obulutegiko tumore-zelulekin batera landu ziren, 10:1eko efektore-helburu erlazioan. MNA tratamenduak FRα-CAR-T zelulen hiltze-jardueran beherakada nabarmena eragin zuen, adenosinarekin tratatutako FRα-CAR-T zelulen antzekoa (4H irudia).
(A) Zelula bideragarrien kopuru osoa eta populazioaren bikoizketa (PD) zuzenean kulturatik 7. egunean. Barra-grafikoak sei emaile osasuntsuren batez bestekoa + SEM adierazten du. Gutxienez n = 3 esperimentu independenteren datuak adierazten ditu. (B-tik D-ra) CD3/CD28 eta IL-2 erabili ziren T zelulak aktibatzeko beren MNA kontzentrazioetan 7 egunez. Analisia egin aurretik, zelulak PMA/ionomicinarekin estimulatu ziren GolgiStop-ekin 4 orduz. TNFα (B) adierazpena T zeluletan. Zelula bizidunetan TNFα adierazpenaren adibide-irudia (ezkerrean) eta datu tabularrak (eskuinean). IFN-γ (C) eta IL-2 (D) adierazpena T zeluletan. Zitokinen adierazpena fluxu-zitometriaren bidez neurtu zen. Barra-grafikoak batez bestekoa (n = 6 emaile osasuntsu) + SEM adierazten du. Erabili bariantzaren analisi unidirekzionala eta neurri errepikatuak (*P<0,05 eta **P<0,01) P balioa zehazteko. Gutxienez n = 3 esperimentu independenteren datuak adierazten ditu. (E-tik G-ra) CD3/CD28 eta IL-2 erabili ziren T zelulak aktibatzeko beren MNA kontzentrazioetan 7 egunez. Ingurunea PMA/ionomizina estimulazioaren 4 ordu aurretik eta ondoren bildu zen. TNFα (E), IFN-γ (F) eta IL-2 (G) kontzentrazioak ELISA bidez neurtu ziren. Barra-grafikoak batez bestekoa (n = 5 emaile osasuntsu) + SEM adierazten du. P balioa bariantzaren analisi unidirekzionala eta neurketa errepikatuak erabiliz zehaztu zen (*P<0,05). Lerro puntuatuak detekzio-muga adierazten du. (H) Zelulen lisi-saiakuntza. FRα-CAR-T edo GFP-CAR-T zelulak adenosinaz (250 μM) edo MNAz (10 mM) egokitu ziren 24 orduz, edo tratatu gabe utzi ziren (Ctrl). SK-OV-3 zelulen hilketa-ehunekoa neurtu zen. P balioa Welch t testaren bidez zehaztu zen (*P<0,5 eta **P<0,01).
MNAren menpeko TNFα espresioaren erregulazioaren mekanismoa ulertzeko, MNArekin tratatutako T zelulen TNFα mRNAren aldaketak ebaluatu ziren (5A irudia). MNArekin tratatutako T zelula emaile osasuntsuek TNFα transkripzio mailen bikoitzeko igoera erakutsi zuten, eta horrek adierazten du MNA TNFα transkripzio erregulazioaren menpe dagoela. Erregulazio mekanismo posible hau ikertzeko, TNFα erregulatzen duten bi transkripzio faktore ezagun, hots, T zelulen faktore nuklear aktibatua (NFAT) eta 1 proteina espezifikoa (Sp1), ebaluatu ziren MNA TNFα sustatzaile proximalera lotzearen erantzun gisa (30). TNFα sustatzaileak 6 NFAT lotura gune identifikatu eta 2 Sp1 lotura gune ditu, gune batean gainjarrita [-55 base pare (bp) 5' txapeletik] (30). Kromatinaren immunoprezipitazioak (ChIP) erakutsi zuen MNArekin tratatzean, Sp1-en TNFα sustatzailera lotzea hirukoiztu egiten zela. NFAT-en inkorporazioa ere handitu eta garrantzia hartu zuen (5B irudia). Datu hauek adierazten dute MNAk TNFα-ren adierazpena Sp1 transkripzioaren bidez erregulatzen duela, eta neurri txikiagoan NFAT-ren adierazpena.
(A) MNArik gabeko landutako T zelulekin alderatuta, MNArekin tratatutako T zeluletan TNFα espresioaren aldaketa. SEM bidezko espresio-eredua erakusten da (n = 5 emaile osasuntsu). Gutxienez n = 3 esperimentu independentetako datuak adierazten ditu. (B) NFAT eta Sp1 (Ctrl) eta PMA/ionomizina estimulazioarekin 4 orduz konbinatu ondoren 8 mM MNArekin edo gabe tratatutako T zelulen TNFα sustatzailea. Immunoglobulina G (IgG) eta H3 erabili ziren immunoprezipitaziorako kontrol negatibo eta positibo gisa, hurrenez hurren. ChIP-aren kuantifikazioak erakutsi zuen Sp1 eta NFAT-en TNFα sustatzailearekiko lotura hainbat aldiz handitu zela MNArekin tratatutako zeluletan kontrolarekin alderatuta. Gutxienez n = 3 esperimentu independentetako datuak adierazten ditu. P balioa hainbat t-proba bidez zehaztuta (*** P <0,01). (C) HGSC-ren aszitisarekin alderatuta, T zelulek (zitotoxiko ez direnek) TNF espresio handiagoa erakutsi zuten tumorean. Koloreek paziente desberdinak adierazten dituzte. Erakutsitako zelulak ausaz 300era lagindu eta dardarka jarri dira gehiegizko tirada mugatzeko (** Padj = 0.0076). (D) Obulutegiko minbiziaren MNAren proposatutako eredua. MNA tumore-zeluletan eta fibroblastoetan sortzen da TMEn eta T zelulek xurgatzen dute. MNAk Sp1-aren TNFα sustatzailearekiko lotura handitzen du, eta horrek TNFα transkripzioa eta TNFα zitokinen ekoizpena handitzea dakar. MNAk IFN-γ gutxitzea ere eragiten du. T zelulen funtzioa inhibitzeak hiltzeko gaitasuna murriztea eta tumorearen hazkundea bizkortzea dakar.
Txostenen arabera, TNFα-k aurrealdeko eta atzeko menpeko antitumoralak eta tumorearen aurkako efektuak ditu, baina obulutegiko minbiziaren hazkuntza eta metastasia sustatzeko zeregin ezaguna du (31-33). Txostenen arabera, obulutegiko minbizia duten pazienteen TNFα-ren kontzentrazioa aszitisetan eta tumore-ehunetan ehun onberetan baino handiagoa da (34-36). Mekanismoari dagokionez, TNFα-k globulu zurien aktibazioa, funtzioa eta ugalketa erregulatu ditzake, eta minbizi-zelulen fenotipoa alda dezake (37, 38). Emaitza hauekin bat etorriz, geneen espresio diferentzialaren analisiak erakutsi zuen TNF nabarmen gorago erregulatuta zegoela tumore-ehunetako T zeluletan aszitisekin alderatuta (5C irudia). TNF espresioaren igoera fenotipo ez-zitotoxikoa zuten T zelulen populazioetan bakarrik izan zen agerikoa (S5A irudia). Laburbilduz, datu hauek MNA-k efektu immunosupresore eta tumore-sustatzaile bikoitzak dituela dioen ikuspegia babesten dute.
Zitometria bidezko fluxuan oinarritutako markaketa fluoreszentea bihurtu da TIL metabolismoa aztertzeko metodo nagusia. Ikerketa hauek erakutsi dute odoleko linfozito periferikoekin edo bigarren mailako organo linfoideetako T zelulekin alderatuta, sagu eta gizakien TILek glukosa xurgatzeko joera handiagoa dutela (4, 39) eta funtzio mitokondrialaren galera mailakatua (19, 40). Ikerketa honetan antzeko emaitzak ikusi ditugun arren, garapen nagusia tumore-zelulen metabolismoa eta tumore-ehun erresekzionatu bereko TILak alderatzea da. Aurreko txosten horietako batzuekin bat etorriz, aszita eta tumoreetako tumore-zelulek (CD45-EpCAM +) glukosa xurgapen handiagoa dute CD8 + eta CD4 + T zelulek baino, eta horrek tumore-zelulen glukosa xurgapen handia T zelulekin alderatu daitekeela baieztatzen du. T zelulen lehiaren kontzeptua. TME. Hala ere, tumore-zelulen jarduera mitokondriala CD8 + T zelulena baino handiagoa da, baina jarduera mitokondriala CD4 + T zelulenaren antzekoa da. Emaitza hauek metabolismo oxidatiboa tumore-zelulentzat garrantzitsua dela dioen gai berria indartzen dute (41, 42). Halaber, iradokitzen dute CD8 + T zelulak CD4 + T zelulek baino oxidazio-disfuntzioarekiko sentikorragoak izan daitezkeela, edo CD4 + T zelulek glukosa ez diren beste karbono-iturriak erabil ditzaketela mitokondrioen jarduera mantentzeko (43, 44). Kontuan izan behar da ez dugula glukosaren xurgapenean edo mitokondrioen jardueran alderik ikusi aszitisetan CD4 + T efektoreen, T efektoreen memoriaren eta T memoria zentraleko zelulen artean. Era berean, tumoreetako CD8 + T zelulen bereizketa-egoerak ez du zerikusirik glukosaren xurgapenean izandako aldaketekin, in vitro landutako T zelulen eta in vivo gizakien TILen arteko alde nabarmena azpimarratuz (22). Behaketa hauek zelula-populazioen esleipen automatiko inpartziala erabiliz ere berretsi ziren, eta horrek are gehiago agerian utzi zuen tumore-zelulek baino glukosaren xurgapen eta mitokondrioen jarduera handiagoa duten CD45 + / CD3- / CD4 + / CD45RO + zelulak nagusi direla, baina zelula-populazio metaboliko aktiboa dutela. Populazio honek scRNA-seq analisian identifikatutako mieloide-zapaltzaileen edo zelula dendritiko plasmazitoideen ustezko azpipopulazioa ordezka dezake. Biak gizakien obulutegiko tumoreetan jakinarazi diren arren [45], oraindik lan gehiago behar da mieloide azpipopulazio hau deskribatzeko.
Fluxu-zitometrian oinarritutako metodoek zelula moten arteko glukosaren eta oxidazio-metabolismoaren arteko desberdintasun orokorrak argitu ditzaketen arren, glukosak edo beste karbono-iturri batzuek TME-n mitokondrioen metabolismorako sortutako metabolito zehatzak ez dira oraindik zehaztu. Metabolitoen presentzia edo gabezia TIL azpimultzo jakin bati esleitzeko, zelula-populazioa ebakitako ehunetik araztea beharrezkoa da. Beraz, gure zelula-aberaste-metodoak, masa-espektrometriarekin konbinatuta, T zeluletan eta tumore-zelulen populazioetan modu desberdinean aberasten diren metabolitoei buruzko informazioa eman dezake, pazienteen lagin parekatuetan. Metodo honek fluoreszentziaz aktibatutako zelula-sailkapenarekiko abantailak baditu ere, metabolito-liburutegi batzuk kaltetuak izan daitezke berezko egonkortasunagatik eta/edo birsorkuntza-tasa azkarragatik (22). Hala ere, gure metodoak bi metabolito immunosupresore ezagun identifikatu ahal izan zituen, adenosina eta kinurenina, lagin moten artean asko aldatzen direlako.
Tumoreen eta TIL azpimoten gure analisi metabonomikoak obulutegiko TME-n metabolitoen eginkizunari buruzko informazio gehiago ematen du. Lehenik eta behin, fluxu-zitometria erabiliz, zehaztu genuen ez zegoela desberdintasunik tumoreen eta CD4 + T zelulen artean mitokondrioen jardueran. Hala ere, LC-MS/MS analisiak metabolitoen ugaritasunean aldaketa esanguratsuak agerian utzi zituen populazio horien artean, eta horrek adierazten du TIL metabolismoari eta bere jarduera metaboliko orokorrari buruzko ondorioek interpretazio zaindua behar dutela. Bigarrenik, MNA da CD45 zelulen eta T zelulen artean desberdintasun handiena duen metabolitoa asziteetan, ez tumoreetan. Beraz, konpartimentazioak eta tumorearen kokapenak eragin desberdinak izan ditzakete TIL metabolismoan, eta horrek mikroingurune jakin batean heterogeneotasun posiblea nabarmentzen du. Hirugarrenik, MNA ekoizten duen NNMT entzimaren adierazpena batez ere CAF-ra mugatzen da, hau da, tumore-zelulak neurri txikiagoan, baina MNA maila detektagarriak ikusten dira tumoreetatik eratorritako T zeluletan. NNMT-ren gehiegizko adierazpenak obulutegiko CAF-n minbizia sustatzeko efektu ezaguna du, neurri batean CAF metabolismoa, tumoreen inbasioa eta metastasia sustatzeagatik (27). TIL maila orokorra moderatua den arren, NNMTren adierazpena CAFn oso lotuta dago Cancer Genome Atlas (TCGA) azpimota mesenkimalarekin, eta hori pronostiko txarrarekin lotuta dago (27, 46, 47). Azkenik, MNAren degradazioaz arduratzen den AOX1 entzimaren adierazpena ere CAF populaziora mugatzen da, eta horrek adierazten du T zelulek ez dutela MNA metabolizatzeko gaitasunik. Emaitza hauek ideia hau babesten dute: aurkikuntza hau egiaztatzeko lan gehiago behar den arren, T zeluletan MNA maila altuek CAF mikroingurune immunosupresore baten presentzia adieraz dezaketela.
MNA garraiatzaileen adierazpen maila baxua eta MNA metabolismoan parte hartzen duten proteina gakoen mailak detektatu ezin direnez, MNAren presentzia T zeluletan ez da ustekabekoa. Ez NNMT ez AOX1 ezin izan dira detektatu scRNA-seq analisi eta bi kohorte independenteren qPCR bidez. Emaitza hauek adierazten dute MNA ez dutela T zelulek sintetizatzen, baizik eta inguruko TMEtik xurgatzen dutela. In vitro esperimentuek erakusten dute T zelulek kanpoko MNA metatzeko joera dutela.
Gure in vitro ikerketek erakutsi dute MNA exogenoak TNFα-ren adierazpena eragiten duela T zeluletan eta Sp1-en TNFα sustatzailearekiko lotura hobetzen duela. TNFα-k tumoreen aurkako eta tumoreen aurkako funtzioak baditu ere, obulutegiko minbizian, TNFα-k obulutegiko minbiziaren hazkundea sustatu dezake (31-33). TNFα-ren neutralizazioak obulutegiko tumore-zelulen kulturan edo TNFα seinalea ezabatzeak sagu-ereduetan TNFα-k eragindako hanturazko zitokinen ekoizpena hobetu eta tumorearen hazkundea inhibi dezake (32, 35). Beraz, kasu honetan, TME-tik eratorritako MNA-k hanturazko metabolito gisa joka dezake TNFα-ren menpeko mekanismo baten bidez, begizta autokrinoaren bidez, eta horrela obulutegiko minbiziaren agerpena eta hedapena sustatu (31). Aukera honetan oinarrituta, TNFα blokeoa aztertzen ari da obulutegiko minbiziaren aurkako agente terapeutiko potentzial gisa (37, 48, 49). Gainera, MNA-k CAR-T zelulen zitotoxikotasuna kaltetzen du obulutegiko tumore-zelulen aurrean, MNA-k eragindako immunitate-zapalkuntzaren froga gehiago emanez. Emaitza hauek, oro har, tumoreek eta CAF zelulek MNA zelulaz kanpoko TMEra jariatzen duten eredu bat iradokitzen dute. (i) TNFk eragindako obulutegiko minbiziaren hazkuntza-estimulazioaren eta (ii) MNAk eragindako T zelulen jarduera zitotoxikoaren inhibizioaren bidez, honek tumore-efektu bikoitza izan dezake (5D irudia).
Ondorioz, zelula-aberaste azkarraren, zelula bakarreko sekuentziazioaren eta profilazio metabolikoaren konbinazio bat aplikatuz, ikerketa honek HGSC gaixoen tumoreen eta aszitis zelulen arteko immunometabolomikoki desberdintasun handiak agerian utzi zituen. Analisi integral honek erakutsi zuen glukosa-xurgapenean eta mitokondrioen jardueran desberdintasunak daudela T zelulen artean, eta MNA identifikatu zuen zelulaz kanpoko metabolito immune erregulatzaile autonomo gisa. Datu hauek eragina dute TMEk T zelulen metabolismoan nola eragiten duen gizakien minbizietan. T zelulen eta minbizi-zelulen arteko mantenugaien lehia zuzena jakinarazi den arren, metabolitoek zeharkako erregulatzaile gisa ere jardun dezakete tumoreen progresioa sustatzeko eta, agian, erantzun immune endogenoak kentzeko. Metabolito erregulatzaile hauen funtzio-eginkizunaren deskribapen gehiagok estrategia alternatiboak ireki ditzake tumoreen aurkako erantzun immunea hobetzeko.
Pazienteen laginak eta datu klinikoak Kanadako Ehunen Gordailu Sareak ziurtatutako BC minbiziaren tumore-ehunen biltegiaren bidez lortu ziren. BC Minbiziaren Ikerketa Etika Batzordeak eta British Columbia Unibertsitateak onartutako protokoloaren arabera (H07-00463), paziente guztien lagin eta datu klinikoek idatzizko baimen informatua lortu zuten edo formalki uko egin zioten baimenari. Laginak BioBank ziurtatuan gordetzen dira (BRC-00290). Pazienteen ezaugarri zehatzak S1 eta S5 tauletan ageri dira. Kriokontserbaziorako, bisturi bat erabiltzen da pazientearen tumore-lagina mekanikoki deskonposatzeko eta ondoren 100 mikrako iragazki batetik bultzatzeko zelula bakarreko suspentsioa lortzeko. Pazientearen aszitisa 1500 rpm-tan zentrifugatu zen 10 minutuz 4 °C-tan zelulak pellet egiteko eta gainnadantea kentzeko. Tumore eta aszitisetatik lortutako zelulak % 50eko bero-inaktibatutako giza AB serumean (Sigma-Aldrich), % 40ko RPMI-1640an (Thermo Fisher Scientific) eta % 10eko dimetil sulfoxidoan kriokontserbatu ziren. Zelula bakarreko suspentsio kontserbatu hauek desizoztu eta metabolomikan eta metabolitoen determinaziorako erabili ziren, behean deskribatutako moduan.
Ingurune osoa 0,22 μm-ko iragazkidun 50:50eko RPMI 1640z osatuta dago: AimV. RPMI 1640 + 2,05 mM l-glutamina (Thermo Fisher Scientific) % 10eko bero-inaktibatutako AB giza serumarekin (Sigma-Aldrich), 12,5 mM Hepes (Thermo Fisher Scientific), 2 mM l-glutamina (Thermo Fisher Scientific) Fisher Scientific), 1 x Penizilina Estreptomicina (PenStrep) disoluzioarekin (Thermo Fisher Scientific) eta 50 μMB-merkaptoetanolarekin osatuta dago. AimV (Invitrogen) 20 mM Hepes (Thermo Fisher Scientific) eta 2 mM l-glutaminarekin (Thermo Fisher Scientific) osatuta dago. Fluxu-zitometroaren tindaketa-bufferra 0,22 μm-ko iragazkidun fosfato-bufferdun gatz-disoluzioz (PBS; Invitrogen) % 3ko bero-inaktibatutako AB giza serumarekin (Sigma) osatuta dago. Zelulen aberaste-bufferra 0,22 μm-ko PBS iragazkiaz osatuta dago eta % 0,5eko bero-inaktibatutako giza AB serumarekin (Sigma-Aldrich) osatuta dago.
37 °C-ko ingurune osoan, zelulak 10 nM MT DR eta 100 μM 2-NBDG-rekin tindatu ziren 30 minutuz. Ondoren, zelulak eF506 bideragarritasun koloratzailearekin tindatu ziren 4 °C-tan 15 minutuz. Zelulak berriro eseki FC Block-ean (eBioscience) eta Brilliant Stain Buffer-ean (BD Biosciences), fluxu zitometroaren tindaketa bufferrean diluitu (fabrikatzailearen argibideen arabera) eta inkubatu 10 minutuz giro-tenperaturan. Zelulak antigorputz multzo batekin tindatu (S2 taula) fluxu zitometria tindaketa bufferrean 4 °C-tan 20 minutuz. Zelulak berriro eseki fluxu zitometria tindaketa bufferrean (Cytek Aurora; 3L-16V-14B-8R konfigurazioa) analisia egin aurretik. Erabili SpectroFlo eta FlowJo V10 zelulen zenbaketa datuak aztertzeko, eta erabili GraphPad Prism 8 datuak sortzeko. 2-NBDG eta MT DR-ren fluoreszentzia-intentsitate mediana (MFI) log-normalizatu zen, eta ondoren, t proba parekatua erabili zen analisi estatistikorako, paziente parekatutakoak kontuan hartzeko. Kendu 40 gertaera baino gutxiago dituzten populazio guztiak analisitik; sartu 1eko MFI balioa balio negatiboetarako analisi estatistikoa eta datuen bistaratzea egin aurretik.
Goiko prozesu-panelaren eskuzko ate-estrategia osatzeko, forma-murrizketa zuhaitzaren (FAUST) (21) anotazio osoa erabili dugu zelulak populazioari automatikoki esleitzeko, FlowJo-n zelula hilak ezabatu ondoren. Irteera eskuz kudeatzen dugu gaizki esleituta dauden populazioak (PD1+ PD1-tumore-zelulekin konbinatuz) eta atxikitako populazioak batzeko. Lagin bakoitzak batez beste % 2 baino gehiagoko zelulak ditu, guztira 11 populazio lortzeko.
Ficoll gradiente dentsitate-zentrifugazioa erabili zen PBMC leukozitoen bereizketa-produktuetatik bereizteko (STEMCELL Technologies). CD8 + T zelulak PBMCtik isolatu ziren CD8 MicroBeads (Miltenyi) erabiliz eta ingurune osoan hedatu ziren TransAct (Miltenyi) erabiliz 2 astez fabrikatzailearen argibideen arabera. Zelulak 5 egunez utzi ziren IL-7 (10 ng/ml; PeproTech) zuen ingurune osoan, eta ondoren TransAct-ekin berriro estimulatu ziren. 7. egunean, fabrikatzailearen argibideen arabera, giza CD45 MicroBeads (Miltenyi) erabili ziren zelulak aberasteko hiru txanda jarraian. Zelulak zatitu ziren fluxu-zitometria bidezko analisietarako (goian deskribatu bezala), eta milioi bat zelula hiru aldiz zatitu ziren LC-MS/MS analisietarako. Laginak LC-MS/MS bidez prozesatu ziren behean deskribatu bezala. Metabolito faltaren balioa kalkulatu genuen 1.000 ioi-zenbaki batekin. Lagin bakoitza ioi kopuru osoaren (TIC) bidez normalizatzen da, logaritmikoki bihurtzen da eta automatikoki normalizatzen da MetaboAnalystR-en analisia egin aurretik.
Paziente bakoitzaren zelula-suspentsioa desizoztu eta 40 μm-ko iragazki batetik iragazi zen ingurune osora iritsi arte (goian deskribatu bezala). Fabrikatzailearen protokoloaren arabera, hiru txanda jarraian hautaketa positiboa egin zen MicroBeads (Miltenyi) erabiliz, ale magnetikoen bereizketa bidez, laginak CD8+, CD4+ eta CD45- zeluletarako aberasteko (izotzean). Laburbilduz, zelulak zelulak aberasteko bufferrean berriro esekitzen dira (goian deskribatu bezala) eta zenbatu egiten dira. Zelulak giza CD8 aleekin, giza CD4 aleekin edo giza CD45 aleekin (Miltenyi) inkubatu ziren 4 °C-tan 15 minutuz, eta ondoren zelulak aberasteko bufferrean garbitu ziren. Lagina LS zutabetik (Miltenyi) pasatzen da, eta frakzio positiboak eta negatiboak biltzen dira. Iraupena murrizteko eta zelulak berreskuratzeko urratsa maximizatzeko, CD8 frakzioa erabiltzen da CD4+ aberasteko bigarren txandarako, eta CD4 frakzioa ondorengo CD45 aberasteko. Mantendu disoluzioa izotzean bereizketa prozesu osoan zehar.
Metabolitoen analisirako laginak prestatzeko, zelulak behin garbitu ziren izotzez hoztutako gatz-disoluzio batekin, eta % 80ko metanol 1 ml gehitu zitzaien lagin bakoitzari, ondoren zurrunbiloan irabiatu eta nitrogeno likidoan izoztu ziren. Laginak hiru izozte-desizozte ziklotan jarri ziren eta 14.000 rpm-tan zentrifugatu ziren 15 minutuz 4 °C-tan. Metabolitoak dituen gainnadantea lurrundu zen lehortu arte. Metabolitoak % 0,03ko azido formiko 50 μl-tan berriro disolbatu ziren, nahasteko zurrunbiloan irabiatu ziren eta ondoren hondakinak kentzeko zentrifugatu ziren.
Goian deskribatutako moduan erauzi metabolitoak. Gainjarioa metabolomika ikerketarako errendimendu handiko kromatografia likidozko botila batera eraman. Erabili ausazko tratamendu-protokolo bat lagin bakoitza zelula kopuru berdinarekin tratatzeko, multzo-efektuak saihesteko. AB SCIEX QTRAP 5500 Hirukoitzeko Kuadrupolo Masa Espektrometroan (50) lehenago argitaratutako metabolito globalen ebaluazio kualitatiboa egin genuen. Kromatografia-analisia eta gailur-azaleraren integrazioa MultiQuant 2.1 bertsioko softwarea erabiliz egin ziren (Applied Biosystems SCIEX).
1000 ioi-kopurua erabili zen metabolito faltaren balioa kalkulatzeko, eta lagin bakoitzaren TIC erabili zen detektatutako metabolito bakoitzaren gailur-eremu normalizatua kalkulatzeko, laginen prozesamendutik sortutako analisi instrumentalak sartutako aldaketak zuzentzeko. TIC normalizatu ondoren, MetaboAnalystR(51) (parametro lehenetsia) erabiltzen da bihurketa logaritmikoa eta norma-lerroen eskalatze automatikoa egiteko. PCA erabili genuen R pakete beganoarekin lagin moten arteko metabolomen arteko desberdintasunen analisi esploratzailea egiteko, eta erredundantzia partzialeko analisia erabili genuen pazienteak aztertzeko. Ward metodoa erabili genuen bero-mapa dendrograma bat eraikitzeko laginen arteko distantzia euklidearra multzokatzeko. Limma (52) erabili genuen metabolitoen ugaritasun estandarizatuaren gainean zelula mota eta mikroingurune osoan zehar metabolito ugariak identifikatzeko. Azalpena sinplifikatzeko, taldearen batez besteko parametroa erabili genuen eredua zehazteko, eta mikroinguruneko zelula motak talde bakoitz gisa hartzen ditugu kontuan (n = 6 talde); esangura-probarako, hiru neurketa errepikatu egin genituen metabolito bakoitzerako. Erreplikazio faltsuak saihesteko, pazientea oztopo gisa sartu zen limma diseinuan. Paziente ezberdinen arteko metabolitoen arteko desberdintasunak egiaztatzeko, limma eredua egokitu genuen, pazienteak modu finko batean barne. Zelula motaren eta Padj <0.05 (Benjamini-Hochberg zuzenketa) mikroingurunearen arteko aurrez zehaztutako kontrastearen garrantzia erakusten dugu.
Miltenyi Dead Cell Removal Kit erabiliz indarra aberastu ondoren (>% 80ko bideragarritasuna), zelula bakarreko transkriptomaren sekuentziazioa egin zen aszita eta tumore-lagin izoztu bizi guztietan, 10x 5′ geneen espresio-protokolo bat erabiliz. Tumore eta aszita bat zetozen bost kasu aztertu ziren, nahiz eta tumore-lagin baten bideragarritasun baxuak hura sartzea eragotzi zuen. Pazienteen hautaketa anitz lortzeko, paziente bakoitzaren laginak 10x kromo kontrolatzailearen bideetan konbinatu genituen, eta aszita eta tumore-guneak bereizita aztertu genituen. Sekuentziazioaren ondoren [Illumina HiSeq 4000 28×98 bp paired end (PE), Quebec genoma; Zelula bakoitzeko 73.488 eta 41.378 irakurketarekin tumore eta aszitarako, hurrenez hurren]], CellSNP eta Vireo (53) erabili genituen (CellSNP-n oinarrituta, GRCh38-k emandako giza SNP arruntari (VCF) emaile-identitate bat esleitzen zaio. SNPRelate erabiltzen dugu pazientearen genotipo-egoeraren (IBS) identitate hurbilena (IBS) ondorioztatzeko, esleitu gabeko zelulak eta duplex gisa identifikatutako zelulak baztertuz eta aszita eta tumore laginen arteko emaileak parekatuz (54). Zeregin honetan oinarrituta, tumore eta aszitan zelula-ordezkaritza ugari zuten hiru kasu gorde genituen ondorengo analisietarako. Scater (55) eta scran (56) BioConductor paketean iragazketa masiboko urrats bat egin ondoren, 6975 zelula (tumore eta aszitatik 2792 eta 4183 zelula, hurrenez hurren) eman ziren analisietarako. igraph-en (57) Louvain multzokatzea erabili genuen kluster-zeluletarako Jaccard distantzian oinarrituta. adierazpena. Klusterrak eskuz anotatu ziren ustezko zelula motatara markatzaile geneen adierazpenean oinarrituta eta t-SNErekin bistaratu ziren. Zelula T zitoxikoak CD8A eta GZMAren adierazpenaren bidez definitzen dira, erribosoma proteinen adierazpen baxua duten azpiklusterrak baztertuta. Izar et al.-en argitaratutako datuak eskuratu genituen (16), t-SNE txertatzeak barne, zelula immuneen markatzaileen eta NNMT adierazpenaren arteko adierazpen gainjartzea kontrola dezakeena.
PBMCak leukozitoen bereizketa produktuetatik (STEMCELL Technologies) bereizi ziren Ficoll gradiente dentsitate zentrifugazio bidez. CD3 + zelulak PBMCetatik isolatu ziren CD3 aleak (Miltenyi) erabiliz. MNAren presentzian edo gabezian, CD3+ zelulak plakari lotutako CD3arekin (5 μg/ml), CD28 disolbagarriarekin (3 μg/ml) eta IL-2arekin (300 U/ml; Proleukin) aktibatu ziren. Hedapenaren azken egunean, bideragarritasuna (Fixable Viability Dye eFluor450, eBioscience) eta ugalketa (123count eBeads, Thermo Fisher Scientific) fluxu zitometria bidez ebaluatu ziren. Ebaluatu efektore-funtzioa zelulak PMArekin (20 ng/ml) eta ionomitzarekin (1μg/ml) GolgiStop-ekin 4 orduz estimulatuz, eta kontrolatu CD8-PerCP (RPA-T8, BioLegend), CD4-AF700 (RPA-T4), BioLegend) eta TNFα-fluoresceina isotiozianatoa (FITC) (MAb11, BD). Estimulatu qPCR eta ChIP zelulak PMArekin (20 ng/ml) eta ionomitzarekin (1μg/ml) 4 orduz. ELISA gainnadantea bildu zen PMArekin (20 ng/ml) eta ionomitzarekin (1 μg/ml) 4 orduz estimulatu aurretik eta ondoren.
Jarraitu fabrikatzailearen protokoloa RNA isolatzeko RNeasy Plus Mini Kit (QIAGEN) erabiliz. Erabili QIAshredder (QIAGEN) lagina homogeneizatzeko. Erabili gaitasun handiko RNA-ADNc kit-a (Thermo Fisher Scientific) DNA osagarria (ADNc) sintetizatzeko. Erabili TaqMan Rapid Advanced Master Mix (Thermo Fisher Scientific) geneen adierazpena kuantifikatzeko (fabrikatzailearen protokoloaren arabera) zunda hauekin: Hs00196287_m1 (NNMT), Hs00154079_m1 (AOX1), Hs00427552_m1 (SLC22A1), Hs02786624_g1 [glizeraldehido-3-fosfatoa hidrogenotik kanpo (GAPDH)] eta Hs01010726_m1 (SLC22A2). Laginak StepOnePlus denbora errealeko PCR sisteman (Applied Biosystems) (Applied Biosystems) exekutatu ziren, MicroAmp 96 putzuko erreakzio-plaka optiko azkarrean (Applied Biosystems) eta MicroAmp film optikoarekin. 35etik gorako edozein Ct balio detekzio-atalasearen gainetik dagoela uste da eta detektaezin gisa markatzen da.
Egin ChIP aurretik deskribatutako moduan (58). Laburbilduz, zelulak formaldehidoarekin tratatu ziren (azken kontzentrazioa % 1,42) eta giro-tenperaturan inkubatu ziren 10 minutuz. Erabili puzte-buffer osagarria (25 mM Hepes, 1,5 mM MgCl2, 10 mM KCl eta % 0,1 NP-40) izotzean 10 minutuz, eta ondoren berriro eseki immunoprezipitazio-bufferrean deskribatutako moduan (58). Ondoren, lagina sonikatu zen ziklo hauekin: 10 ziklo (20 pultsu 1 segundokoak) eta 40 segundoko denbora estatiko batekin. Inkubatu ChIP mailako immunoglobulina G (Cell Signaling Technology; 1 μl), histona H3 (Cell Signaling Technology; 3 μl), NFAT (Invitrogen; 3 μl) eta SP1 (Cell Signaling Technology; 3 μl) antigorputzak laginarekin 4 °CC-tan, astindu gau osoan. Inkubatu proteina A aleak (Thermo Fisher Scientific) laginarekin 4 °C-tan, astindu leun batekin ordubetez, ondoren erabili chelex aleak (Bio-Rad) DNA aberasteko, eta erabili proteinasa K (Thermo Fisher) proteinen digestiorako. TNFα sustatzailea PCR bidez detektatu zen: aurrera, GGG TAT CCT TGA TGC TTG TGT; aitzitik, GTG CCA ACA ACT GCC TTT ATA TG (207 bp-ko produktua). Irudiak Image Lab-ek (Bio-Rad) sortu zituen eta ImageJ softwarea erabiliz kuantifikatu ziren.
Zelula-kulturako gainnatzailea goian deskribatutako moduan bildu zen. Determinazioa gizakien TNFα ELISA kitaren (Invitrogen), gizakien IL-2 ELISA kitaren (Invitrogen) eta gizakien IFN-γ ELISA kitaren (Abcam) fabrikatzailearen prozeduren arabera egin zen. Fabrikatzailearen protokoloaren arabera, gainnatzailea 1:100ean diluitu zen TNFα eta IL-2 detektatzeko, eta 1:3an IFN-γ detektatzeko. Erabili EnVision 2104 Multilabel Reader (PerkinElmer) 450 nm-tan xurgapena neurtzeko.
PBMCak leukozitoen bereizketa produktuetatik (STEMCELL Technologies) bereizi ziren Ficoll gradiente dentsitate zentrifugazio bidez. CD3 + zelulak PBMCetatik isolatu ziren CD3 aleak (Miltenyi) erabiliz. MNAren presentzian edo gabezian, CD3+ zelulak plakari lotutako CD3arekin (5 μg/ml), CD28 disolbagarriarekin (3 μg/ml) eta IL-2arekin (300 U/ml; Proleukin) aktibatu ziren 3 egunez. 3 egun igaro ondoren, zelulak bildu eta % 0,9ko gatz-soluzioarekin garbitu ziren, eta pelleta izoztu egin zen. Zelulen zenbaketa fluxu-zitometria bidez egin zen (Cytek Aurora; 3L-16V-14B-8R konfigurazioa) 123ko eBeads erabiliz.
Goian deskribatutako moduan erauztu metabolitoak. Lehortutako erauzkinak 4000 zelula baliokide/μl-ko kontzentrazioan berreraiki ziren. Aztertu lagina alderantzizko faseko kromatografia bidez (1290 Infinity II, Agilent Technologies, Santa Clara, CA) eta CORTECS T3 zutabe bidez (2,1 × 150 mm, partikula tamaina 1,6 μm, poro tamaina 120 Å; #186008500, Waters). Espektrometro polarra (6470, Agilent), non elektroihinztaduraren ionizazioa modu positiboan funtzionatzen duen. A fase mugikorra % 0,1 azido formikoa da (H2O-tan), B fase mugikorra % 90 azetonitriloa eta % 0,1 azido formikoa. LC gradientea 0 eta 2 minutu artekoa da % 100eko A-rentzat, 2 eta 7,1 minutu artekoa % 99ko B-rentzat, eta 7,1 eta 8 minutu artekoa % 99ko B-rentzat. Ondoren, berriro orekatu zutabea A fase mugikorrarekin 0,6 ml/min-ko fluxu-abiaduran 3 minutuz. . Emari-abiadura 0,4 ml/min da, eta zutabe-ganbera 50 °C-ra berotzen da. Erabili MNAren estandar kimiko purua (M320995, Toronto Research Chemical Company, North York, Ontario, Kanada) atxikipen-denbora (RT) eta eraldaketa ezartzeko (RT = 0,882 minutu, 1. eraldaketa = 137→94,1, 2. eraldaketa = 137→92, 3. bihurketa = 137→78). Hiru trantsizioak atxikipen-denbora zuzenean gertatzen direnean, 1. trantsizioa erabiltzen da kuantifikaziorako, espezifikotasuna bermatzeko. MNAren (Toronto Research Chemical Company) kurba estandarra stock disoluzioaren (1 mg/ml) sei diluzio seriatuz sortu zen, 0,1, 1,0, 10 eta 100 ng/ml eta 1,0 eta 10 μg/ml likido estandarrak lortzeko, hurrenez hurren. Detekzio muga 1 ng/ml da, eta erantzun lineala 10 ng/ml eta 10 μg/ml artean dago. Laginaren eta estandarraren bi mikrolitroko injekzio bakoitza erabiltzen da LC/MS analisietarako, eta kalitate kontrol lagin mistoa egiten da zortzi injekziotik behin analisi plataformaren egonkortasuna bermatzeko. MNAz tratatutako zelula lagin guztien MNA erantzunak analisiaren tarte linealaren barruan zeuden. Datuen analisia MassHunter analisi kuantitatiboko softwarea (v9.0, Agilent) erabiliz egin zen.
Bigarren belaunaldiko αFR-CAR konstruktua Song et al.-engandik hartu zen (59). Laburbilduz, konstruktuak honako edukia dauka: CD8a lider sekuentzia, gizakiaren αFR-rekiko kate bakarreko aldagai zatia, CD8a gontza eta mintz-eskualdea, CD27 zelula barneko domeinua eta CD3z zelula barneko domeinua. CAR sekuentzia osoa GenScript-ek sintetizatu zuen, eta ondoren bigarren belaunaldiko lentibirusen adierazpen bektorean klonatu zen, transdukzio-eraginkortasuna ebaluatzeko erabilitako GFP adierazpen kasetetik gora.
Lentibirusa HEK293T zelulen transfektazioz sortzen da [American Type Culture Collection (ATCC); % 10eko behi-fetuaren seruma (FBS) eta % 1eko PenStrep dituen Dulbecco-ren Eagle ingurune aldatuan hazi da, eta CAR-GFP bektorea erabili da. Paketatze-plasmidoek (psPAX2 eta pMD2.G, Addgene) lipofekzio-amina erabiltzen dute (Sigma-Aldrich). Birusa zuen gainnadantea transfektuaren ondorengo 48 eta 72 orduetan bildu, iragazi eta ultrazentrifugazio bidez kontzentratu zen. Gorde birus-gainnadante kontzentratua -80 °C-tan transdukzioa egin arte.
PBMCak leukozito osasuntsuen bereizketa-produktuetatik (STEMCELL Technologies) bereizten dira Ficoll gradiente dentsitate-zentrifugazioaren bidez. Erabili CD8 mikroaleen hautaketa positiboa (Miltenyi) CD8+ zelulak PBMCetatik isolatzeko. Estimulatu T zelulak TransAct-ekin (Miltenyi) eta TexMACS ingurunean [Miltenyi; % 3ko bero-inaktibatutako giza serumarekin, % 1eko PenStrep-ekin eta IL-2-rekin osatua (300 U/ml)]. Estimulazioaren hogeita lau ordura, T zelulak lentibirusarekin transduzitu ziren (10 μl birus-gainjario kontzentratu 106 zelula bakoitzeko). Cytek Auroran transdukzioaren 1 eta 3 egun artean (FSC (Forward Scatter)/SSC (Side Scatter), Singlet, GFP+-n), ebaluatu zelulen GFP adierazpena gutxienez % 30eko transdukzio-eraginkortasuna frogatzeko.
CAR-T zelulak 24 orduz landu ziren Immunocult-en (STEMCELL Technologies; % 1eko PenStrep-ekin osatua) baldintza hauetan: tratatu gabe, 250 μM adenosina edo 10 mM MNA-rekin tratatuta. Aurretratamenduaren ondoren, CAR-T zelulak PBS-rekin garbitu eta 20.000 SK-OV-3 zelularekin konbinatu ziren [ATCC; McCoy 5A medioan (Sigma-Aldrich) % 10 FBS eta % 1 PenStrep-ekin osatua 10ean: Efektorearen eta jomugaren arteko 1eko erlazioa hirukoiztuta anplifikatu zen Immunocult medio osatuan. SK-OV-3 zelulak eta digitalis saponinarekin (0,5 mg/ml; Sigma-Aldrich) lisatutako SK-OV-3 zelulak erabili ziren kontrol negatibo eta positibo gisa, hurrenez hurren. 24 orduz batera hazi ondoren, gainnatzailea bildu eta laktato deshidrogenasa (LDH) fabrikatzailearen argibideen arabera neurtu zen (LDH Glo Cytotoxicity Assay Kit, Promega). LDH gainnatzailea 1:50ean diluitu zen LDH bufferrean. Hilketa-ehunekoa formula hau erabiliz neurtu zen: hilketa-ehunekoa = zuzenketaren ehunekoa / hilketa-tasa maximoa x % 100, non zuzenketaren ehunekoa = batera hazitako T zelulak bakarrik, eta hilketa-tasa maximoa = kontrol positiboa-kontrol negatiboa.
Testuan edo materialetan eta metodoetan azaltzen den bezala, erabili GraphPad Prism 8, Microsoft Excel edo R v3.6.0 analisi estatistikorako. Paziente beretik hainbat lagin biltzen badira (adibidez, aszita eta tumorea), t proba parekatua erabiltzen dugu edo pazientea efektu ausazko gisa sartzen dugu eredu lineal edo orokortu batean, dagokion moduan. Metabolomikaren analisirako, garrantzi-proba hirukoiztuta egiten da.
Artikulu honetarako material osagarriak lortzeko, ikus http://advances.sciencemag.org/cgi/content/full/7/4/eabe1174/DC1
Artikulu hau Creative Commons Aitortu-EzKomertziala Lizentziaren baldintzen arabera banatzen da, eta edozein euskarritan erabiltzea, banatzea eta erreproduzitzea baimentzen du, betiere azken erabilera ez bada irabazi komertzialik lortzeko eta jatorrizko lana zuzena dela bada premisa. Erreferentzia.
Oharra: Zure helbide elektronikoa ematea baino ez dizugu eskatzen, orrialdera gomendatzen duzun pertsonak mezu elektronikoa ikustea nahi duzula eta spam-a ez dela jakin dezan. Ez dugu helbide elektronikorik hartuko.
Galdera hau bisitaria zaren ala ez egiaztatzeko eta spam bidalketa automatikoa saihesteko erabiltzen da.
Marisa K. Kilgour (Marisa K. Kilgour), Sarah MacPherson (Sarah MacPherson), Lauren G. Zacharias (Lauren G. Zacharias), Abigail Eli Aris G. Watson (H. Watson), John Stagg (John Stagg), Brad H. Nelson (Brad H. Nelson), Ralph J. De Bellardini (Ralph J. Russell DeRussell), Ralph J. De Bellardini (Ralph) G. Jones), Phineas T. Hamilton (Phineas T.
MNAk T zelulen immunitate-zapalkuntzan laguntzen du eta gizakien minbizia tratatzeko immunoterapia-jomuga potentziala da.
Marisa K. Kilgour (Marisa K. Kilgour), Sarah MacPherson (Sarah MacPherson), Lauren G. Zacharias (Lauren G. Zacharias), Abigail Eli Aris G. Watson (H. Watson), John Stagg (John Stagg), Brad H. Nelson (Brad H. Nelson), Ralph J. De Bellardini (Ralph J. Russell DeRussell), Ralph J. De Bellardini (Ralph) G. Jones), Phineas T. Hamilton (Phineas T.
MNAk T zelulen immunitate-zapalkuntzan laguntzen du eta gizakien minbizia tratatzeko immunoterapia-jomuga potentziala da.
©2021 Zientziaren Aurrerapenerako Amerikako Elkartea. eskubide guztiak erreserbatuta. AAAS HINARI, AGORA, OARE, CHORUS, CLOCKSS, CrossRef eta COUNTER-en bazkidea da. ScienceAdvances ISSN 2375-2548.